Mutagenese en Functionele analyse van ionenkanalen heteroloog Uitgedrukt in zoogdiercellen

Samenvatting

We zullen zien hoe het effect van een enkele puntmutatie op de functie van een ionkanaal studie.

Samenvatting

We zullen laten zien hoe je de functionele effecten van de invoering van een punt mutatie in een ionkanaal studie. Bestuderen we G-eiwit-gated innerlijk rectificeren kalium (hierna GIRK) kanalen, die belangrijk zijn voor het reguleren van de prikkelbaarheid van neuronen. Er zijn vier verschillende zoogdieren GIRK kanaal subeenheden (GIRK1-GIRK4) - richten we ons op GIRK2 want het vormt een homotetramer. Stimulatie van verschillende types van G-eiwit-gekoppelde receptoren (GPCR's), zoals de muscarine receptor (M2R), leidt tot activatie van GIRK kanalen. Alcohol ook direct activeert GIRK kanalen. We zullen laten zien hoe je een aminozuur muteren door specifiek te veranderen van een of meer nucleotiden in het cDNA voor de GIRK kanaal. Deze gemuteerde cDNA-sequentie zal versterkt worden in bacteriën, gezuiverd, en de aanwezigheid van de puntmutatie wordt bevestigd door DNA-sequencing. De cDNA voor het gemuteerde en wild-type GIRK kanalen worden getransfecteerd in humane embryonale nier HEK293T cellen gekweekt in vitro. Ten slotte zal whole-cell patch-clamp elektrofysiologie gebruikt worden om de macroscopische kalium stromen studie door het ectopisch uitgedrukt wild-type of gemuteerde GIRK kanalen. In dit experiment zullen we onderzoeken het effect van een L257W mutatie in GIRK2 kanalen op M2R-afhankelijke en alcohol-afhankelijke activering.

Protocol

1. Plaatsgerichte mutagenese

We maken gebruik van zoogdieren expressieplasmide pcDNA3.1 dat codeert voor een cDNA voor GIRK2 en invoering van een punt mutatie met behulp van Stratagene (Agilent Technologies) Quikchange XL II plaats-gerichte mutagenese kit, volgens de instructies van de fabrikant.

Primers volgorde kan eenvoudig worden gegenereerd met behulp van online primer ontwerp van het programma te vinden op:
https://www.genomics.agilent.com/CollectionSubpage.aspx?PageType=Tool&SubPageType=ToolQCPD&PageID=15

Opmerking: Wij gebruiken standaard 1,5 ml Eppendorf buizen in plaats van BD 14 ml buizen beschreven in het protocol. Echter, het gebruik van XL10-Gold ultracompetent E. coli voorbehandeld met β-mercapto-ethanol, 30s heat shock tijd en NZY ⁺ (of NZYM ⁺⁾ media zijn van cruciaal belang voor de succesvolle mutagenese. Indien mogelijk, kan het vervaardigen van een extra stille mutatie die een nieuwe beperking site maakt handig zijn voor het screenen van mutant kolonies hieronder.

2. Miniprep, DNA-sequencing en Maxiprep

2.1 Qiagen Miniprep en sequencing.

Individuele kolonies worden geplukt en gekweekt in LB-bouillon met ampicilline (AMP). We volgen de instructies van de fabrikant voor de zuivering van het cDNA. Een eenvoudige restrictiedigestie kan worden gebruikt bevestigen de succesvolle introductie van de mutatie, indien een beperking site is opgenomen in stap 1 hierboven. Geautomatiseerde DNA-sequencing is off-site gedaan, en is essentieel om te bevestigen de aanwezigheid van de mutatie in het cDNA, evenals beoordelen of er sprake is van ongewenste mutaties. Deze stap is zeer belangrijk. We volgorde de hele GIRK coderende sequentie met behulp van forward T7 promoter en reverse BGH sequencing primers die flank meerdere kloneringsplaats van de pcDNA3.1 plasmide.

Opmerking: Het is belangrijk om zorgvuldig te inspecteren de sequentiebepaling electropherogram om voldoende kwaliteit van de sequencing gegevens te verzekeren. Hoge kwaliteit electropherogram heeft scherpe, niet-overlappende pieken met weinig ruis.

