De sialidase test is een eenvoudige technische aanpak die nieuwe moleculaire mechanisme (s) van TLR sensoren van microbiële infecties en betrokkenheid bij inflammatoire ziekten op de receptor niveau op het celoppervlak van de live macrofagen zullen toelichten.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Detectie van Neu1 Sialidase activiteit in het reguleren van Toll-like receptor activering
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Zoogdieren Toll-like receptoren (TLR's) zijn een familie van receptoren die pathogeen-geassocieerde moleculaire patronen te herkennen. Niet alleen zijn TLRs cruciaal sensoren van micro-organismen (bijvoorbeeld virussen, bacteriën en parasieten) infecties, ze spelen ook een belangrijke rol in de pathofysiologie van infectieziekten, inflammatoire ziekten, en eventueel in auto-immuunziekten. Zo moeten de intensiteit en de duur van TLR responsen tegen infectieziekten goed worden gecontroleerd. Hieruit volgt dat het begrip van de structurele integriteit van sensor receptoren, hun ligand-interacties en signalering componenten essentieel is voor de volgende immunologische bescherming. Het zou ook belangrijke kansen voor de ziekte van wijziging door middel van sensor manipulatie. Hoewel de signaalwegen van TLR sensoren zijn goed gekarakteriseerd, de parameters die de interacties tussen de sensoren en hun liganden nog steeds slecht gedefinieerd. We hebben onlangs een nieuw mechanisme van TLR activering door zijn natuurlijke ligand, die nog niet eerder waargenomen 1,2. Het suggereert dat ligand-geïnduceerde TLR activatie strak wordt gecontroleerd door Neu1 sialidase activering. We hebben ook gemeld dat Neu1 strak neurotrofine receptoren zoals TrkA en TrkB 3, die Neu1 en matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) cross-talk in complex met de receptoren 4 te betrekken regelt. De sialidase test is in eerste instantie gebruiken om een nieuw ligand, thymoquinone vinden, in de activering van Neu4 sialidase op het celoppervlak van macrofagen, dendritische cellen en fibroblast cellen via GPCR Gαi eiwitten en MMP-9 5. Voor TLR receptoren, onze gegevens blijkt dat Neu1 sialidase al in complex met TLR-2, -3 en -4 receptoren, en wordt geïnduceerd na ligand binding aan een receptor. Geactiveerde Neu1 sialidase hydrolyseert sialyl α-2 ,3-gekoppelde β-galactosyl residuen afstand van ligand binding aan sterische hinder te verwijderen TLR-4 dimerisatie, MyD88/TLR4 complex werving en selectie, NFkB activering en pro-inflammatoire cel responsen. In een gezamenlijk rapport, is Neu1 sialidase is aangetoond dat fagocytose regelen macrofaagcellen 6. Tezamen genomen, heeft de sialidase test heeft ons met krachtige inzichten om de moleculaire mechanismen van ligand-geïnduceerde receptor activering. Hoewel de precieze relatie tussen Neu1 sialidase en de activering van TLR, Trk receptoren is nog niet volledig opgehelderd, zou het een nieuwe of baanbrekende benadering vertegenwoordigen naar cel regelgeving paden.
Protocol
1. Resurrecting Frozen macrofaagcellen
- Voordat wederopstanding van bevroren cellen van de -80 ° C vriezer, moet men kweekmedium met behulp van steriel gefiltreerd Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) aangevuld met 10% foetaal bovine serum (FBS) en 5 ug / ml plasmocin voor te bereiden. Plasmocin is een antibiotica-oplossing wordt gebruikt in het onderzoek te elimineren en te voorkomen mycoplasma besmetting van celculturen.
- Voor een flacon van bevroren cellen, voegt men 4 ml, 1 ml van de gekweekte medium om een 25 cm 2 celkweek kolf in een steriele biohazard containment kap.
- Wanneer de flacon van bevroren cellen zi....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Met behulp van de nieuw ontwikkelde test om sialidase te detecteren in levende macrofaagcellen 2, hebben we gebruik gemaakt van deze technologie om sialidase activiteit te detecteren in ligand-geïnduceerde sialidase activiteit in live BMC-2 macrofaag-cellen in een dosisafhankelijke wijze zowel in live-DC-2.4 dendritische cellen , HEK-TLR4/MD2, HEK293, SP1 mammae adenocarcinoom cellen, menselijke WT en 1140F01 en WG0544 type I sialidosis fibroblast cellen. Neuraminidase-remmers zoals Tamiflu (oseltamivir fosfa.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
SRA en PJ droegen ook als eerste auteurs.
Dankbetuigingen
Gedeeltelijke ondersteuning van beurzen aan MRS is van Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC), de Harry Botterell Stichting voor Neuroscience Research, ARC, en de Garfield Kelly Cardiovascular Research and Development Fund. SRA is een ontvanger van de Universiteit van de Queen's Research Award en de Robert J. Wilson Fellowship. PJ is een ontvanger van Graduate van de Queen's Award en de Robert J. Wilson Fellowship. AG en SA zijn ontvangers van Graduate de Queen's Award. SF was de ontvanger van de Ontario Graduate Scholarship in wetenschap en technologie (OGSST). AG is de ontvanger van Franklin van de Koningin Bracken Graduate ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| DMEM | GIBCO, by Life Technologies | ||
| 4-MUNANA | Biosynth International, Inc | ||
| Foetaal kalfserum | Hyclone | ||
| DakoCytomation, Fluorescent Mounting Media | Dako | S3023 | 15 mL |
| Tamiflu (Oseltamivirfosfaat) | Hoffmann-La Roche AG |
Referenties
- Amith, S. R. Neu1 desialylation of sialyl alpha-2,3-linked beta-galactosyl residues of TOLL-like receptor 4 is essential for receptor activation and cellular signaling. Cell Signal. 22, 314-324 (2010).
- Amith, S. R.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
