Methodenartikel

Slice Voorbereiding, organotypische Tissue kweken en Luciferase Opname van Klok gen-activiteit in de suprachiasmatische kern

36.4K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/2439

⸱

15 februari 2011

 ,  ,  , 
1Swedish Medical Nanoscience Center, Department of Neuroscience, Karolinska Institutet

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

De procedure van de voorbereiding plakjes met de volwassen muis hypothalamus suprachiasmatische nucleus (SCN), en een snelle manier om de cultuur van de SCN weefsel in organotypische cultuur staat, worden gerapporteerd. Verder is de meting van oscillerende klok gen-eiwitexpressie het gebruik van dynamische luciferase reporter-technologie beschreven.

Samenvatting

Een centrale circadiane (~ 24 uur) klok coördineren van de dagelijkse ritmes in de fysiologie en gedrag bevindt zich in de suprachiasmatische kern (SCN) in de voorste hypothalamus. De klok wordt direct gesynchroniseerd door het licht via het netvlies en de oogzenuw. Circadiane trillingen worden gegenereerd door interactie negatieve feedback loops van een aantal zogenaamde "clock genen" en hun eiwitproducten, inclusief de periode (Per) genen. De kloksnelheid is ook afhankelijk van membraan depolarisatie, calcium en cAMP 1. De SCN geeft dagelijkse schommelingen in de klok genexpressie, metabolische activiteit en spontane elektrische activiteit. Opvallend is dat deze endogene cyclische activiteit blijft in volwassen weefsel plakjes van de SCN 2-4. Op deze manier kan de biologische klok goed worden bestudeerd in vitro, waardoor moleculaire, elektrofysiologische en metabolische onderzoeken van de pacemaker functie.

De SCN is een kleine, goed gedefinieerde bilaterale structuur ligt direct boven het optische chiasma 5. In de rat bevat ~ 8.000 neuronen in elke kern en heeft afmetingen van ongeveer 947 micrometer (lengte, rostrocaudal as) x 424 micrometer (breedte) x 390 micrometer (hoogte) 6. Te ontleden van de SCN is het noodzakelijk om de hersenen slice gesneden op de specifieke niveau van de hersenen waar de SCN kan worden geïdentificeerd. Hier beschrijven we de te ontleden en te snijden werkwijze van de SCN, die vergelijkbaar is voor de muis en rat hersenen. Verder laten we zien hoe de cultuur van de opengesneden weefsel organotypically op een membraan 7, een techniek ontwikkeld voor de SCN weefselkweek door Yamazaki et al.. 8. Tot slot laten we zien hoe transgene weefsel gebruikt kan worden voor het meten van de expressie van genen klok / eiwitten met behulp van dynamische luciferase reporter-technologie, een methode die oorspronkelijk voor de circadiane metingen worden gebruikt door Geusz et al.. Negen. Wij hier gebruik van SCN weefsels van de transgene knock-in periode2:: luciferase muizen geproduceerd door Yoo et al. 10.. De muizen bevatten een fusie-eiwit van de periode (PER) 2 en de vuurvlieg enzym luciferase. Wanneer PER2 wordt vertaald in de aanwezigheid van het substraat voor luciferase, dat wil zeggen luciferine, kan de PER2 uitdrukking te worden gecontroleerd zoals bioluminescentie als luciferase katalyseert de oxidatie van luciferine. Het aantal geëmitteerde fotonen correleert positief bij aan de hoeveelheid geproduceerde PER2 eiwit, en de bioluminescentie ritmes overeen met de PER2 eiwit ritme in vivo 10. Op deze manier de cyclische variatie in PER2 expressie kan doorlopend worden gecontroleerd real time gedurende vele dagen. Het protocol volgen we voor het kweken van weefsel en real-time bioluminescentie opname werd grondig beschreven door Yamazaki en Takahashi 11.

Protocol

1. Bereiding van oplossingen

  1. Kweekmedium met air-buffercapaciteit
    1. Vul een 1 liter fles met circa 800 ml steriele H 2 O (geautoclaveerd milliQ H 2 O).
    2. Tijdens het roeren, toevoegen en mengen volgende stoffen: een container lage glucose, serum-vrij DMEM 2902 poeder zonder natriumbicarbonaat en fenol rood (fenol rood interfereert met de bioluminescentie signaal), 20 ml B27 supplement 50x, 4,7 ml van een 7,5% NaHCO 3 oplossing (of 0,35 g NaHCO 3), 10 ml HEPES 1M, 2,5 mL Penstrep 10.000 U / ml en 3,5 g D-glucose. Laat het medium roer tot de ingrediënten zijn volledig is opgelost.
      Het uiteindelijke medium (1 liter) zal bevatten:
      1x DMEM, 1x B27 supplement, 4,2 mM NaHCO 3, 10 mM HEPES, 25 U / ml penicilline, 25 U / ml streptomycine en 19 mM D-glucose.
    3. Breng de pH tot 7,2, met behulp van NaOH te verlagen of HCl om de pH te verhogen, en het volume aan te passen aan 1 liter met steriele H 2 O.
    4. Pas osmolaliteit met H 2 O (afname osmolaliteit) of D-glucose (toename osmolaliteit). De osmolaliteit moet tussen de 285-315 mOsm / kg, maar het optimale bereik is 300 tot 310 mOsm / kg. Niet om het medium meer dan 5% te verdunnen.
    5. Filter het kweekmedium met behulp van Corning steriele vacuümfiltratie sets (bijv. 2 x 500 ml met een poriegrootte 0,22 pm) in een steriele kap. Houd het medium in 4 ° C en beschermen tegen licht met behulp van aluminiumfolie. Wij raden aan dat het medium wordt gebruikt binnen 3 maanden.
  2. Gebalanceerde zout Hank's oplossing (HBSS) buffer met supplementen (voor het snijden van plakken)
    1. Vul een 1 liter glazen fles met ~ 600 ml steriele (geautoclaveerd milliQ) H 2 O en voeg de volgende stoffen: 100 ml HBSS 10x voorraad, 10 ml penicilline-streptomycine 10.000 E / ml, 5 ml van een 7,5% NaHCO 3 oplossing en 10 ml HEPES 1M.
      De uiteindelijke snij-oplossing zal bevatten:
      1x HBSS, 10 mM HEPES, 4,5 mM NaHCO 3, 100 U / ml penicilline en 100 U / ml streptomycine.
    2. Controleer de pH en, indien nodig, de pH instellen op 7,2 en breng het volume tot 1 liter met steriele H 2 O.
    3. Controleer osmolaliteit, die moet worden tussen de 285 tot 315 mOsm / kg.
    4. Koel de HBSS tot 4 ° C. De HBSS buffer moet zeer koud (4 ° C) tijdens het snijden / knippen procedure om naar beneden te brengen van de stofwisseling en het behoud van levensvatbaarheid van het weefsel.