2.2 Qiagen maxiprep.

We volgen de instructies van de fabrikant.

Opmerking: Deze stap is opgenomen in onze experimenten om de zuiverheid van het cDNA, die wij belangrijk vinden is voor een efficiënte transfectie te verbeteren.

3. Cultuur en de Transfectie van cellen HEK293T

Al deze stappen moeten worden gedaan in een steriele weefselkweek kap.

3,1 cel cultuur

HEK293T cellen zijn gemakkelijk te gebruiken omdat ze gemakkelijk te kweken (37 ° C, 5% CO ₂ bevochtigde incubator), hebben een snelle replicatie, hoge transfectie-efficiëntie en vatbaar zijn voor whole-cell patch-clamp elektrofysiologie. HEK293T cellen brengen SV40 grote T antigen dat episomale replicatie van plasmide pcDNA3.1 zorgt.

HEK293T cellen worden gekweekt in lage-glucose DMEM media aangevuld met L-glutamine en 10% foetaal runderserum (FBS). Voor de passage cellen toe te voegen 0,25% trypsine / EDTA tot samenvloeiing (90-95%) HEK293T cellen, wachten tot cellen los te maken van het weefsel schotel, stop dan met de enzymactiviteit door toevoeging van verse media met FBS /. Plaat ~ 1 X 10 ⁵ cellen / putje in een 12 goed celkweek schotel, samen met 1 ml van antibiotica-vrije cultuur media per well. (1 X 10 ⁵ cellen is ~ 350 pi van de celsuspensie verkregen uit samenvloeiende T25 fles opnieuw gesuspendeerd met 10 ml media).

3.2 Transfectie

Na 8-24 uur, zal HEK-cellen zich te houden aan de kunststof en zijn klaar voor transfectie. Transfecteren cellen met 0,2 ug kanaal cDNA, 0,4 microgram M2R receptor cDNA en 0,04 microgram YFP cDNA met behulp van Invitrogen Lipofectamine 2000. Let op: we gebruiken een kleine hoeveelheid YFP cDNA om te bepalen welke cellen worden getransfecteerd met succes (groene cellen zullen waarschijnlijk bevatten zowel GIRK kanalen en M2-receptoren). De concentratie van cDNA te gebruiken zullen moeten worden aangepast voor elke kloon.

3.3 Fluorescentie visualisatie van getransfecteerde cellen.

Plaats 12-wells plaat op het podium van een omgekeerde fluorescentie microscoop, en te onderzoeken cellen voor YFP expressie. Te vergelijken met DIC afbeelding en noteer bij benadering het aantal groene cellen. Dit geeft een schatting van de transfectie-efficiëntie.

3.4 Voorbereiding van de 24-well gerechten en Poly-D-lysine gecoate dekglaasjes

Schoon 12 mm glas dekglaasjes (Warner, CS-12R) door schudden ze 's nachts met Radiacwash, gevolgd door wassen met gedemineraliseerd water en' s nachts te schudden in 95% ethanol. Bewaar de schone dekglaasjes in 70% ethanol tot gebruik.

Plaats dekglaasjes in een petrischaal met ethanol, vlam uit ethanol met behulp van pincet en de brander, eend plaats in een putje van een steriele 24 wells plaat.

Bedek elk putje met 250 ul van poly-D-lysine (PDL) oplossing [0,2 mg / ml] en laat de dekglaasjes zitten 's nachts ondergedompeld in PDL oplossing onder steriele kap. Wikkel de 24 wells plaat in Parafilm om de verdamping te voorkomen.

De volgende ochtend, aspireren PDL en was 2x met steriel water. Laat platen te openen om te drogen onder de motorkap dan, te dekken. De 24 goed gerechten met gecoate dekglaasjes kan worden verpakt in met steriele aluminiumfolie en opgeslagen bij kamertemperatuur weken.

3.5 Plating getransfecteerde HEK293T cellen op de dekglaasjes

24 uur na transfectie, splitsen cellen in 24-well schaal (~ 4 X 10 ³ cellen / putje) bevattende glazen dekglaasjes bekleed met poly-D-lysine. Let op: getransfecteerde cellen kunnen gebruikt worden tot 24-72 uur na transfectie. De cellen zijn verdeeld aan individuele dekglaasjes bieden voor patch clamp elektrofysiologie experiment.

