Techniek Biologisch-Based vaattransplantaten Met behulp van een Pulsatiele Bioreactor

Summary

Onze groep heeft een bioreactor cultuur systeem dat bootst de fysiologische pulserende stress van het cardiovasculaire systeem te regenereren implanteerbare kleine diameter vaattransplantaten.

Abstract

Veel aandacht is besteed aan de ontwikkeling en vooruitgang van de methodologie te regenereren functionele kleine diameter arteriële omzeilt. In de fysiologische omgeving, zijn zowel mechanische en chemische prikkeling noodzakelijk om de goede ontwikkeling en functionaliteit van de arteriële vaten ^1,2 te houden.

Bioreactor cultuur systemen ontwikkeld door onze groep zijn ontworpen om schepen regeneratie te ondersteunen binnen een nauwkeurig gecontroleerde chemo-mechanische omgeving nabootsen die van autochtone schepen. Onze bioreactor montage en onderhoud van de procedures zijn vrij eenvoudig en zeer herhaalbare ^3,4. Gladde spiercellen (SMC) zijn gezaaid op een buisvormige polyglycolzuur (PGA), mesh, dat is voorzien van schroefdraad meer dan voldoet silicone en gekweekt in de bioreactor, met of zonder pulserende stimulatie voor maximaal 12 weken. Er zijn vier belangrijke attributen die onze bioreactor onderscheiden van een aantal voorgangers. 1) In tegenstelling tot andere cultuur systemen die alleen simuleren de biochemische omgeving van inheemse bloedvaten, onze bioreactor creëert ook een fysiologische pulserende omgeving door het toepassen van cyclische radiale belasting om de schepen in de cultuur. 2) Meerdere ontworpen schepen tegelijk worden gekweekt onder verschillende mechanische voorwaarden binnen een gecontroleerde chemische omgeving. 3) De bioreactor kan een mono-laag van endotheelcellen (EC) om eenvoudig worden bekleed op de luminale kant van de ontworpen schepen voor dierlijke implantatie modellen. 4) Onze bioreactor kan ook de cultuur ontworpen schepen met verschillende diameter grootte varieerden van 1 mm tot 3 mm, het opslaan van de inspanning om op maat elk individu bioreactor naar een specifieke diameter past.

De kunstmatige schepen gekweekt in onze bioreactor lijken inheemse bloedvaten histologisch tot op zekere hoogte. Cellen in de vaatwanden uitdrukkelijke volwassen SMC contractiele merkers zoals het gladde spierweefsel myosine zware keten (SMMHC) ^3. Een aanzienlijke hoeveelheid collageen wordt afgezet binnen de extracellulaire matrix, die verantwoordelijk is voor de ultieme mechanische sterkte van de kunstmatige schepen ^5. Biochemische analyse geeft ook aan dat collageen van gemanipuleerde schepen is vergelijkbaar met die van autochtone slagaders ^6. Belangrijk is de pulserende bioreactor consequent geregenereerd schepen dat de mechanische eigenschappen die succesvolle implantatie experimenten mogelijk te maken in diermodellen ^3,7 vertonen. Bovendien kan deze bioreactor verder worden aangepast om real-time de beoordeling en het bijhouden van collageen remodeling na verloop van tijd, niet-invasieve manier, met behulp van een niet-lineaire optische microscopie (NLOM) ⁸ mogelijk te maken. Tot slot moet dit bioreactor dienen als een uitstekend platform om de fundamentele mechanismen die de regeneratie van functionele kleine diameter vaattransplantaten reguleren te bestuderen.

Protocol

Autoclaaf

Monteer en autoclaaf de buizen voor de stroom-systeem en bioreactor componenten (bioreactor zelf en de silicone stop deksel) zoals aangegeven in figuur 1 en figuur 2. Sonde heeft een mannelijke connector aan het ene uiteinde en een open eind aan de andere kant. Drie korte slang segmenten worden ingebracht via een silicone cap voor gasuitwisseling.

1. Naaien PGA Mesh

1. Gesneden PGA gaas 1,1 cm x ~ 8cm vel (afhankelijk van de bioreactor formaat).
2. Schoon silicone (3mm inwendige diameter) met gedestilleerd water (dH20) en de lucht drogen voor gebruik.
3. Gebruik Dexon 6,0 hechtdraa....

Discussion

De kwaliteit van de schepen is ontworpen voor een groot deel bepaald door de kwaliteit van de SMC's gebruikt in de weefselkweek. De kritische aspecten van het SMC fenotype zijn contractiele morfologie, lage passage nummer, en de mogelijkheid om woekeren in de bioreactor. Wij bevelen aan dat de passage aantal niet groter is dan P3 op het moment van de cel zaaien op het polymeer schavot. Bovendien is het cruciaal om te bevestigen dat de SMC bronnen voor mycoplasma gratis te gebruiken. We hebben geconstateerd dat mycop.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Naam van de Reagens / Materiaal	Leverancier	Catalogus Nummer
FBS (Foetaal Bovine Serum) hitte-geïnactiveerd	Hyclone	SH30071
DMEM	GIBCO	11885
rhFGF-basic	R & B	234-FSE
rrPDGF-BB	R & B	520-BB
Penicilin G	Sigma	PENNA
Koper (II) sulfaat	Sigma	C8027
Gylcine	Sigma	C8790
L-Alanine	Sigma	A7469-25G
L-Proline	Sigma	P5607-25G
Ascorbinezuur	Sigma	A4544-25G
HEPES	Sigma	H3375-100G
Silicone Stopper	Cole-Parmer	06298-24
Masterflex buizen L / S	Cole-Parmer	06508-16, 06508-18
Masterflex pomp	Cole-Parmer	7553-80
Dacron manchet	Maquet	174406
PGA voelde	Concordia	MO000877-01
4-0 1.5 metrische Surgipro II hechtdraad	Syneture	VP-557-X
6-0 0.7 metrische Dexon hechtdraad	Syneture	7538-11
0.22μm PTFE filters	Whatman papier	6780-2502
Three Way Stop-haan	Edwards Lifesciences	593WSC
Drukopnemer	Edwards Lifesciences	PX212
IV tassen	Baxter	R4R2110
Saline verdunning set	Pijl	W20030
Silicone	Saint-Gobain	F05027