Method Article

Visualisatie van mitochondriaal DNA-replicatie in afzonderlijke cellen door Edu signaalversterking

DOI:

10.3791/2147

⸱

November 15th, 2010

 ,  , 
1Michigan Research Community, Undergraduate Research Opportunity Program, University of Michigan, 2Department of Neurology, University of Michigan, 3Department of Internal Medicine, Division of Metabolism, Endocrinology, and Diabetes, University of Michigan

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We ontwikkelden een gevoelige techniek om nieuw gesynthetiseerde mitochondriaal DNA (mtDNA) label in individuele cellen om mtDNA biogenese studeren. De techniek combineert de integratie van onderwijs, samen met een tyramide signaalversterking (TSA) protocol om mtDNA replicatie te visualiseren in subcellulaire compartimenten van neuronen.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mitochondriën zijn de belangrijkste regulatoren van de cellulaire energie en mitochondriale biogenese is een essentieel onderdeel van de regulering van mitochondria aantallen in gezonde cellen 1-3. Een benadering voor de bewaking mitochondriale biogenese is het meten van de snelheid van mitochondriaal DNA (mtDNA) replicatie 4. We ontwikkelden een gevoelige techniek om nieuw gesynthetiseerde mtDNA in afzonderlijke cellen het etiket om te mtDNA biogenese studeren. De techniek combineert de inbouw van 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EDU) 5-7 met een tyramide signaalversterking (TSA) 8 protocol om mtDNA replicatie te visualiseren in subcellulaire compartimenten van neuronen. EDU is superieur aan andere thymidine-analogen, zoals 5-broom-2-deoxyuridine (BrdU), omdat de eerste klik reactie op het label Edu 5-7 niet vereist dat de harde zuur behandelingen of enzym verteert die nodig zijn voor het blootstellen van de BrdU epitoop . De mildere etikettering van Edu maakt directe vergelijking van de oprichting met andere cellulaire markers 9-10. De mogelijkheid om te visualiseren en te kwantificeren mtDNA biogenese biedt een essentieel instrument voor het onderzoeken van de mechanismen die gebruikt worden om mitochondriale biogenese reguleren en zou inzicht geven in de pathogenese geassocieerd met drugs toxiciteit, veroudering, kanker en neurodegeneratieve ziekten. Onze techniek is van toepassing op sensorische neuronen en andere celtypen. Het gebruik van deze techniek om mtDNA biogenese maatregel belangrijke implicaties in het bevorderen van het begrip van zowel de normale cellulaire fysiologie evenals bijzondere waardevermindering ziekte staten.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Voorbereiding van de Neuronen

  1. Dorsale wortel ganglion (DRG) neuronen worden geteeld op steriele (autoclaaf) 12 mm glas dekglaasjes in een 24-well plaat cultuur.
  2. De 10 mM voorraad van onderwijs (in DMSO, Click-iT Edu Microplate Assay Kit) is meestal verdund 1:100 in cultuur medium om een ​​10x EDU-oplossing (100 uM) en vervolgens verdund 1:10 in de cultuur putten (bijvoorbeeld 30 pi van de 10X EDE oplossing in een totaal van 300 ul van cultuur medium). DRG neuronen worden geïncubeerd met een uiteindelijke concentratie van 10 uM Edu bij 37 ° C en 5% CO 2 tussen 2-24 uur. De lengte van de tijd hangt af van hoe behandelingen effect op de snelheid van het mtDNA synthese.
  3. In een zuurkast, zijn DRG neuronen vastgesteld in 2% paraformaldehyde gedurende 10-15 min bij kamertemperatuur, tweemaal gewassen in 1x PBS 2-5 minuten elke wasbeurt en opgeslagen in verse 1X PBS gedurende maximaal 1 maand bij 4 ° C.
  4. Coverslips worden overgedragen met een fijne punt een tang om een ​​voorbereide vochtige kamer (Corning Bioassay schotel met zwart behangen bodem voor contrast, verpakt in aluminiumfolie aan het licht gevoelige componenten en bevochtigd met water verzadigd Kimwipes beschermen) en geplaatst op een vel Parafilm M dat voorziet in een hydrofoob oppervlak om de oplossingen te beperken tot het dekglaasje. Het protocol hieronder is ontworpen voor 28 dekglaasjes en oplossingen worden voorbereid voor 32 dekglaasjes (ongeveer 14% extra volume). Oplossingen met dure of een beperkte componenten zijn zo gemaakt dat 75 tot 80 pi worden gebruikt op elke dekglaasje aan. Anders worden 200-300 ul gebruikt voor het wassen en te blokkeren oplossingen om grondig te wassen uit eerdere oplossingen.
  5. Opnieuw toepassen 1X PBS op het oppervlak van elk dekglaasje (200-300 pi) te dekken. De voorbereiding van de Click-iT test en tyramide signaalversterking kits zoals hieronder en in de instructies van de fabrikant beschreven.