4. Elektrofysiologie

4.1 voorbereiden Solutions

Extracellulaire (bad) oplossing: 20 mM KCl, 140 mM NaCl, 0,5 mM CaCl _{2, 2} mM MgCl ₂ en 10 mM HEPES (pH 7,4 ingesteld met NaOH).

Aliquot 20K bad-oplossing en voeg de juiste modulatoren

• 20K + Ba ^{2 +:} oplossing met 1 mM BaCl _2: een specifieke remmer van naar binnen stromen rectificeren
• 20K + carbachol: oplossing met 5 uM carbachol: een specifieke M2R agonist; M2R koppels om G-eiwitten die open GIRK kanalen
• 20K + Ethanol: bad oplossing die 100 mM EtOH om direct te activeren GIRK kanalen

Plaats bad oplossingen in spuiten (oplossing containers) van de snelle uitwisseling perfusie-systeem. Opmerking: We maken gebruik van een Warner knijpklep systeem om het bad oplossingen te controleren. PE-buizen wordt aanbevolen.

Interne / elektrode-oplossing: 140 mM KCl, 20 mM NaCl, 5 mM EGTA, 5,4 mM _MgCl2, 10 mM HEPES (pH 7,4) met 2,5 mM K ₂ ATP en 0,3 uM Li ₂ GTP.

Wij maken de elektrode oplossing zonder ATP en GTP. We afzonderlijk voor te bereiden aliquots van ATP en GTP, die zijn opgeslagen bij -80 ° C, en toe te voegen aan de elektrode oplossing op de dag van het experiment. We houden spuit met de definitieve elektrode oplossing op ijs om de ATP / GTP te behouden. We steriel filter (0,2 um) de interne / externe oplossingen voor microbiële groei te remmen en verminderen de mogelijkheid van verstopping van de buizen en de elektrode.

4.2 Pulling elektroden

We maken gebruik van Narishige twee-staps verticale puller en borosilicaatglas elektrode van Warner Instrument (1,5 mm buitendiameter, 0,86 mm, inwendige diameter en 7,5 cm lengte) om elektroden te verkrijgen met 3-7 MΩ weerstand bij gevuld met intracellulaire oplossing.

Opmerking: Het is noodzakelijk om experimenteel parameters te bepalen voor de elektrode trekker en het type van de elektrode glas in uw lab. Voor onze verticale trekker maken wij gebruik van een warmte-instelling van 60,2 voor de eerste trek en ~ 43 voor de tweede te trekken.