2. Voorbereidingen voor het snijden en het kweken Slices

  1. De weefsels worden gekweekt in een warme droge kamer zonder CO 2. Om te voorkomen dat uitdroging de culturen moeten worden afgedicht met deksel bril bevestigd aan de gerechten door vet. Voor dit doel, vul dan 5 ml spuiten met siliconen op basis van vacuüm vet. Bedek de spuit tips met kleine stukjes aluminiumfolie en autoclaaf ze. Ook autoclaaf papieren filters (gebruikt tijdens het snijden procedure).
  2. Vlak voor het snijden van de procedure, van toepassing geautoclaveerd vacuum vet op de bovenste ring oppervlak van 35 mm petrischaaltjes. Maak een aparte petrischaal voor elk segment cultuur.
  3. Voordat u begint met het snijden van de procedure alle niet-steriele instrumenten, scheermesjes, vibratome bladen, dekglaasjes en ander materiaal dat wordt gebruikt voor het segment en de cultuur procedure moeten worden gesteriliseerd. Spray alle niet-steriele apparatuur met 70% ethanol. Expose de instrumenten en de ingevette petrischaaltjes met UV in een steriele kap voor ten minste 30 minuten blootstelling aan UV voor de kweek.
  4. Op hetzelfde moment, vul een Falcon buis met lucht-buffering kweekmedium (count 1,2 ml voor elke cultuur, voor 8 culturen voor te bereiden op bijvoorbeeld 10 ml medium) en voeg vers ontdooide luciferine (0,1 M voorraadoplossing, Promega, Madison, WI) (10 pL luciferine tot 10 ml medium; uiteindelijke concentratie 0,1 mM).
  5. De luciferine is lichtgevoelig en zowel de voorraad oplossingen en de luciferine-bevattend medium moeten worden beschermd tegen licht. Plaats de Falcon buis met luciferine-medium in een donkere 36-37 ° C verwarmen kamer. Indien nodig, kan de luciferine ook direct worden toegevoegd aan de cultuur gerechten op het moment van snijden. Als luciferine wordt niet toegevoegd, zal er geen licht reactie tussen luciferase en luciferine en dus geen signaal van het weefsel.
  6. Na blootstelling aan UV, bevestig een steriel mes op de vibratome.

3. SCN Snijden Procedure

De volgende procedure beschrijft het snijden van volwassen, meestal 2-4 maanden oud, C57/BL6 muizen. Let op: de snij-procedure, evenals de blootstelling aan licht van het dier 's nachts, kan differentieel reset de fase van de SCN. Om dit te voorkomen moet het snijden en het kweken worden uitgevoerd tijdens de licht uren, bij voorkeur tussen ZT 6-12, wanneer er geen wezenlijke fase verschuivingen als gevolg van de procedure plaatsvinden 12. Als SCN moet worden bemonsterd in de duisternis, 3.1 en 3.2 moeten worden uitgevoerd in rood licht, of met nachtkijkers aan het licht-geïnduceerde fase-verschuivingen te voorkomen.

