Twee-foton beeldvorming heeft blootgelegd lymfocyten beweeglijkheid en cellulaire interacties binnen de lymfeklier onder basale omstandigheden en gedurende een immuunrespons 1. Hier laten we zien adoptieve overdracht van T-cellen, isolatie van de lymfeklieren, en beeldvorming beweeglijkheid van de CD4 + T-cellen in de geëxplanteerd lymfeklier.
Methodenartikel
Dissection en 2-Photon Imaging van perifere lymfeklieren in Muizen
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Twee-foton beeldvorming is gebleken dat een elegante choreografie van beweeglijkheid en cellulaire interacties binnen de lymfeklier onder basale omstandigheden en aan het begin van een immuunrespons 1. Hier presenteren we methoden voor adoptieve overdracht van gelabelde T-cellen, isolatie van de lymfeklieren, en beeldvorming beweeglijkheid van de CD4 + T-cellen in de lymfeklier geëxplanteerd zoals eerst beschreven in 2002 2. Twee-foton beeldvorming van immuuncellen vereist dat de cellen fluorescent zijn gelabeld, hetzij door kleuring met een cel tracker kleurstof of met het uitspreken van een fluorescerend eiwit. We tonen de adoptieve overdracht procedure van het injecteren van cellen afkomstig van donor muizen in de staartader van een ontvanger dier, waar ze thuis van lymfoïde organen binnen ongeveer 15-30 minuten. Illustreren we de isolatie van een lymfeklier en beschrijven methoden om een goede montage van de weggesneden lymfeklier te verzekeren. Andere overwegingen, zoals een goede oxygenatie van geperfuseerde media, temperatuur, en de laser power worden besproken. Tot slot presenteren we 3D-videobeelden van naïeve CD4 + T-cellen vertonen een steady state motiliteit bij 37 ° C.
Protocol
1. Adoptieve overdracht van cellen:
Staartader of intra-oculaire injectie zijn beide geschikte methoden voor de invoering van de cel tracker-gemerkte of fluorescerend eiwit tot expressie lymfocyten. In deze video. laten we zien adoptieve overdracht van cellen door staartader injectie.
a. Materialen
CD4 + T-cellen zijn voorzien van de 1,4 uM CFSE gedurende 30 minuten bij 37 º C, twee keer gewassen, en opnieuw gesuspendeerd in 100 ul RPMI-1640. Cellen worden geladen in een steriele 28 meter insuline spuit voor injectie. Het aantal gebruikte cellen hangt af van het experiment wordt gedaan. Typisch, 5 miljoen T-cellen zijn voldoende voor een eenvoudige T-cel visualisatie. Een knaagdier weerhouder voor de muis is nodig om letsel te voorkomen om het dier en voor jezelf.
b. Beveiliging van het dier
De muis is beveiligd voor adoptieve overdracht door het langzaam steun van de dieren in de knaagdier restrainer (zie video) en sluiten van het open uiteinde van de buis door zachtjes indrukken van de zuiger. Niet loslaten van de muis staart tijdens dit proces, aangezien sommige kleinere dieren kunnen omdraaien in de restrainer. Deze methode voorkomt dat het dier verwonden zichzelf en van bewegen tijdens de injectie. Bij het opstellen van het knaagdier restrainer, niet duw de zuiger verder dan nodig is om het dier te houden van het springen naar voren. Ook moet je niet duwen de zuiger tegen het dier, en niet achter het dier in de weerhouder voor een langere periode van tijd.
c. Het visualiseren van de staartader
Trek de staart naar je toe, zodat het licht is gewikkeld over je wijsvinger en hield tegen de binnenkant van de vinger door je duim. Identificeer de staart aderen zich aan weerszijden van de rechtopstaande staart. Visualisatie wordt vergemakkelijkt door opwarming van de staart met warm water, vervolgens af te vegen naar beneden met ethanol.
d. Injectie van cellen
Als de ader is gevonden, plaatst u de spuit met schuine zijde naar boven in een ondiepe hoek parallel aan de ader. Eenmaal in de ader, zachtjes op de zuiger, als je in de ader mag er geen weerstand tegen de injectie. Als u weerstand, verwijder de spuit en probeer het opnieuw op een andere locatie.
Als je in de ader, langzaam op de zuiger totdat de injectie is voltooid. De staart mag niet uitgezet worden tijdens de injectie. Als dat zo is, zou dit betekenen dat de naald niet in de ader. Het is mogelijk om "verliezen" de ader tijdens de injectie. Als dit gebeurt, verwijder de naald en probeer uw injectie op een andere plek. Als u meer dan een injectie proberen, is het het beste om de staart omhoog naar het lichaam van de muis van de oorspronkelijke plaats van de injectie. Plan vooruit voor deze mogelijkheid door te beginnen distaal op de staart te geven uzelf de ruimte voor een andere poging om de adoptieve overdracht.
e. Post-injectie overwegingen
Na de injectie is voltooid, wordt een kleine back-stroom van bloed uit de ader optreden. Druk de injectieplaats met een schone vegen totdat het bloeden stopt. Verwijder de zuiger en laat het dier naar voren lopen, uit de restrainer, terwijl het zachtjes vasthouden aan het staart.
Controleer altijd met uw dier zorg commissie en het gebruik van dieren protocollen om ervoor te zorgen je bent in overeenstemming zijn. Het is belangrijk om deze techniek oefenen een paar keer voordat je probeert de echte experiment.