De voorbereiding van Click-iT Edu Microplate Assay Kit

De meeste componenten van de Click-iT Edu Microplate Assay Kit komen pre-gemaakt en worden bewaard bij 4 ° C [2x Click-iT Reactie Buffer (10x Component E), CuSO4 (100 mM, Component F), Click-iT EDU fixatief ( component D) en blokkerende buffer (2x Component H)]. Click-iT EDU Buffer Additief (10x Component G) wordt opgeslagen bij -20 ° C om te voorkomen dat het geel-bruin in de tijd. Deze component tolereert herhaalde vries-dooi cycli.

De Oregon Green 488 azide (Component B) moet worden verdeeld in kleine porties (10-20 pi) naar vries-dooi cycli te minimaliseren en opgeslagen bij -20 ° C.

De voorbereiding van een stamoplossing van de anti-Oregon Green HRP-conjugaat (afdeling I), voeg 75 ul van Milli Q dH 2 O aan de flacon. Meng door zachtjes te pipetteren of door inversie schuimvorming te voorkomen en op te slaan bij 4 ° C. Niet vortex.

Voorbereiding van de TSA Kit # 12, met HRP geit anti-konijn IgG en Alexa Fluor 488 tyramide Kit

Ter voorbereiding van de tyramide stamoplossing, ontbinding van de vaste materiaal (Alexa Fluor 488 tyramide, Component A) in 150 pi van DMSO (Component B). Keer de injectieflacon meerdere malen aan een tyramide laag op de zijkanten van de flacon. Bewaar voorraad oplossing in kleine porties (10-20 pi) bij ≤ -20 ° C, uitgedroogd en beschermd tegen licht.

2. Klik-iT 5-ethynyl-2-deoxyuridine (EDU) Labeling

NB: Alle oplossingen zijn verwijderd met een lamp overdracht pipet met een 200 pi tip aangebracht op het einde om voorzichtig vloeistoffen te verwijderen zonder verlies van cellen. Vermijd het gebruik van een vacuüm lijn, die meestal verwijderen oplossingen te krachtig. Een lamp pipet wordt gebruikt om voorzichtig coverslips overspoelen met 200 tot 300 pi van wasoplossingen grondig te spoelen de vorige oplossing.

  1. Cellen worden gepermeabiliseerd met 0,1% Triton-X-100 in 1X PBS-oplossing gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur in een overdekte vochtige kamer. Gebruik 1% Triton-X-100 stockoplossingen.
    • Maak 3000 pi van 0,1% Triton-X-100 door het toevoegen van 300 pi 1% Triton-X-100 voorraad 2700μL 1X PBS.
    • Gebruik 75-80 pi per dekglaasje aan.
  2. Verwijder de Triton X-100-oplossing en spoel tweemaal met 1X PBS.
  3. Endogene peroxidase activiteit is gedoofd door een 1% H 2 O 2 in 1X PBS-oplossing gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Verdunnen 30% H 2 O 2-oplossing met 1X PBS. Deze oplossing moet vers gemaakt, maar kan worden gemaakt tijdens de 10 minuten permeabilisatie stap boven (stap 3.1).
    • Maak 3000 pi van een 1% H 2 O 2 door de toevoeging van 100 pi 30% H 2 O 2-2900 pi 1X PBS.
    • Gebruik 75-80 pi per dekglaasje aan.
    • Verwijder de peroxidase-oplossing en spoel tweemaal met 1X PBS.
  4. Click-iT Edu Reactie
    • Voor 32 dekglaasjes (32 x 80 = pi2560 pi) een totaal van 2560 pi nodig is. De 2x reactie is gemaakt in 1280 uL, dat is de helft van het totale volume van de reactie.
    • Vers voor de voorbereiding van de Click-iT Reactie Cocktail aan het starten van de 5 minuten na de fix (stap 3.5).
    • Meng de cocktail door en neer te pipetteren. Geen vortex bij het maken van deze reactie.
      2 x Reactie Cocktail
      Componenten zijn van Click-iT Edu Microplate Assay Kit             		Helft van het volume: 1280 pi
      Milli Q dH 2 O 1132.8 pi
      2x Click-iT Reactie Buffer (10x Component E) 100,3 pi
      Click-iT EDU Buffer Additief (10x Component G) 25,6 uL
      CuSO 4 (100 mM, Component F) 25,6 uL
      Oregon Green Azide (Component A) 6,4 pi
      Totaal 1290.7 pi