  1. Bij voorkeur verdoven de muis door isofluorane (Baxter) in een GLAss kamer. Wanneer het dier zijn pijn reflexen (controleren door te knijpen met de nagels in de poot) verloren, maar is nog niet gestopt met ademen (om zuurstof te houden zo lang mogelijk), snel onthoofden het hoofd met een schaar of iets dergelijks.
    Let op: in sommige landen CO 2 blootstelling (hypercapnie) is nog steeds toegestaan ​​als verdovingsmiddel methode, hoewel het is gemeld aan dier-angst te bevorderen. Daarnaast kunnen cervicale dislocatie nodig zijn voor de onthoofding. Volg de plaatselijke wetgeving als euthanasie dieren.
  2. Verwijder de ogen van het hoofd met een schaar om de spanning en de verdere prikkeling van de optische zenuwen, die de SCN kan schade te voorkomen.
  3. Indien nog steeds verbonden, verwijder de laatste cervicale gewervelde met een schaar, verwijder de huid (afb. 1a) en maak twee sneden met een fijne schaar (bijvoorbeeld iris schaar), een afgesneden aan elke kant van de schedel langs de zijkanten, waardoor een verwijderbaar "deksel".
  4. Open de schedel met een micro rongeur tool (fijn ontleden van een schaar kan ook gebruikt worden op een muis) en verwijder alle bot tot de olfactorische lampen kan worden gezien. Het werk naar boven, nooit te drukken de hersenen met de tool, om beschadiging van de ventrale SCN (afb. 1b) te voorkomen.
  5. Knip voorzichtig de oogzenuw tussen de olfactorische bollen en de hemisferen met behulp van fijne micro ontleden voorjaar schaar. Zorg ervoor dat de zenuw volledig is afgesneden, omdat die zich uitstrekt van de oogzenuw kan leiden tot schade aan de SCN en gescheurde plakjes.
  6. Draai het hoofd ondersteboven en laat de intacte hersenen eruit vallen (indien nog aan de hersenen, andere hersenzenuwen kan nodig zijn om caudaal worden gesneden om de oogzenuw) in een container (bijvoorbeeld een glazen petrischaal ≈ 10 cm) gevuld met 50-100 ml koud HBSS, waardoor een snelle afkoeling van de hersenen. Idealiter zou de twee oogzenuwen blijven intact (afb. 1c). Houd de hersenen in de HBSS 30-60 seconden om ervoor te zorgen dat de hersenen gekoeld.
  7. Gebruik een lepel of dergelijke en plaats de gekoelde hersenen, dorsale oppervlak tot op een steriele snij-oppervlak (bijvoorbeeld een glazen petrischaal deksel op zijn kop zette). Met het oog op een coronale snede te bereiden, maak een loodrechte snede dicht met steriele scheermesjes of scalpels tussen de hersenhelften en de kleine hersenen, waardoor het verwijderen van de kleine hersenen.
  8. Toe te passen secondelijm op de droge-platform die behoren tot de vibroslicer / vibratome.
  9. Pak de hersenen (hersenhelften zonder cerebellum en zonder olfactorische gloeilampen) door het invoegen van een scherpe, gebogen tangen in de rostrale deel en voorzichtig droog uit de HBSS op een steriele filter papier, nog steeds de hersenen met de tang. (In plaats van het invoegen van een pincet, een klein stukje van de steriele filter papier kan worden gebruikt voor het bevestigen en overdracht van de hersenen).
  10. Bevestig de hersenhelften op de gelijmde platform met de rostrale tip omhoog en ventrale oppervlak het dichtst bij de mes. Bevestig het platform in de houder die behoren tot de vibratome (bijvoorbeeld uit Campden Instruments, Verenigd Koninkrijk) en onmiddellijk vul het met koud HBSS. Als de loodrechte snede correct zijn, moet de hemisferen rechtop staan ​​en zo een goede hoek nodig zijn voor het maken van een coronale snede met de bilaterale SCN.
  11. Met het oog op het doel SCN gebied te bereiken, start het afsnijden van dikkere secties (500-800 um) van de hersenhelften bij hoge of een maximale snelheid van de vibratome. Verplaatsen van het blad kan vrij snel in het begin voor het bereiken van de hypothalamus, maar moeten worden vertraagd wanneer de optische chiasma zichtbaar (hoge frequentie van de trillende blad en langzame beweging horizontaal neemt celbeschadiging tijdens het snijden, waardoor slice levensvatbaarheid). Verminder de secties tot 100 urn wanneer de optische chiasma wordt groter (breder) en de voorste commissura kleiner wordt. Met het oog op een mid-SCN sectie verwerven, werk zelf "down" (caudale richting) tot aan de twee kernen SCN beginnen te verschijnen. Een vergrootglas kan nodig zijn voor het visualiseren van de kernen. Let op: de SCN in de hersenen van muizen ligt meer caudaal van de optische chiasma ten opzichte van de hersenen van de rat.
  12. Wanneer het gewenste niveau van SCN is bereikt (de SCN zal verschijnen op dit punt meer gedefinieerd, rond of amandelvormig structuren; figuur 1d, ongeveer Bregma-+0,46--0,70 mm voor het centrum gebied van de SCN in muis 13, Bregma - +0,92 tot -1,40 mm voor rat 14), knip de SCN sectie (afb. 1e). Geschikte dikte van het schijfje is voor muis 250 ± 50 micrometer, voor rat 350 ± 50 um.
  13. Met een zachte borstel, een lift en overdracht van de SCN slice om een ​​deksel van een middelgroot petrischaal gevuld met koud HBSS, geplaatst onder een microscoop of dissectie stereoscoop. Controleer onder vergroting of de bilaterale SCN is duidelijk zichtbaar. Als het midden van de regio van de SCN zal worden gekozen (die niet noodzakelijkerwijs de enige "optimale" slice-niveau, maar dat we overwegen is de gemakkelijkste manier om het snijden procedure te standaardiseren en te verminderen variatie), moet het duidelijk te zien op zijn minst op de ene kant van deslice sectie. Als de cut was te rostraal, maak een andere sectie en controleren op de SCN onder vergroting.

4. Organotypische SCN Cultuur

  1. In de petrischaal deksel gevuld met HBSS, ontleden de bilaterale SCN als een vierkant weefsel (~ 1.5 mm aan iedere kant) met een paar steriele scalpels onder een dissectie microscoop. Een klein stukje van de optische chiasma zal gehecht blijven aan de explantatie, maar geen andere kernen moeten worden opgenomen. Snijd zo dicht mogelijk zonder het verwijderen van SCN weefsel.
  2. Indien van toepassing voor de geplande experiment, kan de bilaterale SCN dan worden gehalveerd tot twee eenzijdige SCN te verkrijgen. Een eenzijdige SCN kan dan worden gebruikt als controle (afb. 2a).
  3. Vul 1200 pi van de luciferine-medium in een ≈ 35 mm petrischaal en plaats een cultuur membraan (Milli-CM 0,4 micrometer, Millipore, Bedford, MA) op de top van het vloeistofoppervlak (2b). Het kweekmedium volume is van cruciaal belang, omdat de cultuur membraan moet goed zitten op de basis van de cultuur schotel, niet zweven of steen in het medium 11. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen onder het membraan. Vermijd onnodige blootstelling aan licht bij het werken met luciferine.
  4. De explantaten zijn klein en moeilijk te halen. Daarom gebruik maken van een 1000 pi pipet + tip voor de SCN explantatie zuigen in de punt en druk de op het membraan. In het geval de explantatie is te groot om gemakkelijk in een 1000 pi pipettip (bv. rat SCN, en de muis bilaterale SCN) de tip kan worden gesneden met een steriel hulpmiddel om een ​​bredere opening creëren. Gooi overmatige HBSS op het membraan met de pipet. Voor het opnemen van luciferase, plaats maar een SCN / schotel (afb. 2b) als de opname buizen detecteren alle fotonen die uit de schotel en geen onderscheid maken tussen signalen van verschillende weefsels.
  5. Sluit de schotel met een deksel glas (≈ 40 mm, Menzel-Glaser, Duitsland) en vacuüm vet (Dow Corning Corp, USA) 11. Zorg ervoor dat de afdichting strak is (afb. 2c). Zo niet, afdichting met meer vet.
  6. Breng de schalen in een 36-37 ° C lichtdichte kamer en direct aan de slag PMT-opnames.

