Een dunne-schedel Window Techniek voor chronische Twee-foton In vivo Imaging Murine Microglia in modellen van ontstekingsprocessen

Samenvatting

We beschrijven een methode voor het herhaaldelijk het visualiseren van muriene microglia en circulerende monocyten In vivo Meer dan uren, dagen of weken met behulp van transcraniële twee-foton microscopie. We laten zien hoe je een verdunde-schedel venster dat intermitterende observatie van latente microglia die kunnen worden geactiveerd door aangrenzende stereotactische injectie van de HIV-1 regulatie-eiwit Tat mogelijk voor te bereiden.

Samenvatting

Traditioneel in de neurowetenschappen, in vivo twee foton beeldvorming van de muizen centrale zenuwstelsel heeft of betrokken het gebruik van open-schedel ^1,2 of verdund-schedel ^drie preparaten. Terwijl de open schedel techniek is zeer veelzijdig, is het niet optimaal is voor het bestuderen van microglia want het is invasief en kan leiden tot microgliale activatie. Hoewel de verdunde-schedel aanpak is minimaal invasief, de herhaalde re-dunner worden van de schedel die nodig zijn voor chronische beeldvorming verhoogt het risico van weefselbeschadiging en microglia activatie en zorgt voor een beperkt aantal van beeldvorming sessies. Hier presenteren wij een chronische dunne-schedel venster methode voor de controle muizen microglia in vivo over een langere periode van tijd met behulp van twee-foton microscopie. We laten zien hoe je een stabiel, toegankelijk, verdunde-schedel corticale venster (TSCW) te bereiden met een apposed glazen dekglaasje dat blijft doorschijnend in de loop van drie weken onderbroken observatie. Dit TSCW voorbereiding is veel meer immunologisch inert met betrekking tot de microglia activatie dan open craniotomie of herhaalde schedel dunner en kan een willekeurig aantal beeldvorming sessies gedurende een periode van weken. We bereiden TSCW in CX ₃ CR _een GFP / + muizen ⁴ tot en met microglia visualiseren met verbeterde groen fluorescerend eiwit tot ≤ 150 um onder de pial oppervlakte. We tonen ook aan dat deze voorbereiding kan worden gebruikt in combinatie met stereotactische hersenen injecties van de HIV-1 neurotoxische eiwit Tat, grenzend aan de TSCW, die in staat is om duurzaam microgliosis. Daarom is deze methode uitermate geschikt voor de behandeling van veranderingen in de microgliacellen morfologie en beweeglijkheid loop van de tijd in het levende brein in modellen van HIV-geassocieerde Neurocognitieve Disorder (HAND) en andere neurodegeneratieve ziekten met een neuro-inflammatoire component.