4.3 whole-cell patch klemmen

1. Mount dekglas in een 35 mm schaal met behulp van kleine hoeveelheid vaseline, dek af met externe oplossing en plaats schotel op het podium van een omgekeerde fluorescentie microscoop. Gebruik DIC om zich te concentreren en vinden cellen, overschakelen naar YFP fluorescentie te YFP positieve cellen te lokaliseren.
2. Positie tip van perfusie manifold de buurt van een groene cel (20-30 urn uit de cel van belang = 2-3 cell lengte van elkaar).
3. Vul de elektroden met een oplossing, bevestig deze aan de headstage van Axopatch 200B versterker (Axon Instruments) met de volgende basisinstellingen: Gain 1, Configuratie: whole-cell β = 1, mode V-klem.
4. Van toepassing zijn positieve druk op de elektrode om te voorkomen dat verstopping van de pipet, en gebruik de manipulator te elektrode plaats net boven de cel.
5. To Zero de pipet potentieel, selecteert u het Seal Test knop om een ​​testspanning stap te leveren. De 5 mV rechthoekige spanning stap zal verschijnen in het venster van Seal Test Clampex. Stel de Pipetteer Offset potentiometer op de versterker naar de basis-line stroom naar 0 nA te brengen. Als alternatief, nul de pipet potentieel door over te schakelen van de versterker functieschakelaar naar V-track modus en de meter knop om VTrack en de pipet Offset potentiometer te gebruiken op de versterker om de spanning te brengen op de versterker meter display "0.00".
6. Controleer de weerstand van de elektrode met behulp van dichtheidsbeproeving bevel van de Clampex 8.2 software (moet zijn 3-7 MΩ).
7. Open een opgeslagen protocol bestand of maak een nieuw protocol. Om open protocol bestand te selecteren in het hoofdmenu Acquire vervolgens op Openen Protocol en kies een opgeslagen spanning protocol bestand. Voor dit experiment is het protocol is gemaakt om membraanpotentiaal houden op-40mV, leveren een enkele 50 ms spanning stap tot -100 mV en oprit tot +40 mV meer dan 200 ms. Dit protocol is uitgevoerd om de 2 seconden. De helling-protocol zorgt voor observatie van de omkering potentieel en naar binnen rectificatie van GIRK kanalen. Voor de voltage-gated ionkanalen, kan een rechthoekige spanning stap meer aangewezen zijn.
8. Aanpak cel met behulp van fijne afstelling van de manipulator, laat een positieve druk, na het aanraken van het celoppervlak van toepassing zijn negatieve druk, en de monitor verhoging van de weerstand in de Seal Test oscilloscoop venster. Eenmaal weerstand is in de GΩ serie, heeft de elektrode verzegeld op membraan (Gigaseal heeft gevormd).
9. Breng een puls van negatieve druk op de celmembraan te breken en krijg toegang in de cel. Eenmaal in de whole-cell configuratie, zal u zich registreren verhoogde capacitieve stromen.
10. Schakel over naar Membraan Test in Clampex en noteer de toegang tot weerstand Ra, membraan weerstand Rm, membraan capaciteit Cm en controleer door het oog van de exponentiële pasvorm van de theoretische curve naar de echte capacitieve stroom. Membraan capaciteit is evenredig met celgrootte en zal later worden gebruikt om de huidige dichtheid te berekenen.
11. Schakel terug naar Test, set V-Out (membraan potentiële) tot -40 mV en filter Seal bij 10 kHz
12. Compenseren voor membraan capaciteit en serieweerstand op de versterker met de volgende stappen:
    1. Schakel de hele cel GLB in te schakelen. Pas de hele cel GLB en serieweerstand wijzerplaten heen en weer, tot je een vlakke testpuls. U kunt ook moet pipet capaciteit FAST CAP knop aan te passen.
    2. Schakel% VOORSPELLING knop naar ongeveer 60-80%, weer opnieuw aanpassen hele cel GLB en de serieweerstand kiezen (je kan hebben om pipet capaciteit schadevergoeding FAST GLB-knop ook te passen).
    3. Zet% COMP-tot 100% zonder oscillerende de cel, terwijl het proberen om de pols te houden plat door het opnieuw te passen hele cel GLB en serieweerstand (je kan hebben om pipet capaciteit schadevergoeding FAST GLB-knop ook te passen). Stel de vertraging door het verminderen van de tijd constant.
    4. Noteer de waarden voor de Cm (membraan capaciteit), Rs (serieweerstand),% COMP,% pred en Lag tijd in te stellen op de versterker in de notebook. De CM en Rs moet ongeveer dezelfde zijn als de Cm en Rm gemeten in het membraan Test hierboven.
13. Schakel externe oplossing klep om het bad oplossing te controleren. Stel de versterker 8-polige Bessel-filter om 2kHz, opent een spanning klem protocol en beginnen met opnemen stromingen.
14. We nemen GIRK stromen met behulp van een helling protocol dat tot -100 mV stappen voor 50 ms dan opritten van 100 mV tot +40 mV meer dan 200 ms en wordt geleverd om de 2 seconden. De helling-protocol zorgt voor de observatie van de omkering potentieel en voor actieve rectificatie eigendom van GIRK kanalen. Bij kamertemperatuur (22-25 ° C), de huidige GIRK moet in de buurt van -50 mV (met 20 mM KCl in het bad), die in de buurt van de berekende evenwicht potentieel voor K (E _K = -50 mV) achteruit, dan blijven tamelijk vlak bij potentialen positief naar E _K.
15. Experimentele Protocol: Na het opnemen van een stabiele basislijn, overschakelen naar oplossing 20K + carbachol en wacht op top van de reactie, ga terug naar 20K bad oplossing, dan gelden 20K + Ethanol en wacht op grootste gevoeligheid, schakel dan over naar 20K bad oplossing, en ten slotte naar 20K + Ba ^{2 +-oplossing.} Tijdens de toepassing van deze medicijnen zie je veranderingen in de amplitude van de GIRK stromingen (het meest uitgesproken bij -100 mV). Let op het trace nummer dat overeenkomt met de toepassing van verschillende extracellulaire oplossingen in de notebook. Een enkele Clampfit bestand bevat alle veegt voor de gehele experiment.