      OPMERKING: De volumes hierboven gebruikt zijn evenredig met de hoeveelheden die in de Click-iT Edu Microplate Assay kit richtingen. Het uiteindelijke volume van Reaction Cocktail is iets meer dan 1280 pi.
    • De 2X Click-iT reactie wordt verdund met een gelijk volume van Click-iT EDU fixatief (Component D) rechts voor gebruik. Het mengen van deze samen maakt een uniforme reactie oplossing voor alle dekglaasjes.
    • Voeg 1290.7 ul Click-iT EDU fixatief (Component D) om de 1290.7 pi reactie cocktail. Gebruik 75-80 pi per dekglaasje aan.
  5. Post-fix van de neuronen met Click-iT EDU fixatief (Component D) gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
  6. Verwijder de fix en voeg reactie cocktail van bovenaf (stap 3.4). Cover ter bescherming tegen licht en voor 25 minuten bij kamertemperatuur incuberen. Verwijder voorzichtig de reactie Cocktail. Was twee keer met verdund 1X Blocking Buffer (2X Component H).
    • Maak 5200 pi van 1X Blocking Buffer door verdunning van 2600 pi Blocking Buffer (2x Component H) met een gelijk volume van MilliQ d H 2 O (2600 pi). Gebruik 75-80 pi per dekglaasje aan.
  7. Onder een epi-fluorescentie microscoop, controleer Oregon Green kleuring in kernen van mitotisch actieve controle cellen.