5. Meting van luciferase-activiteit door de Recording Bioluminescentie

Luciferase-geïnduceerde bioluminescentie signalen van de kleine SCN weefsel worden gedetecteerd en versterkt met photonmultiplier-tube (PMT) detector assemblages gemonteerd in een lichte strakke kamer. De PMT's zijn normaal gepositioneerd ~ 1-2 cm boven de cultuur gerechten 8. PMT opname instellingen kunnen op maat worden gemaakt of zijn commercieel verkrijgbaar 11.

  1. Zet de schaal in een PMT (de warmte die uit de PMT zal condensatie te verwijderen op de cover glas) en sluit de kamer. Zorg ervoor dat de kamer is 100% licht-strak als de donkere graaf van PMT's gebruikt worden voor SCN weefsels is zeer laag (minder dan 20 fotonen / min). De PMT's detecteren, zelfs de zwakste licht lekkage.
  2. Start de data-acquisitie, die wordt uitgevoerd met software (bijvoorbeeld LumiCycle, Actimetrics Inc, Wilmette, IL, USA). Foton telt zijn geïntegreerd over 10-10 min interval een hoge resolutie van het gen / eiwit expressie te krijgen.
  3. Nadat de opname is voltooid, kan de verkregen circadiane expressie van het gen / eiwit geanalyseerd worden met de juiste software (Origin, OriginLab, Northampton, MA, Verenigde Staten, ClockLab, Actimetrics, LumiCycle, Actimetrics Inc; Chrono, Till Roenneberg, Universiteit van München, München, Duitsland) naar fase, periode (tijd voor een cyclus) en de amplitude van het ritme te bepalen. De piek expressie van gen-of eiwit wordt meestal gebruikt als referentiepunt en wordt gedefinieerd als de hoogste foton telling gedurende een cyclus. De gegevens kunnen worden gladgestreken voordat analyses van fase, periode en amplitude, vooral als de signaal / ruis-verhouding laag is. De baseline soms veranderingen en moeten worden afgetrokken voordat de analyses worden uitgevoerd.

6. Representatieve resultaten:

Wij hier presenteren de oscillerende PER2:: LUC expressie als een uit te lezen voor de levensvatbaarheid en de toestand van de gekweekte weefsel. Onder optimale omstandigheden, en als het weefsel leeft, de PER2:: LUC expressie oscilleert met een circadiaan ritme, zoals aangegeven in figuur 3. PER2 in de SCN is maximaal typisch uitgedrukt rond Zeitgeber Tijd 12-13 (waar ZT 12 vertegenwoordigt lichten uit in een 12:12 uur licht: donker cyclus). Hoe groter in omvang het levend weefsel is, des te hoger het foton tellen wordt. Echter, de grootte en dikte van organotypically gekweekte weefsel worden klein gehouden in stand te houden het weefsel levensvatbaar, bij voorkeur niet groter dan 15 mm 2 11 en niet dikker dan 500 micrometer 7. De SCN, indien ontleed zoals hier beschreven, meestal laat foton telt tussen 10.000-40.000/min als het weefsel wordt bemonsterd uit een homozygote PER2:: LUC dier. De amplitude van de trilling in organotypische SCN culturen is meestal zeer hoog tijdens de eerste cyclus in vergelijking met de volgende cycli. Het is niet geheel duidelijk waarom de eerste cyclus zeer hoge Verst heeftUde. Een mogelijke verklaring is dat een aanzienlijk deel van de cellen in het weefsel kort kunnen sterven na de eerste snijden en kweken, dus niet gebruik te maken van luciferine na de eerste cyclus. Het snijden procedure kan ook leiden tot excessieve excitatie, die het luciferase signaal tijdens de eerste cyclus zou kunnen versterken.

Figuur 3 toont luminescentie sporen van SCN plakken en bevat een trace (rood), verkregen uit een plakje dat niet was in eerste instantie gezond. Dood of ongezond weefsels hebben een laag foton tellen basislijnen. (Daarnaast, dode weefsels vaak dissociëren in de schaal en kan niet worden verwijderd van het membraan in een stuk.)

De techniek wordt beschreven in dit rapport kan heilzame worden gebruikt in farmacologische experimenten. Figuur 4 toont een spoor van een cultuur die we tussen dag 1 en 2 behandeld met een HCN-blokker (ZD7288, 10 uM). Zoals te zien is in de figuur en zoals eerder 15 gepubliceerd, de blocker aanzienlijk verminderd de amplitude van de circadiane oscillatie van PER2, maar na het wassen met een normale kweekmedium de oscillatie kwam terug, waaruit blijkt dat de blocker de moleculaire klok getroffen, maar de weefsel was levensvatbaar en gezond.