5. Data Analysis

We maken gebruik van Clampfit 9.2 software om gegevens te analyseren GIRK stromen bij -100 mV.

1. Open het bestand met de opname, stelt u de cursor bij -100 mV. Standaard ziet u alle sporen overlay op het scherm. Door te drukken op "Write cursors" icoon maakt u Excel-achtige spreadsheet met numerieke gegevens.
2. Door het toewijzen van X aan het trace nummer kolom en Y om de cursor te kolom en op "Create Graph"-pictogram kunt u snel tekenen een tijdsverloop plot van het experiment.
3. Bereken basale stroom door het aftrekken van de huidige in aanwezigheid van Ba ^{2 +} van de huidige opgenomen in externe perfusie-oplossing alleen ("20K huidige" minus "20K + Ba ^{2 +} current"). Bereken geïnduceerde stroom door het aftrekken van basale stroom in 20K van de geactiveerde stromen ("20K + carbachol huidige" minus "20K stroom", "20K + Ethanol huidige" minus "20K current"). Bereken de stroomdichtheid (pA / pF) door de huidige door de membraan capaciteit (rechtstreeks op de versterker). Bereken procent activatie door te delen geïnduceerde stroom door de basale stromen en te vermenigvuldigen met 100.

6. Representatieve resultaten

U moet in staat zijn om huidige record van cellen getransfecteerd met wild-type kanalen. Voor GIRK kanalen metend in de extracellulaire oplossing die 20 mM K ⁺ (en 145 mM K ⁺ intracellulair) moeten ze sterke innerlijke rectificatie en een omkering potentieel van ~ -50 mV, dat is een essentiële eigenschap van kalium kanalen vertonen. De wild-type stroom zal sterk toenemen op carbachol applicatie (3-5 voudige toename van meer dan basale stroom) en reageert op dezelfde wijze als de 100 mm ethanol. Let op: de tekenconventie voor elektrofysiologie is het inwendige stroom negatief is en naar buiten stroom is positief. Voor de L257W mutatie in de alcohol bindingsplaats van GIRK2, ziet u verzwakt reacties op zowel de carbachol en ethanol. Dit suggereert dat de L257 is betrokken bij de alcohol-en G-eiwit activering van GIRK2 kanalen. Voor meer voorbeelden van de resultaten van GIRK2 mutagenese, zie de recente publicatie van Aryal et al.. ^1.

Figuur 1. Window of Clampfit 8.0 toont gegevens bestand voor wild-type GIRK2 opname. Linksboven toont bovenop veegt vastgelegd in reactie op een ramp spanning protocol in de aanwezigheid van verschillende externe bah oplossingen. Cursor een is geplaatst bij -100 mV. De cursor waarden worden weggeschreven naar de spreadsheet (rechter paneel). Linksonder paneel toont de plot van sweep nummer vs, de huidige. Let op de toename van de huidige (neerwaartse afbuiging) met ethanol (EtOH) en carbachol (Carb) en de huidige remming met Ba ^{2 +.}

Figuur 2. Window of Clampfit 8.0 toont gegevens bestand voor een mutant GIRK2-L257W opname. Beschrijvingen zijn dezelfde als in figuur 1. Gewezen op het verlies van de carbachol (Carb) activering en vermindering van EtOH-geïnduceerde stromingen in de mutant kanalen.