3. Tyramide signaalversterking (TSA) van Edu Signal

  1. Voeg 1% TSA blok oplossing voor elk dekglaasje en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
    • Maak pi 6000 van 1% TSA block-oplossing door het wegen van 0,06 g van TSA Blocking Reagent (TSA kit # 12, Component D) en toe te voegen aan 6000 pi 1X PBS. Vortex te mengen. Toevoeging van 5% geit serum in de 1% TSA blok oplossing zal vaak helpen om niet-specifieke binding te verminderen.
  2. Kort draaien de anti-Oregon Green mierikswortelperoxidase geconjugeerd antilichaam voorraad (afdeling I van de Click-iT EDU Microplate Assay), bereid 2-24 uur van tevoren TSA. Verdun het primaire antilichaam 1:300 in 1% TSA blockingbuffer en omdraaien of pipet op en neer voorzichtig om te mengen. Geen vortex om te voorkomen dat het verstoren van de HRP-geconjugeerd antilichaam. Verwijder 1% TSA block-oplossing, voeg 75 ul aan elke dekglaasje en incubeer overnacht bij 4 ° C.
    • De antistof kan worden gebruikt meer geconcentreerd, zoals 1:150, maar het wordt geleverd in beperkte hoeveelheden, dus gebruik het met mate. Nogmaals, toevoeging van 5% geit serum in de 1% TSA blok oplossing helpen vaak om niet-specifieke binding van het anti-Oregon Green mierikswortelperoxidase geconjugeerd antilichaam te verminderen.
    • Maak 2560 pi van een 1:300 antilichaam-oplossing door het toevoegen van 8,53 pi van de voorraad Rabbit anti-Oregon Green-HRP (Click-iT Edu Microplate Assay) tot 2560 il 1% TSA blokkeren. Meng door zachtjes te pipetteren of inversie.
  3. De volgende dag, verwijder dan het antilichaam-oplossing en spoel drie keer met 1X PBS. Incubeer de dekglaasjes in de finale was voor een extra 30-60 minuten op kamertemperatuur om ervoor te zorgen dat de ongebonden primaire antilichaam wordt verwijderd.
  4. Bereid tyramide reactie voor 2560 pi (32 dekglaasjes x 80 pi).
    • Maak 400 pi van een 0,15% H 2 O 2-oplossing (100X) door toevoeging van 2 pl van de 30% H 2 O 2 (TSA kit # 12, Component F) tot boven 398 pi Amplification Buffer (TSA kit # 12, Component E) . Dit moet vlak voor nodig.
    • Voor een uiteindelijk volume van 2560 il combineren:
      • 25,6 pi tyramide-488 (TSA kit Component A)
      • 2508.8 pi Amplification Buffer (TSA kit Component E)
      • 25,6 pi 0,15% H 2 O 2 (van boven voor een laatste 0,0015% H 2 O 2)
      • Verwijder 1X PBS en incubeer met de tyramide reactie gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
  5. Verwijder tyramide reactie en spoel drie keer met 1X PBS, incuberen in de finale was gedurende 30-60 minuten bij kamertemperatuur als voorheen.
  6. Controleer op mtDNA etikettering krachtens een epi-fluorescentie microscoop.
    • Mount coverslips op glas microscoopglaasjes met een antifade montage medium, zoals ProLong Goud met DAPI. Als alternatief kan de Edu etikettering en versterking worden gevolgd door standaard tl-immunocytochemie naar andere cellulaire merkers label.

4. Representatieve resultaten: Visualisatie van mitochondriaal DNA-replicatie als een marker voor mitochondriële Biogenesis

Wij zijn geïnteresseerd in hoe de sensorische neuronen (figuur 1) regelen van het aantal mitochondria. Dit protocol zal label nieuw gesynthetiseerde mtDNA met een fluorescente marker als een manier van meten nieuwe mitochondriën. De opname van de synthetische nucleotide Edu, gevolgd door de klik chemie van de Oregon Green-azide en de daaropvolgende amplificatie met de Alexa-Fluor 488 tyramide resultaten in de etikettering van mtDNA met een groen fluorescerend signaal (figuur 2). Indien correct gedaan, het versterkte groene signaal is voldoende hoger is dan achtergrond fluorescentie (zoals cellulaire autofluorescentie of een side-effect van de HRP-TSA reactie).

Deze techniek is bedoeld om nieuw gerepliceerd mtDNA label om te visualiseren en te kwantificeren mtDNA biogenese binnen subcellulaire compartimenten van neuronen (figuur 3). De EDE etikettering zorgt voor volgend fluorescent label immunocytochemie aan andere cellulaire merkers zoals neurofilament (Figuur 3D).

De TSA reactie kan ook gedaan worden met andere fluorescerende Alexa Fluor tyramides zoals Alexa Fluor 594-tyramide. Dit resulteert in een groen fluorescerend nucleair signaal van de Oregon Green-azide Klik reactie in de kern, maar geen groen signaal in mtDNA, die voorafgaand aan de TSA niet op te sporen. De versterking met Alexa Fluor 594-tyramide versterkt de nucleaire label en onthult de opgenomen EDE in mtDNA met een rode fluorescente signaal (figuur 4). Een soortgelijke versterking procedure wordt gebruikt om BrdU incorporatie in nieuw gesynthetiseerde mtDNA (figuur 5) visualiseren, maar deze methode vereist een extra stap om het BrdU epitoop te herstellen door een van beide een harde zoutzuur (HCl) of enzym verteren, wat niet noodzakelijk is voor Edu etikettering.

figure-protocol-1
Figuur 1. Vertegenwoordiger differentieel interferentie contrast (DIC) beelden van embryonale (links) en volwassen (rechts) dorsale wortel ganglion (DRG) neuronen die doorgaans worden gebruikt voor analyse. Bars = 10 micrometer.