Figuur 1
Figuur 1. Het snijden van de procedure
A) Het hoofd van een onthoofde muis gedood met de ogen en de huid verwijderd. B) De schedel wordt verwijderd met een micro rongeur tool. Bij gebruik van het gereedschap, moet men naar boven te werken en nooit druk de hersenen met de tool. C) De hersenen zijn kop afgebeeld (ventrale zijde naar boven) zonder olfactorische lampen. De witte optische chiasma met de twee intacte oogzenuwen kan worden gezien. De suprachiasmatische kern (SCN, de grenzen gemarkeerd met rood) ligt dicht bij de optische chiasma bevindt. D) een coronaalwaarts gesneden hersenen verbonden aan het platform in de vibroslicer, op het niveau van SCN. E) coronale hersenen sectie (250 um dik) met de optische chiasma (OC), derde ventrikel (3V) en de bilaterale suprachiasmatische kernen (SCN).

Figuur 2
Figuur 2. Organotypische weefsel kweken.
A) De twee eenzijdige SCN kernen (insert) ontleed van de slice getoond. B) Cultuur schaal (35 mm petrischaal) met cultuur membraan, medium en explantatie, maar zonder vacuum vet en dekglas. Het medium (1,2 ml) kan gezien worden als vloeistof tussen de schotel en het membraan. Een eenzijdige SCN kern is geplaatst op de cultuur membraan. De witste deel van de dunne weefsel is een stuk van de optische chiasma (insert). C) De cultuur schotel met haar membraan en de SCN weefsel, verzegeld met vacuüm vet en een ronde deksel glas.

Figuur 3
Figuur 3. Bioluminescentie opnames van gezonde en niet-gezond SCN weefsel culturen.
Voorbeelden van bioluminescentie opnames van periode2:: luciferase (PER2:: LUC) uitdrukking in suprachiasmatische nucleus (SCN) plakken verkregen van muizen die in een 12u: 12u licht: donker cyclus. De PER2:: LUC eiwit oscilleert met een circadiane (~ 24 uur) variatie, waarin de maximale expressie van het eiwit plaatsvindt op Zeitgeber moment 12-13. Zo is de fase van het gen ritme is afhankelijk van de licht-donker schema waarin het dier werd gehouden voor opgeofferd. Typisch, bioluminescentie van eenzijdige SCN weefsel ontleed zoals beschreven in het protocol laat zien foton telt tussen ~ 10.000-40.000/minute. De figuur toont sporen van een gezonde (zwart) SCN cultuur, een niet-gezonde SCN cultuur (rood) en een SCN-cultuur, die uitgedroogde (blauw) na het openen van de verzegelde cultuur schotel op dag 4 en niet opnieuw het afdichten van de schotel goed ( aangegeven met pijl).

Figuur 4
Figuur 4. Bioluminescentie opnemen tijdens en na de blootstelling aan het geneesmiddel.
PER2:: LUC expressie in een cultuur voor, tijdens en na de actie van een HCN-blokker (ZD7288, 10 uM). De eerste pijl geeft het moment dat de blocker werd toegevoegd. De tweede pijl geeft wash-out, die werd gemaakt door de vervanging van het geneesmiddel bevattend medium met geconditioneerde controle medium. Let op de lagere amplitude na 2 dagen van blootstelling aan het geneesmiddel, het ontbreken van de trilling op dag 4 en de snelle herstel van het eiwit ritme na de wash-out.

Discussie

Voor-en nadelen met een luciferase reporter-technologie

In tegenstelling tot ex vivo methoden, zoals RT-PCR, in situ hybridisatie en Western blot dat weefselmonster nodig zijn op veel verschillende tijdstippen (het geven van een lage tijdsresolutie van normaal 2-4 uur afhankelijk van de sampling frequentie) om dagelijkse studie variaties in genen en proteïnen uitdrukkingen, de luciferase reporter technologie maakt het mogelijk een hoge resolutie (1-10 min) studies van de circadiane oscillaties gedurende vele dagen in dezelfde voorbereiding. Zo is het aantal gebruikte dieren tot een minimum beperkt en de gedetailleerde studies van de effecten op de fase en periode van het ritme haalbaar zijn, die normaal niet mogelijk is met behulp van conventionele steekproeven met een lage tijdsresolutie. Hoewel de relatieve amplitude metingen van het ritme zijn mogelijk, moet worden benadrukt dat de verslaggever technologie niet kwantitatief is en kan daarom niet worden gebruikt om de hoeveelheden van getranscribeerd genen of vertaald eiwitten te meten.

Het weefsel opnamen kunnen worden gestart en geanalyseerd onmiddellijk na het kweken, een groot voordeel voor het direct het bestuderen van moleculaire effecten van in vivo stress, in vivo licht-geïnduceerde fase-verschuivingen etc. De organotypische SCN cultuur staat lange-termijn (weken) farmacologische manipulatie van volwassen hersenen weefsel met een intacte volwassen synaptische netwerk en de luciferase reporter technologie maakt het mogelijk een stabiele opnames voor vele weken. Zo werkt het weefsel niet te neonatale of vroege postnatale worden om gezond te culturen te krijgen, en in tegenstelling tot de acute slice chronische farmacologische behandelingen kunnen worden uitgevoerd. In tegenstelling tot plasmide-reporter transfecties in celkweken, die geen leiden tot opname van DNA in het genoom, de transgene luciferase-diermodellen (evenals Lenti-virus transfecties) zijn gunstig als epigenetische veranderingen dienen te worden bestudeerd. Het moet in deze context ook worden vermeld dat luminescentie beeldvorming tegenwoordig mogelijk is met zeer gevoelige CCD-camera's 11, zodat opnames ook in single SCN neuronen (~ 60-10 micrometer) en andere celtypen, gebruikt door grote laboratoria het bestuderen van circadiane ritmes. Tot slot, een aantal circadiane onderzoekers vaak gebruik van de controle van moleculaire expressie met behulp van andere verslaggevers, zoals de Green Fluorescent Protein, om de klok gen / eiwit schommelingen 16-19 bestuderen.