Protocol

1. De voorbereiding van de Animal for Imaging

1. In onze experimenten gebruiken we volwassen CX ₃ CR ₁ GFP / + muizen die uitdrukken GFP in mononucleaire cellijnen, inclusief microglia. ^Vier verschillende stammen van muizen kan gebruikt worden om de behoeften van een specifiek project te voldoen.
2. Verdoven van de muis met een intraperitoneale injectie van een cocktail bestaande uit drie drug van 0,05 mg / kg Fentanyl, 5,0 mg / kg Midazolam, en 0,5 mg / kg Medetomidine. ⁵ Chirurgische voorbereiding voor TSCW begint nadat het dier niet meer reageert op pijnprikkels, zoals als een staart knijpen. Gedurende de operatie en beeldvorming, houden we het dier op een verwarmingselement om post-anesthesie onderkoeling te voorkomen. Indien nodig, een booster dosis van een derde van de oorspronkelijke dosering van de narcose cocktail kan worden gegeven aan de oorspronkelijke verdoving vliegtuig te herstellen.
3. Cover van het dier ogen met een beschermende oogzalf om de ogen vochtig te houden tijdens de anesthesie, die onderdrukt het dier knipperen reflex. Verwijder het haar van de hoofdhuid van het dier met behulp van een scheermes, schaar, schaar, of chemische methoden. Ontsmet de hoofdhuid met behulp van een 10% povidon-jodium-oplossing en 70% ethanol. Alle chirurgische instrumenten dienen te worden geautoclaveerd, gesteriliseerd met een glazen kraal sterilisator, of gedesinfecteerd met 70% ethanol.
4. Maak een middellijn incisie van de hoofdhuid met behulp van kleine schaar, te beginnen 4-5 mm caudaal van de schedel en het bevorderen van uit naar de voorkant van de ogen. Het is belangrijk dat deze incisie lang genoeg dat de huid niet zal interfereren met de verlijming van het hoofd plaat die is om de muis hoofd te stabiliseren gebruikt tijdens de twee-foton beeldvorming (figuur 1). Identificeer het gebied dat moet worden uitgedund onder een dissectie scope. Vermijd gebieden die van belang direct gelegen boven schedelnaden, zoals de schedel is minder stabiel in deze gebieden en de onderliggende grote schepen en de hersenvliezen zal interfereren met beeldvorming.
5. Breng 100% ethanol, gevolgd door 10% oplossing van ijzerchloride met een steriel wattenstaafje om de membranen drogen op de top van de schedel en de weg te schrapen ze met behulp van fijne pincet of een scheermesje. Als de vliezen te verwijderen resulteert in onstabiele hoofd plaat bevestiging.
6. Leg een dun laagje van de Permabond 910 lijm langs de randen van het venster onder de kop plaat. Plaats de kop plaat bekleed met lijm over het gebied van de rente op de schedel van het dier met lichte druk (figuur 1). Het is belangrijk dat het hoofd plaat alleen is gelijmd op het bot van de schedel. Elke huid of membranen die gevangen zitten tussen de kop plaat en de schedel vermindert de stabiliteit van de obligatie. Breng een kleine hoeveelheid van acrylaat rond het kijkvenster met een injectiespuit om direct binding van de lijm. Tot slot, een kleine hoeveelheid van Loctite 454 aan de randen van het venster om lekken te voorkomen.
7. Schroef de kop plaat om het dier houder (figuur 1) en controleer de stabiliteit van het hoofd plaat onder een dissectie werkingssfeer door licht sonderen met een pincet. Er mag geen beweging van de schedel ten opzichte van de hoofd plaat worden. Breng een druppel zoutoplossing op het kijkvenster om ervoor te zorgen dat er geen lekken.

2. De voorbereiding van de verdunde Skull Cortical Window

1. Ter voorbereiding van de schedel dunner, droog de schedel met een combinatie van steriele wattenstaafjes en perslucht. We aanvankelijk dun de schedel met een steriele IRF 007 boor in een Microtorque II houtborenset bij 4000 tpm. Heel voorzichtig, te beginnen dunner een 2-2,5 mm diameter ronde gedeelte van de schedel. Gebruik alleen lichte vegen bewegingen bijna parallel aan de schedel, gebruik geen directe neerwaartse druk. Stop met het boren van elke 20-30 seconden aan het bot stof te verwijderen met behulp van de samengeperste lucht. Deze onderbrekingen in het boren kan de schedel af te koelen, zodat er geen warmte-geïnduceerde schade aan het onderliggende hersenweefsel.
   1. Zoals het boren vordert, let op de overgang naar de vochtiger sponsachtige bot laag (dwz de "diploe"). Zodra deze laag is bereikt, oefening extra voorzichtig met de boor.
2. Af en toe controleert de geringe dikte van de schedel door het plaatsen van zoutoplossing over het verdunde gebied en het bekijken van onder het ontleden scope. Saline verder kunnen warmteafvoer. Als de schedel is dunner, kleiner bloedvaten zichtbaar.
3. Gebruik een steriele tandheelkundige MicroBlade aan de uiteindelijke verdunning in een zoutoplossing te bereiken, zoals de MicroBlade biedt veel meer tactiele feedback over de stabiliteit van de schedel. Dit zorgt voor veel dunner zijn dan de voorbereidingen met de boor alleen. Vanuit onze ervaring, de optimale dikte van schedel is 10-30 pm.
   1. Het is belangrijk om de slankheid van de schedel controleren onder epifluorescentie meerdere keren tijdens de eerste paar pogingen in het maken van een dunne schedel venster. De scherpte en de diepte van zichtbare microglia en bloedvaten geven een goede indicatie over wanneer het venster is klaar voor de beeldvorming.
4. Zodra het venster is klaar, lijm een ​​custom-made rechthoekig stuk # 0 dekglaasje wi e een afmeting van minder dan 2 mm aan elke kant over het raam. Met behulp van een 1,0 mm diameter glazen pipet, plaats een kleine daling van de cyanoacrylaat lijm op de schedel dunner gebied en voorzichtig lager op het kleine stukje dekglaasje, dan zachtjes drukken tegen de schedel te persen uit overmaat van de lijm. Het is belangrijk om te voorkomen dat belvorming tussen het glas en de lijm, omdat opgesloten lucht zal het gebied leiden eronder te worden optisch ondoorzichtig. De cyanoacrylaat lijm wordt gebruikt omdat het blijft transparant als het droog en voorkomt ook dat het bot en membraan hergroei houden van de schedel onder het raam dun en doorschijnend. Als er een lijm op de top van het deksel glas, gebruik dan de MicroBlade zorgvuldig te verwijderen zodra het deksel glas op zijn plaats zit en de lijm droog is.
5. Een pijnstiller (bijvoorbeeld, Buprenorfine 2 mg / kg subcutaan) is onmiddellijk na de operatie en opnieuw worden toegediend bij tekenen van pijn, met inbegrip van onwil om te bewegen, eten of drinken, gewichtsverlies, speekselvloed, pilo-erectie, respiratoire geluiden, etc.