figure-protocol-2
Figuur 2. Schematische voorstelling die de procedure voor de etikettering EDE in mtDNA met een groen fluorescerend signaal. Het schema geeft de drie-stappen-protocol voor de etikettering EDE in mtDNA met een groen fluorescerend signaal. Mitotisch actieve F11 neuroblastomacellen dienen als een positieve controle en illustreren de etikettering patroon van Edu, dat werd opgericht in nucleair en mitochondriaal DNA. De eerste stap (P1) is om een ​​thymidine analoog op te nemen in nieuw gesynthetiseerde mtDNA door het incuberen van cellen in de aanwezigheid van Edu. De tweede stap (P2) is gebaseerd op klik chemie opgenomen Edu label met een Oregon Green-azide. Groene signaal is zichtbaar in kernen van cellen die hun nucleaire DNA gerepliceerd. De laatste stap (P3) is het versterken van de Oregon Green-azide-signaal door incubatie met een HRP-geconjugeerd konijn antilichaam tegen Oregon Green gevolgd door incubatie met Alexa Fluor 488 gelabeld tyramide in de aanwezigheid van waterstofperoxide (H 2 O 2) naar groen signaal in mtDNA te visualiseren.

figure-protocol-3
Figuur 3. Edu etikettering van mtDNA in dorsale wortel ganglion (DRG) neuronen. Neuronen zijn geïncubeerd met Edu en het signaal wordt vervolgens versterkt tot mtDNA dat verwerkt Edu onthullen. Vertegenwoordiger van fluorescentie beelden overlay op doorvallend licht zien groen punctata signalen versterkt EDU (EDU-OG-TSA, groen) opgenomen in de nieuw gesynthetiseerde mtDNA van zowel embryonale (A) en volwassen (BD) DRG neuronen. De EDU etikettering procedure maakt voor de latere immunofluorescentiekleuring van neuronale markers, zoals neurofilament (D, αNF, in het rood). Schaal bars = 10 micrometer.

figure-protocol-4
Figuur 4. Schematische voorstelling die de procedure voor de etikettering EDE in mtDNA met een rood fluorescerend signaal. Het schema geeft de drie-stappen-protocol voor de etikettering EDE in mtDNA met een rood fluorescerend signaal. Mitotisch actieve F11 neuroblastomacellen dienen als een positieve controle en illustreren de etikettering patroon van Edu, dat werd opgericht in nucleair en mitochondriaal DNA. De eerste stap (P1) is om een ​​thymidine analoog op te nemen in nieuw gesynthetiseerde mtDNA door het incuberen van cellen in de aanwezigheid van Edu. De tweede stap (P2) is gebaseerd op klik chemie opgenomen Edu label met een Oregon Green-azide. Groene signaal is zichtbaar in kernen van cellen die hun nucleaire DNA gerepliceerd. De laatste stap (P3) is aan de Oregon Green-azide signaal te versterken door incubatie met een HRP-geconjugeerd konijn antilichaam tegen Oregon Green gevolgd door incubatie met Alexa Fluor 594 gelabeld tyramide in de aanwezigheid van waterstofperoxide (H 2 O 2) te visualiseren rood sein in mtDNA.

figure-protocol-5
Figuur 5. BrdU etikettering en tyramide signaalversterking met een groene of rode fluorescente signaal in mtDNA. Het schema geeft de procedure voor de etikettering BrdU in nieuw gesynthetiseerde mtDNA met ofwel een groen of rood fluorescerend signaal. Een eerste stap is nodig om de BrdU epitoop herstellen door ofwel een zuur (HCl) of enzym verteren, wat niet noodzakelijk is voor Edu etikettering. De volgende stap is incuberen met een muis primaire anti-BrdU antilichaam. Dit wordt gevolgd door incubatie met een mierikswortel peroxidase (HRP)-geconjugeerd geit anti-muis antilichaam. Tenslotte wordt het signaal versterkt met een groene of rode fluorescent gelabelde tyramide in de aanwezigheid van waterstofperoxide (H 2 O 2) om aan te geven in het mtDNA te visualiseren.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We ontwikkelden een gevoelige test om nieuw gesynthetiseerde mtDNA in individuele cellen met behulp van een tyramide signaalversterking van Edu label. Een van de grootste problemen tijdens de optimalisatie van dit protocol is de inconsistente resultaten tussen dekglaasjes. Wijzigingen zijn aangebracht in de Invitrogen kit protocollen om te voorkomen dat het mengen van kleine volumes op individuele coverslips en het maken van meester-oplossingen te gebruiken voor alle dekglaasjes. De 75-80 pi gebruikt voor elke 12 mm ronde glazen dekglaasje is een ideale volume volledig te bedekken van het oppervlak en biedt voldoende oplossing om consistente resultaten tussen monsters te geven. Incubatie tijden en reagens concentraties werden geoptimaliseerd, maar verbeteringen kunnen worden gezien met aanpassingen aan hen.