Discussie

Plaats-gerichte mutagenese is een klassieke benadering van de structuur-functie relaties van ionenkanalen te bestuderen. Het is gebaseerd op het uitgangspunt dat door het veranderen van een kritische residu van het ionkanaal moet men in staat zijn om uitgesproken veranderingen in het kanaal functie waarnemen. In tegenstelling, kunnen veel mutaties in de niet-kritische houding worden ingevoerd zonder grote verstoringen om het kanaal te werken. Meestal wordt het residu in vraag te beginnen gemuteerd om alanine, een kleine niet-polair aminozuur, gevolgd door een mutatie aan tryptofaan, de grootste van aminozuren ^2. Als het residu is van belang om het kanaal functie, zullen beide mutaties veranderen kanaal activiteit. Als een minder essentiële residu wordt gemuteerd, de effecten van de mutatie, vooral aan alanine zijn vaak onopvallend. Tryptofaan mutaties hebben meer kans om veranderingen als gevolg van sterische belemmeringen worden geassocieerd met het tryptofaan grootte veroorzaken. Vaak, wanneer kunnen de structurele informatie ontbreekt, systematische mutatie naar alanine of tryptofaan binnen een fragment van kanaal (de zogenaamde alanine of tryptofaan scan) worden gebruikt om kritische resten te vinden. Het is belangrijk op te merken dat meerdere klonen met verschillende puntmutaties kunnen worden bereid in parallel waardoor het testen van meerdere residuen binnen relatief korte tijd. Onlangs hebben meerdere kristalstructuren van de kanalen beschikbaar zijn ^3,4,5. Ze kunnen worden gebruikt om potentiële sleutel residuen te testen met behulp van de aanpak beschreven in dit protocol te stellen.

Metingen aan wild-type kanaal moet altijd gepaard gaan met de meting van een mutant kanaal om te dienen als een positieve controle om te verzekeren dat transfectie en elektrofysiologische experimenten correct werden uitgevoerd. Punt mutaties kunnen leiden tot een gebrek aan een functionele stroom, een stroom vergelijkbaar met de wild-type of gewijzigde regelgeving van het kanaal activiteit. Het ontbreken van meetbare stroom kan worden als gevolg van onjuiste vouwen of gewijzigde mensenhandel. In een dergelijk geval kan het nuttig zijn om uit te vinden of het kanaal correct trafieken naar de oppervlakte met behulp van een biotinylatie assay of immunofluorescentiekleuring tegen extracellulaire tag (zonder cel permeabilisatie) tussen niet-functionele kanalen onderscheiden op het plasmamembraan en kanalen behouden in de cel . Tot slot is het raadzaam om te onderzoeken, niet alleen basale activiteit van het kanaal, maar ook de gevolgen van de mutatie op het kanaal regelgeving. Verschillende mechanismen van de modulatie van het kanaal functie kan worden bestudeerd, afhankelijk van het ionkanaal van belang, met inbegrip regulering door G-eiwitten, PIP2, ionen, ATP-concentratie, fosforylering (met behulp van tyrosine, serine of threonine mutatie), ubiquitinering of sumoylation (met behulp van lysine mutatie) en directe kanaal openers of blokkers.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Chemicaliën	Sigma	Varieert
Mini Prep Kit	Qiagen	27104
Radiacwash	Biodex	005-100
Poly-D-lysine hydrobromide	BD Biosciences	CB40210	Poly-L-lysine kan ook worden gebruikt
Maxi Prep Kit	Qiagen	12263
QuickChange XL II Site Directed Mutagenesis Kit	Stratagene	200512-5
Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668-027
Dekglasjes ˆ… 12 mm	Warner Instruments	CS-12R
Capillaire glazen buisjes borosilicaat-standaard wand	Warner Instruments	G150-3
Inverteerde fluorescentiemicroscoop	Leica	DMI3000 B
Elektrofysiologie	Nikon/ Leica/ Zeiss	Elke inverteerde DIC (Hoffmann) microscoop met fluorescentie
Versterker	Molecular Devices	Axon Axopatch 200B versterker
Perfusiessysteem	Warner Instruments	VC-6 Perfusie MM-6
Digitizer	Molecular Devices	Digidata 1320 digitizer
Manipulatoren	Sutter Instruments	Manipulator: MP-85
Elektrodetrekker	Narishige	PC10 verticale elektrodetrekker
Isolatietafel	Technical Manufacturing Corporation	Luchttafel