3. Twee-foton Imaging

1. Ter voorbereiding van twee-foton beeldvorming, dekking van de TSCW met zoutoplossing en zoek op het gebied van belang onder epifluorescentie (figuur 2). Om de latere beeldvorming van het gebied, een foto met behulp van een fotocamera.
2. Voor twee-foton imaging, gebruiken we een op maat gemaakte twee-foton microscoop ⁶ met een Ti: saffier laser afgestemd op 920 nm. Fluorescentie wordt gedetecteerd door middel van een fotomultiplier buis in zijn geheel het veld detectie modus en een 580/180 emissie-filter. Een 20x water-immersie lens (0,95 NA) wordt gebruikt in de beeldvorming sessie. Het maximale vermogen van de laser vermogen bij de doelstelling is vastgelegd tussen 50 en 65 mW.
3. Selecteer een gebied van belang in de corticale lagen I of II (tot 150 micrometer onder het pial oppervlak). Ter bevordering van re-imaging, foto's nemen van hetzelfde gezichtsveld op 1x, 2x, en 3x digitale zoom. Bloedvaten kunnen dienen als oriëntatiepunten op hetzelfde beeldveld gemakkelijk te vinden tijdens de daaropvolgende beeldvorming sessies. Onder een zoom van 3x, multiple z-stacks met 80-90 Z-stappen in elke stapel en een 0,69 um stap kan worden verworven om de 5 minuten tot 30 minuten, wat een goede bemonstering van microgliale morfologie en gedrag in de tijd maakt ( figuur 3). Tussen de overnames van z-stacks, moet men controleren of het niveau van de zoutoplossing over de TSCW, evenals het dier diepte van de anesthesie.

4. Injectie van de HIV-1 zenuwgif, Tat

1. De eerste, silaniseren de binnenbekleding van een 35 gauge naald en 10 ui microvolume spuit om Tat afzetting te voorkomen. Trek de silaneren oplossing (Sigmacote) tot het vult zowel de naald en spuit. Laat de oplossing te zitten voor 5 minuten bij kamertemperatuur. Leeg de oplossing uit de spuit, verwijder de zuiger, en laat de spuit en naald helemaal opdrogen. Tot slot, was de spuit en naald grondig met gedeïoniseerd water.
2. Voer een kleine craniotomie 0,5 mm in diameter ofwel 3 mm rostraal of lateraal van de TSCW waar twee-foton beelden zijn verkregen, met behulp van een kleinere boor en zorgvuldig uitdunnen van de schedelbasis uit elkaar totdat een pincet met scherpe tips kunnen de verdunde laag te verwijderen bot weg te gemakkelijk. We maken gebruik van een 10 pi microvolume injectiespuit voorzien van 35 gauge naald gecontroleerd door een Ultramicropump III spuit pomp gemonteerd op een 3-assige micromanipulator en na het uitlijnen van de naald naar de craniotomie, is het zorgvuldig gevorderd tot een diepte van 700 tot 900 micrometer hieronder de pial oppervlak waar de drie pi Tat _1-72 (of andere pro-inflammatoire middelen) of zoutoplossing (of controle voertuig) wordt geleverd op 80 nL / min.