Het protocol is ontwikkeld om elk proces eenmaal uit te voeren. Er zijn echter enkele van de stappen zijn herhaald met nieuwe oplossingen voor monsters die niet na de eerste poging herstellen. In het bijzonder hebben de EDU klikken reactie stappen (3,4 tot 3,6) is herhaald zonder een significante toename in de achtergrond fluorescentie. De anti-Oregon Green-HRP antilichaam incubatie (4,1 tot 4.3) en de tyramide amplificatie (4.4-4.5) stappen zijn ook herhaald, maar resulteert vaak in een slechte signaal-ruisverhouding als gevolg van de verhoogde achtergrond fluorescentie.

De meest gevoelige reagentia zijn de Click-iT EDU Buffer Additief (Component G) en het konijn anti-Oregon Green-HRP antilichaam (afdeling I) van de Click-iT Edu Microplate Assay kit. De Click-iT Edu Buffer Additief draait geleidelijk aan geel na verloop van tijd indien bewaard bij 4 ° C en tussen de 6-12 maanden donkerder aanzienlijk. Opslag van de Click-iT Edu Buffer Additief bij -20 ° C zal verlichten deze kwestie. De etikettering en de tyramide versterking stappen werken het best als het konijn anti-Oregon Green-HRP antilichaam wordt gebruikt binnen 4-6 maanden voor de reconstructie van het in MilliQ dH 2 O.

De milde etikettering van onderwijs in mtDNA zorgt voor directe vergelijkingen met extra cellulaire merkers 9-11 en verbetert het nut van deze techniek ten opzichte van andere thymidine-analogen, zoals 5-broom-2-deoxyuridine (BrdU), die vereist dat een ruwe behandeling te herstellen zijn epitoop binnen DNA. Ons laboratorium 11-12 en 13-15 hebben anderen met succes gebruikt om BrdU mtDNA label. De BrdU etikettering techniek is vergelijkbaar met die gebruikt voor Edu, maar heeft een aantal belangrijke verschillen (figuur 5). Na de permeabilisatie stap hierboven genoemde (3.1 tot 3,2), is de BrdU epitoop hersteld met een denaturatiestap (2 N HCl gedurende 30 minuten bij 37 ° C gevolgd door drie wasbeurten in 1X PBS). De BrdU wordt dan gelabeld met een primair antilichaam tegen BrdU (Vector Laboratories verdund 1:50 in 1% oplossing van het blokkeren van de TSA kit en 's nachts geïncubeerd bij 4 ° C). Een secundaire antilichaam stap is nodig om de BrdU signaal (geit anti-muis IgG geconjugeerd aan HRP van de TSA kits # 2 en # 5, verdund 1:100 in 1% blockingbuffer en geïncubeerd gedurende 45 min bij kamertemperatuur) te versterken voorafgaand aan de de TSA stappen (+4,3 tot 4,5 boven). Met twee thymidine-analogen, Edu en BrdU, een label mtDNA is voordelig voor het uitvoeren van dubbele label experimenten waarbij mtDNA sequentieel kan worden geëtiketteerd pulse-labeling paradigma 11.