Aspecten van de slice dikte

De hier aanbevolen dikte van de SCN slice (200-300 micrometer) kan worden verlaagd of verhoogd indien gewenst. Hoewel het weefsel vlakker op het membraan na een paar dagen in cultuur, is het niet aan te raden om 500 um dikte van de oorspronkelijk gesneden plakje overschrijden, om de levensvatbaarheid van het weefsel 7 te behouden. Een stuk dunner dan 100 micrometer is van mechanische en praktische redenen moeilijk te hanteren. Omdat de SCN weefsel is heterogeen de dikte van het schijfje kan de fase van het luciferase uitgangssignaal van invloed zijn, aangezien verschillende regio's binnen de SCN (bijvoorbeeld de "kern" versus de "shell", en dorsale versus ventrale regio's) oscilleren met de verschillende fasen 20 en differentieel opnieuw te synchroniseren na faseverschuivingen 21. De dikte van de slice beïnvloedt ook de baseline van foton tellen sinds meer weefsel geeft een groter aantal fotonen. De amplitude van moleculaire trillingen kan op deze wijze indirect worden beïnvloed door de grootte van de explantatie. Om deze redenen, moeten controle en behandelde culturen steeds van dezelfde grootte, dikte en waarin de regio van SCN in om te oscilleren in dezelfde fase en met dezelfde amplitude. De twee eenzijdige kernen, aan de andere kant, oscilleren in fase met elkaar en met gelijke amplitudes zolang de vibratome cut is horizontaal en niet schuin (die op zijn beurt afhankelijk is van dat de scheiding tussen cut cerebellum en de twee hersenhelften is loodrecht naar de tafel oppervlak). Een onderzoeker die uitvoert SCN kweken zou kunnen ervaren dat SCN culturen niet in fase oscilleren met elkaar. Oefenen en standaardisatie van het snijden techniek, dat wil zeggen de plakjes gesneden worden altijd op dezelfde rostro-caudale niveau van de SCN, zal de uitkomst.

Kritische stappen

  1. Zuurstoftoevoer is van cruciaal belang.
    Omdat de hersenen vergt veel van de zuurstof 22, het snijden procedure dient te worden snel (Hoe dichter 3.1-3.10 is ~ 5-6 minuten hoe beter het is in stand te houden het weefsel gezond).
  2. De SCN is gevoelig voor temperatuurschommelingen en medium uit te wisselen.
    De SCN is temperatuur gevoelig en grote temperatuurverschillen kunnen fase verschuiving van de pacemaker en de oorzaak experimentele artefacten 23. Als het medium of oplossingen worden uitgewisseld of toegevoegd tijdens een lopend experiment, bijvoorbeeld bij de toepassing van een geneesmiddel na een paar dagen in de cultuur, het medium of solution moet worden voorverwarmd tot 36-37 ° C (dezelfde temperatuur als in de kamer) voordat toevoeging. In farmacologische experimenten die medium uitwisselingen te betrekken, is het belangrijk om altijd te werken met pre-conditioning celcultuurmedium. Toevoeging / wash-out met verse, kan onvoorwaardelijk medium mogelijk fase verschuiving van de moleculaire SCN ritme 24 evenals andere celtype culturen 25.
  3. Medium samenstelling.
    Het is belangrijk om de cultuur van het weefsel in de juiste pH en osmolaliteit. De lucht-buffering medium bevat een grote hoeveelheid HEPES, waardoor een optimale buffercapaciteit in het bereik van pH 6.8-8.2 heeft en is ook geschikt voor het bufferen van de pH veranderingen die kunnen optreden als gevolg van de cel ademhaling. HEPES, aan de andere kant, is meer gevoelig voor temperatuur veranderingen in vergelijking met natriumbicarbonaat, die is opgenomen in kleine hoeveelheden in het kweekmedium. Natriumbicarbonaat heeft een grotere buffercapaciteit in de lagere pH (5,1-7,1) tussen 26 en, zo nodig in een CO 2 atmosfeer. Echter, hoeveelheden natriumbicarbonaat steeg in de lucht-buffering medium (DMEM 2902) verhoogt de osmolaliteit aanzienlijk en kan niet worden toegevoegd zonder tegelijkertijd het verdunnen van het medium, die op zijn beurt resulteert in de verkeerde samenstelling van aminozuren, vitaminen en ionen.
    Advies voor de voorbereiding van het medium:
    1. Nauwkeurig en zorgvuldig bij het mengen van het medium.
    2. Gebruik alleen verse of vers ontdooide stockoplossingen.
    3. In het geval van zeer hoge osmolaliteit is het niet de moeite waard te verdunnen. Meer dan 5-6% verdunde medium zal zeer waarschijnlijk niet werken. Gebruik D-glucose om te osmolariteit te verhogen als deze te laag is.
  4. Fase verschuivingen als gevolg van de voorbereidingstijd
    De tijd van slice voorbereiding is van cruciaal belang. Geen of minimale effecten op fase wordt verkregen als de slice procedure wordt uitgevoerd tussen ZT 06 tot 12 december. Alle slice dissecties moet worden uitgevoerd in dezelfde fase van de dagelijkse of circadiaanse cyclus, ter fout te wijten aan variatie fase tussen de voorbereidingen te minimaliseren.