5. Huisvesting van dieren

1. Als het dier af te beelden meerdere keren op een dag, betrekking hebben op de open ruimte van de schedel met een mengsel van oogzalf en Vaseline om ongemak of schade aan de schedel te voorkomen tussen de beeldvorming sessies. Koppel de steun brug van de kleine kop-plaat (zie figuur 1B) en plaats het dier in een warme kooi met gemakkelijk toegankelijke voedsel en water. Alle dieren zijn te afzonderlijk worden gehuisvest na de ingreep te allen tijde. Zodra de beeldvorming sessies voor een dier zijn compleet voor een bepaalde dag, verwijder voorzichtig de gehele hoofd-plaat en rug hechtdraad de huid over de schedel met een # 6 of kleinere hechtdraad. Nogmaals, het huis van de dieren afzonderlijk met goed toegankelijke voedsel en water tussen de experimentele dag. Controleer dagelijks de dieren op tekenen van stress, pijn of infectie.

6. Representatieve resultaten

Figuur 1. Stabilisatie van dieren voor chirurgie en twee-foton imaging (A) en het hoofd plaat ontwerp (B).

Figuur 2. GFP-gelabelde microglia gevisualiseerd met epifluorescentie.

jove_content ">
Figuur 3. GFP-gelabelde microglia gevisualiseerd met twee-foton beeldvorming na implantatie van de TSCW, ongeveer 50 um onder de pial oppervlak. De single twee-foton secties die 15-30 minuten na de implantatie van de TSCW (dag 0), evenals 7 en 17 dagen later, blijkt dat de ramen helder blijft, terwijl microglia blijven geïnactiveerd bij afwezigheid van inflammatoire beledigingen. De z-projecties genomen 6 en 24 uur na injectie van de HIV neurotoxine tat vertonen indrukwekkende morfologische veranderingen van geactiveerde microglia. Schaalbalk: 10 micrometer.