Ons laboratorium is met behulp van de EDU en BrdU de etikettering van mtDNA om de regeling van mitochondriale biogenese in de context van diabetische neuropathie, een veel voorkomende complicatie van diabetes te onderzoeken. We hebben met succes gebruikt de signaalversterking om veranderingen in mtDNA biogenese in individuele neuronen 11-12 te meten. Deze techniek zal nuttig zijn in andere experimenten ontworpen om de mechanismen van mtDNA replicatie en omzet of voor het identificeren van geneesmiddelen die mtDNA synthese remmen te verkennen. Daarnaast kunnen de basisprincipes van het versterken van Edu en BrdU signalen worden toegepast op andere studies die maatregel DNA-replicatie of reparatie.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
Geen belangenconflicten verklaard.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door National Institutes of Health Subsidies NS-38849 en de DK-076160, de Juvenile Diabetes Research Foundation Centrum voor de Studie van complicaties bij diabetes, het Programma voor Neurologie onderzoek en ontdekking en de A. Alfred Taubman Medical Research Institute aan de Universiteit van Michigan. Dit werk gebruikte de morfologie en Image Analysis Kern van het Michigan Diabetes Research en Training Center, gefinancierd door National Institutes of Health Grant 5P60 DK-20572 van het National Institute of Diabetes en Maag-, Darm-en nierziekten. De auteurs danken Scott T. Clarke van Molecular Probes / Invitrogen voor zijn waardevolle adviezen over de verschillende Click-iT Edu labeling kits en de gulle donatie van de reagentia voor de initiële ontwikkeling van het Edu amplificatietechniek ondersteunen.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
12 mm coverslipsFisher Scientific12-545-82
245 mm x 245 mm BioAssay DishCorning431111
Parafilm MFisher ScientificPM-996
paraformaldehyeSigma-AldrichP6148
Triton X-100Sigma-AldrichT-8532
Phosphate buffered saline 10X solutionFisher ScientificBP399
Transfer PipetFisher Scientific13-711-7M
Hydrogen peroxide, 30% in waterFisher ScientificBP2633
Click-iT EdU Microplate Assay KitInvitrogenC10214
TSA Kit #12, with HRP—goat anti-rabbit IgG and Alexa Fluor 488 tyramideInvitrogenT20922
TSA Kit #15, with HRP–goat anti-rabbit IgG and Alexa Fluor 594 tyramideInvitrogenT20925
ProLong Gold antifade reagent with DAPIInvitrogenP-36931
Polyclonal rabbit Neurofilament antibodyChemicon InternationalAB1981
Mouse monoclonal anti-BrdU antibodyVector LaboratoriesVP-B209
TSA Kit #2, with HRP—goat anti-mouse IgG and Alexa Fluor 488 tyramideInvitrogenT20912
TSA Kit #5, with HRP—goat anti-mouse IgG and Alexa Fluor 594 tyramideInvitrogenT20915