Eventuele wijzigingen

  1. Voor acute SCN elektrofysiologie, het snijden moet worden uitgevoerd met een Ringer (Artificial Cerebro Spinal Fluid; ACSF) buffer, verzadigd met zuurstof (95% O 2, 5% CO 2) voor het snijden begint. Verder, zuurstof moet continu worden toegevoegd aan de buffer gedurende de gehele procedure snijden, zoals de elektrische en synaptische activiteit is direct afhankelijk van de zuurstoftoevoer 22.
  2. Horizontale en sagittale sneden kan ook goed worden voorbereid en gekweekt van de SCN. De auteurs hebben ervaring met luciferase-opnamen in horizontale plakken, die circadiane oscillaties grond van onze ervaring te geven met een lagere amplitude in vergelijking met de coronale snede.
  3. De SCN is ongeveer 1 mm lang rostro-caudaal en het snijden van techniek hier beschreven is gericht op het verwerven van een SCN gedeelte in de centrale regio. Er kan echter meer dan een SCN sectie worden verkregen bij muizen en ratten de hersenen, waardoor het onderzoek van de circadiane gen / eiwit-expressie bij meer rostraal versus caudale niveaus van de SCN kern.
  4. Slice culturen van jongere dieren, postnatale pups of zelfs embryo's, kunnen ook worden bereid. Houdt u er rekening mee dat de hersenen en de schedel bij zeer jonge pups zijn erg zacht en gevoelig. Daarnaast is de oogzenuw is dun en niet volledig ontwikkeld. Wees voorzichtig bij het ontleden van de hersenen van de pups, zodat de SCN regio is niet beschadigd. Zo kan micro rongeur tools niet worden gebruikt om de schedel van de muis pups te openen, omdat ze te groot zijn. Fijne schaar zijn voldoende om de zachte weefsels gesneden bij jonge pups.
  5. De dekking van glas gebaseerde cultuur techniek die hier beschreven kan ook worden gebruikt om de afbeelding luminescentie met behulp van een CCD / EM-CCD-camera, ook in single SCN neuronen.
  6. Andere centrale zenuwstelsel regio's en perifere weefsels organen van transgene PER2:: LUC dieren kunnen gemakkelijk worden verkregen, gekweekt en geanalyseerd in termen van moleculaire trillingen, zoals de PER2:: LUC expressie blijft ook oscilleren vele dagen in een aantal andere weefsels en celtypes 10. De meeste van deze perifere weefsels, bijvoorbeeld de lever, niet nodig een membraan om te overleven, maar in plaats daarvan gekweekt direct badend in het medium 11. Houdt u er rekening mee dat faseverschuiving als gevolg van snijden, het kweken en medium-uitwisseling niet kunnen dezelfde principes volgen als bij SCN.

Betekenis

In de transgene muizen en ratten stammen (mPER2:: LUC; mPer1-luc 8, 10, 27) luciferase enzymactiviteit weerspiegelt eiwit of genexpressie ritmes en kan worden beoordeeld door bioluminescentie opname. De luciferase gegenereerde bioluminescentie geeft een zwak signaal, maar de achtergrond luminescentie dicht bij nul, het maken van deze methode voordelig. Bovendien, omdat het luciferase molecuul is onstabiel en snel afgebroken er is geen phototoxiciteit, die kunnen verschijnen tijdens de lange termijn prikkelende verlichting 28. Tezamen bieden deze eigenschappen kan langdurige experimenten maken van de luciferase reporter-technologie zeer voordelig in het circadiane onderzoek.

Openbaarmakingen

Geen belangenconflicten verklaard.

Dankbetuigingen

Dit werk werd gefinancierd door de Zweedse Medical Research Council (K2009-75SX-21.028-01-3, K2008-61X-20700-01-3); FONCICYT 000000000091984, de fundamenten van Jeansson, Söderström Königska sjukhemmet, Märtha Lundqvist en Sigurd och Elsa Goljes Minne, en de Zweedse Society of Medicine SLS-95151. Professor Gene D. Block, UCLA, wordt bedankt voor waardevolle commentaar op het manuscript. Wij danken dr. Michael Andäng en dr. Helena Johard voor de HCN-blokker, en Prof Abdel El-Manira voor het aanbieden van video-microscoop.

Ethische overwegingen:

Alle experimenten op dieren zijn uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen en voorschriften uiteengezet door Karolinska Institutet en "Stockholm Norra Djurförsöksetiska Nämnd" set. Alle dierproeven worden uitgevoerd met de bedoeling om eventuele stress of ongemak voor het dier te minimaliseren.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
B27 supplement 50xInvitrogen17504-044
DekglasjesMenzel-Glaser40#1≈ 40 mm
KweekmembranenEMD MilliporePICMORG500.4 μm
DMEM lage glucose z/o fenolroodSigma-AldrichD2902Poeder voor 1L
FilterpapierWhatman, GE Healthcare1003 055≈ 55 mm
FiltratiesetCorning431097Poriegrootte 0.22 μm Polyethersulfon
PincetAllgaier Instrumente0203-7-PSDumant #7
HEPESInvitrogen15630-056100 ml
HBSS 10xInvitrogen14065-049500 ml
NaOCH3 7.5%Invitrogen25080-06050 ml
LuciferinePromega Corp.E1602Keverluciferine, kaliumzout
Micro-rongeurAllgaier Instrumente332-097-140
PenStrep 10.000 U/mlInvitrogen15140-122100 ml
PetrischalenCorning430165≈ 35 mm
PMTHamamatsu Corp.H9319-11MOD
WegwerpscalpelsParagonP503Maat 11
VacuümfilterFisher Scientific09-761-5
VacuümvetDow Corning50 g
VibratoomCampden Instruments