Discussie

Er is een groeiende consensus dat de werkelijke substraat voor HIV-1 geassocieerd neurocognitieve tekorten (HAND) is de vernietiging van synaptische architectuur, vermoedelijk veroorzaakt door pro-inflammatoire mediatoren vrij van HIV-1 geïnfecteerde mononucleaire fagocyten. Microgliale activatie, meerkernige reuscellen, en gliosis te wijten aan astrocytaire hypertrofie worden beschouwd als niet-specifieke kenmerken van HIV-1 infectie en ontsteking in het CZS ^7. In tegenstelling, is de ernst van premortem neurologische ziekte in verband gebracht met het verlies van synaptische complexiteit, evenals macrofaag last in het CZS ^8,9,10,11. Echter, dynamische interacties tussen de microglia, perifere infiltreren macrofagen en neuronen bij patiënten met HAND kan gewoon niet worden gemodelleerd met behulp van conventionele statische verwerking verkregen uit conventionele immunocytochemische studies. Recente studies van onze laboratoria hebben gesuggereerd dat ten minste enkele van deze interacties tussen perifere en centrale mononucleaire cellen en neuronen kan worden gemodelleerd voor een deel door de stereotactische injectie van de HIV-1-eiwit Tat _1-72 in de hersenen parenchym (Lu, Marker, Tremblay, Qi, en Gelbard, ongepubliceerde gegevens). We hebben daarom besloten om toe te passen in vivo twee foton beeldvorming om de wisselwerking tussen monocyt-afgeleide macrofagen, de hersenen inwoner microglia en neuronen te onderzoeken, in een handelbaar klein diermodel voor neuroAIDS. Terwijl open schedel of verdund-schedel voorbereidingen veroorloven een onderzoek van de corticale architectuur voor een korte periode van tijd (uur), de onderzoekers geïnteresseerd zijn in het tijdsverloop van subacute gebeurtenissen kunnen niet deze preparaten te gebruiken, zonder artifactually te activeren microglia / macrofaag als gevolg van chirurgische manipulatie van de calvarial venster. Hier laten we zien op een eenvoudige manier te omzeilen deze beperking door lijmen een klein stukje glas dekglaasje over het verdunde schedel gebied voorkomen dat de calvarium van regeneratie in de TSCW alsmede het onderhouden van doorzichtigheid gedurende ≥ 3 weken. We verder aan te tonen dat deze techniek ons in staat stelt om het gedrag van de perifere monocyten invoeren van cerebrale microvasculatuur evenals de hersenen-inwoner microglia monitor in reactie op de stereotactische injectie van HIV Tat _1-72 in de cortex van muizen heterozygoot voor CX ₃ CR ₁ / GFP ( te identificeren cellen van mononucleaire afkomst). Deze techniek kan gemakkelijk worden aangepast voor gebruik op muizen met verschillende genetische achtergronden, bijvoorbeeld, hebben we regelmatig gebruik van heterozygote CX ₃ CR ₁ / GFP X Thy-1 YFP ¹² muizen om de interacties tussen monocyt-afgeleide macrofagen, de hersenen inwoner microglia en neuronen in onderzoeken in vivo modellen van ontstekingsprocessen die relevant zijn voor HAND. Onze TSCW voorbereiding kunnen de onderzoekers om te studeren cel-cel interacties tussen de periferie en CZS die kunnen optreden over periodes van weken, waarin het dier meerdere malen kan worden afgebeeld voor en na de experimentele behandeling. Zo kan elk dier dienen als zijn eigen controle. Een waarschuwing voor deze TSCW model is dat de doelwitcellen in onderzoek moeten worden, hetzij genetisch gemanipuleerd om verbeterde fluorescerende eiwitten (eXFP) te uiten of geëtiketteerd worden met een fluorescerende kleurstof, zonder mechanische schending van de calvarium, en dat eXFP meningsuiting moet robuust genoeg zijn om laten cellulaire architectuur gevisualiseerd na herhaalde beeldvorming sessies over een periode van weken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Fentanylcitraat	Hospira Inc.
Midazolamhydrochloride	Baxter Internationl Inc.
Medetomidinehydrochloride (Domitor)	Pfizer Pharma GmbH
Warmtematten	Beyond Bodi Heat
Tobramycine en dexamethason oogzalf (TobraDex)	Alcon
Povidon-jodium 10% oplossing	Betadine Puredue Pharma
IJzer(III)chloride 10% oplossing	Ricca Chemical Company	3120-32
Methylcyanoacrylaat 910	Permabond
Cyanoacrylaat 454	Loctite
TEETS kunstgebitmateriaal crosslinking methylmethacrylaat	Co-Oral-lte Dental Mfg CO
Microtorque II handstukset	Pearson Assessments	R14-0002
IRF 007 boortjes	Fine Science Tools	19008-07
Norland buigbaar microblade volledige radius	Salvin Dental	BLAD-NORLAND-69
Cyanoacrylaat	The Original Superglue
#0 glazen dekglasje	Electron Microscopy Sciences	63750-01
10 μl Microvolume spuit	World Precision Instruments, Inc.	ILS010LT
UltraMicroPump III	World Precision Instruments, Inc.	UMP3-1
35 gauge NanoFil naald	World Precision Instruments, Inc.	NL35BL-2
Kogelmolen, Carbide bits #1/4	World Precision Instruments, Inc.	501860
Sigmacote	Sigma-Aldrich	SL2-100
Fotomultiplicatorbuis	Hamamatsu Corp.	HC125-02
Ti:Saffier laser Mai-Tai	Newport Corp.