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Mitochondrial fusion and fission in mammals. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 22, 79-99 (2006).">Chan, D. C. Mitochondrial fusion and fission in mammals. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 22, 79-99 (2006).
  2. (De)constructing mitochondria: what for. Physiology (Bethesda). 21, 233-241 (2006).">Dimmer, K. S., Scorrano, L. (De)constructing mitochondria: what for. Physiology (Bethesda). 21, 233-241 (2006).
  3. Mitochondrial dynamics and apoptosis. Genes Dev. 22, 1577-1590 (2008).">Suen, D. F., Norris, K. L., Youle, R. J. Mitochondrial dynamics and apoptosis. Genes Dev. 22, 1577-1590 (2008).
  4. Number matters: control of mammalian mitochondrial DNA copy number. J. Genet. Genomics. 36 (3), 125-131 (2009).">Clay Montier, L. L., Deng, J. J., Bai, Y. Number matters: control of mammalian mitochondrial DNA copy number. J. Genet. Genomics. 36 (3), 125-131 (2009).
  5. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 105, 2415-2420 (2008).">Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 105, 2415-2420 (2008).
  6. Detection of S-phase cell cycle progression using 5-ethynyl-2'-deoxyuridine incorporation with click chemistry, an alternative to using 5-bromo-2'-deoxyuridine antibodies. Biotechniques. 44, 927-929 (2008).">Buck, S. B., Bradford, J., Gee, K. R., Agnew, B. J., Clarke, S. T., Salic, A. Detection of S-phase cell cycle progression using 5-ethynyl-2'-deoxyuridine incorporation with click chemistry, an alternative to using 5-bromo-2'-deoxyuridine antibodies. Biotechniques. 44, 927-929 (2008).
  7. EdU incorporation is an alternative non-radioactive assay to [(3)H]thymidine uptake for in vitro measurement of mice T-cell proliferations. J Immunol Methods. 350 (1-2), 29-35 (2009).">Yu, Y., Arora, A., Min, W., Roifman, C. M., Grunebaum, E. EdU incorporation is an alternative non-radioactive assay to [(3)H]thymidine uptake for in vitro measurement of mice T-cell proliferations. J Immunol Methods. 350 (1-2), 29-35 (2009).
  8. Fluorescein-labeled tyramide strongly enhances the detection of low bromodeoxyuridine incorporation levels. J. Histochem. Cytochem. 45 (2), 315-319 (1997).">Heusden, J. V. an, Jong, P. de, Ramaekers, F., Bruwiere, H., Borgers, M., Smets, G. Fluorescein-labeled tyramide strongly enhances the detection of low bromodeoxyuridine incorporation levels. J. Histochem. Cytochem. 45 (2), 315-319 (1997).
  9. A novel method based on click chemistry, which overcomes limitations of cell cycle analysis by classical determination of BrdU incorporation, allowing multiplex antibody staining. Cytometry A. 73, 626-636 (2008).">Cappella, P., Gasparri, F., Pulici, M., Moll, J. A novel method based on click chemistry, which overcomes limitations of cell cycle analysis by classical determination of BrdU incorporation, allowing multiplex antibody staining. Cytometry A. 73, 626-636 (2008).
  10. 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine labeling detects proliferating cells in the regenerating avian cochlea. Laryngoscope. 119, 1770-1775 (2009).">Kaiser, C. L., Kamien, A. J., Shah, P. A., Chapman, B. J., Cotanche, D. A. 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine labeling detects proliferating cells in the regenerating avian cochlea. Laryngoscope. 119, 1770-1775 (2009).
  11. Mitochondrial DNA (mtDNA) Biogenesis: Visualization and Duel Incorporation of BrdU and EdU Into Newly Synthesized mtDNA In. Vitro. J Histochem Cytochem. 58 (2), 207-218 (2010).">Lentz, S. I., Edwards, J. L., Backus, C., McLean, L. L., Haines, K. M., Feldman, E. L. Mitochondrial DNA (mtDNA) Biogenesis: Visualization and Duel Incorporation of BrdU and EdU Into Newly Synthesized mtDNA In. Vitro. J Histochem Cytochem. 58 (2), 207-218 (2010).
  12. Diabetes regulates mitochondrial biogenesis and fission in mouse neurons. Diabetologia. 53 (1), 160-169 (2010).">Edwards, J. L., Quattrini, A., Lentz, S. I., Figueroa-Romero, C., Cerri, F., Backus, C., Hong, Y., Feldman, E. L. Diabetes regulates mitochondrial biogenesis and fission in mouse neurons. Diabetologia. 53 (1), 160-169 (2010).
  13. In situ localization of mitochondrial DNA replication in intact mammalian cells. J. Cell Biol. 135, 883-893 (1996).">Davis, A. F., Clayton, D. A. In situ localization of mitochondrial DNA replication in intact mammalian cells. J. Cell Biol. 135, 883-893 (1996).
  14. Replication of mitochondrial DNA occurs throughout the mitochondria of cultured human cells. Exp. Cell. Res. 289, 133-142 (2003).">Magnusson, J., Orth, M., Lestienne, P., Taanman, J. W. Replication of mitochondrial DNA occurs throughout the mitochondria of cultured human cells. Exp. Cell. Res. 289, 133-142 (2003).
  15. Mitochondrial biogenesis in the axons of vertebrate peripheral neurons. Dev. Neurobiol. 68, 1348-1361 (2008).">Amiri, M., Hollenbeck, P. J. Mitochondrial biogenesis in the axons of vertebrate peripheral neurons. Dev. Neurobiol. 68, 1348-1361 (2008).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Mitochondrial DNA ReplicationEdU LabelingTyramide Signal AmplificationMitochondrial BiogenesisNeuronal Subcellular CompartmentsClick ChemistryFluorescent ImagingMitochondrial DNA Copy NumberNeuronal Marker StainingMitochondrial DNA Visualization

Related Articles