Referenties

  1. Welsh, D. K., Takahashi, J. S., Kay, S. A. Suprachiasmatic nucleus: cell autonomy and network properties. Annu Rev Physiol. 72, 551-577 (2010).
  2. Green, D. J., Gillette, R. Circadian rhythm of firing rate recorded from single cells in the rat suprachiasmatic brain slice. Brain Res. 245, 198-200 (1982).
  3. Shibata, S., Oomura, Y., Kita, H., Hattori, K. Circadian rhythmic changes of neuronal activity in the suprachiasmatic nucleus of the rat hypothalamic slice. Brain Res. 247, 154-158 (1982).
  4. Groos, G., Hendriks, J. Circadian rhythms in electrical discharge of rat suprachiasmatic neurones recorded in vitro. Neurosci Lett. 34, 283-288 (1982).
  5. Klein, D., Moore, R., Reppert, S. The suprachiasmatic nucleus and the circadian timing system. Suprachiasmatic nucleus--The mind's clock. , Oxford University Press. New York. 13-15 (1991).
  6. Pol, A. N. V. anden The hypothalamic suprachiasmatic nucleus of rat: intrinsic anatomy. J Comp Neurol. 191, 661-702 (1980).
  7. Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J Neurosci Methods. 37, 173-182 (1991).
  8. Yamazaki, S., Numano, R., Abe, M., Hida, A., Takahashi, R., Ueda, M., Block, G. D., Sakaki, Y., Menaker, M., Tei, H. Resetting central and peripheral circadian oscillators in transgenic rats. Science. 288, 682-685 (2000).
  9. Geusz, M. E., Fletcher, C., Block, G. D., Straume, M., Copeland, N. G., Jenkins, N. A., Kay, S. A., RN, D. ay Long-term monitoring of circadian rhythms in c-fos gene expression from suprachiasmatic nucleus cultures. Curr Biol. 7, 758-766 (1997).
  10. Ko, C. H., Buhr, E. D., Siepka, S. M., Hong, H. K., Oh, W. J., Yoo, O. J., Menaker, M., Takahashi, J. S. PERIOD2::LUCIFERASE real-time reporting of circadian dynamics reveals persistent circadian oscillations in mouse peripheral tissues. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 5339-5346 (2004).
  11. Yamazaki, S., Takahashi, J. S. Real-time luminescence reporting of circadian gene expression in mammals. Methods Enzymol. 393, 288-301 (2005).
  12. Yoshikawa, T., Yamazaki, S., Menaker, M. Effects of preparation time on phase of cultured tissues reveal complexity of circadian organization. J Biol Rhythms. 20, 500-512 (2005).
  13. Franklin, K. B. J., Paxinos, G. The mouse brain in stereotaxic coordinates. , Academic Press. (1997).
  14. Paxinos, G., Watson, C. The rat brain in stereotaxic coordinates. , 4 Edition, Academic Press. San Diego. (1998).
  15. O'Neill, J. S., Maywood, E. S., Chesham, J. E., Takahashi, J. S., Hastings, M. H. cAMP-dependent signaling as a core component of the mammalian circadian pacemaker. Science. 320, 949-953 (2008).
  16. Hughes, A. T., Guilding, C., Lennox, L., Samuels, R. E., McMahon, D. G., Piggins, H. D. Live imaging of altered period1 expression in the suprachiasmatic nuclei of Vipr2-/- mice. J Neurochem. 106, 1646-1657 (2008).
  17. Zhang, D. Q., Zhou, T., Ruan, G. X., McMahon, D. G. Circadian rhythm of Period1 clock gene expression in NOS amacrine cells of the mouse retina. Brain Res. 1050, 101-109 (2005).
  18. Quintero, J. E., Kuhlman, S. J., McMahon, D. G. The biological clock nucleus: a multiphasic oscillator network regulated by light. J Neurosci. 23, 8070-8076 (2003).
  19. LeSauter, J., Yan, L., Vishnubhotla, B., Quintero, J. E., Kuhlman, S. J., McMahon, D. G., Silver, R. A short half-life GFP mouse model for analysis of suprachiasmatic nucleus organization. Brain Res. 964, 279-287 (2003).
  20. Nakamura, W., Yamazaki, S., Takasu, N. N., Mishima, K., Block, G. D. Differential response of Period 1 expression within the suprachiasmatic nucleus. J Neurosci. 25, 5481-5487 (2005).
  21. Davidson, A. J., Yamazaki, S., Arble, D. M., Menaker, M., Block, G. D. Resetting of central and peripheral circadian oscillators in aged rats. Neurobiol Aging. 29, 471-477 (2008).
  22. Croning, M. D., Haddad, G. G. Comparison of brain slice chamber designs for investigations of oxygen deprivation in vitro. J Neurosci Methods. 81, 103-111 (1998).
  23. Burgoon, P. W., Boulant, J. A. Temperature-sensitive properties of rat suprachiasmatic nucleus neurons. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 281, 706-715 (2001).
  24. Nishide, S. Y., Honma, S., Honma, K. The circadian pacemaker in the cultured suprachiasmatic nucleus from pup mice is highly sensitive to external perturbation. Eur J Neurosci. 27, 2686-2690 (2008).
  25. Yoshikawa, T., Sellix, M., Pezuk, P., Menaker, M. Timing of the ovarian circadian clock is regulated by gonadotropins. Endocrinology. 150, 4338-4347 (2009).
  26. Kohn, R. A., Dunlap, T. F. Calculation of the buffering capacity of bicarbonate in the rumen and in vitro. J Anim Sci. 76, 1702-1709 (1998).
  27. Wilsbacher, L. D., Yamazaki, S., Herzog, E. D., Song, E. J., Radcliffe, L. A., Abe, M., Block, G., Spitznagel, E., Menaker, M., Takahashi, J. S. Photic and circadian expression of luciferase in mPeriod1-luc transgenic mice in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 489-494 (2002).
  28. Sellix, M. T., Currie, J., Menaker, M., Wijnen, H. Fluorescence/luminescence circadian imaging of complex tissues at single-cell resolution. J Biol Rhythms. 25, 228-232 (2010).

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Organotypische weefselkweekpreparatie van hersensnijdenPER2 LUCIFERASE muizenbioluminescentiemetinganalyse van het circadiane ritmedetectie met fotomultiplierbuisweefselkweek op membranen
Slice Voorbereiding, organotypische Tissue kweken en Luciferase Opname van Klok gen-activiteit in de suprachiasmatische kern
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.