2. Lymfeklier Isolatie
Isolatie van de lymfeklieren voor twee photon imaging vereist een zorgvuldige verwijdering van de juiste lymfeklier van het omringende weefsel.
a. Selectie en locatie van perifere lymfeklieren
Selectie van de lymfeklieren voor de beeldvorming zal afhangen van de experimentele doelen. Wees je bewust van lokale infectie of een injectie-drainerende lymfeklieren, en selecteer de juiste knooppunt voor de beeldvorming. Het artikel van Van den Broeck et al.., Beschrijft de locatie en de morfologie van muizen lymfeklieren in detail 3. In deze video, tonen we de excisie van de zes grote perifere lymfeklieren die geschikt zijn voor cel-isolatie of imaging.
b. Lymfeklier verwijdering:
Houd rekening met de integriteit van het weefsel tijdens het verwijderen van de lymfeklieren. Wees niet te scheuren van de capsule of op enigerlei wijze schade aan de lymfeklier structuur. Verlies van lymfeklier structurele integriteit zal afbreuk doen aan de experiment. Verwijder indien nodig vet van de lymfeklier oppervlak met fijne ontleden (# 5 Dumont) pincet onder een dissectie microscoop. Lymfeklieren mag geen achtergebleven vet op het oppervlak van het knooppunt, want dit zal beeldvorming verduisteren door verstrooiing het licht.
Een goede excisie van de lymfeklieren is ook een belangrijke techniek om te oefenen voordat de eerste echte experiment.
3. Lymfe Node Imaging Setup en overwegingen
De lymfeklier moet worden bevestigd aan de beeldvorming fase, die in dit geval bestaat uit een verzonken kamer. Opgewarmd, zuurstof-doorbloed media is gepompt in de kamer van de ene kant met behulp van een peristaltische pomp en inline verwarming, en het wordt uitgevoerd via een neerwaartse-gegradeerde kanaal in een kamer met het verzamelen van een vacuüm buis om een inzameling van afval kolf. In ons systeem wordt de lymfeklier ondergedompeld in 37 ° C media en super-geperfuseerd met medische kwaliteit carbogen (5% CO 2, 95% O 2). De temperatuur van de perfusie media moeten worden geregistreerd als dicht bij de lymfeklier als mogelijk is. Uw specifieke systeem kan verlangen variaties in de media debiet en scenografie aan de microscoop podium en het doel tegemoet te komen.
a. Lymfeklier beeldvorming setup:
Zoals te zien in de video, we veilig de lymfeklier door eerst vastmaken, medullaire-kant naar beneden (om de afbeelding T-of B-cel zones met behulp van een microscoop rechtop) op een plastic dekglaasje, gesneden om de juiste grootte. Het is belangrijk dat het gebruik van een niet-giftige lijm weefsel (we gebruiken VetBond ™ van 3M Corporation).
Het dekglaasje wordt vastgezet in de stromende media door het plaatsen van een klein beetje siliconenvet op de onderkant van het deksel slip, dan is het naleven dit om de glazen voet van de imaging kamer.
b. 2-Photon beeldvorming overwegingen:
Verschillende factoren kunnen leiden tot lymfocyten om te stoppen met bewegen: temperatuur te hoog of te laag is, dan laservermogen, compressie of andere schade aan de lymfeklieren, en gebrek aan zuurstof. Schade als gevolg van overmatige laservermogen of temperaturen> ~ 39 ° C is onomkeerbaar.
Als cellen worden gedimd, is het meestal beter om verhoging van de detector te krijgen of de cel-labeling-protocol in plaats van een hoger laservermogen aan cellen te visualiseren. Optimalisatie van de etikettering of de expressie van fluorescerende eiwitten kan nodig zijn om de fluorescentie boven het niveau van achtergrond autofluorescentie te brengen. Met een redelijke winst en laser energie-instellingen, over een twee-log verschuiving van de fluorescentie boven de uitgangswaarde (gemeten met flowcytometrie) is redelijk voor cel-visualisatie.
Met afstelbare twee-foton lasers, moet de golflengte wordt gebruikt voor excitatie worden iets minder dan het dubbele van de single-foton excitatie maximum van het fluorofoor in beeld wordt gebracht. In twee-foton experimenten met behulp van meer dan een etiket of fluorescerend eiwit kan het nodig zijn om te experimenteren met de excitatie golflengte gebruikt om de optimale instellingen voor beide labels te vinden. Twee-foton excitatie kan ook worden gebruikt om de afbeelding endogene collageen structuren door gebruik te maken van de intrinsieke blauwe tweede harmonische generatie. Tweede harmonische generatie (SHG) vindt plaats wanneer twee fotonen worden gecombineerd in een materiaal en stralen een enkel foton van tweemaal de frequentie van de oorspronkelijke fotonen. In weefsel, twee-foton excitatie treedt op wanneer de invallende laserlicht loodrecht staat op een sterk geordende eiwitstructuur zoals collageen.
Praktische aspecten met betrekking tot twee-foton imaging werden besproken in de preview reviews 4, 5.
Discussie
In deze video protocol laten we de procedures voor de adoptieve cel overdracht en lymfeklier isolatie en de voorbereiding die nodig zijn voor beeldvorming lymfocyten motiliteit in een perifere lymfeklier. Twee-foton beeldvorming heeft een aantal voordelen ten opzichte van confocale beeldvorming in beide geëxplanteerd weefsels (hier afgebeeld) en in intravitale preparaten. Met name het gebruik van infra-rood excitatie minimaliseert lichtverstrooiing en maakt voor het afbeelden van ~ 300 micrometer onder het kapsel van de lymfeklier en dieper in sommige weefsels 4. Bovendien is multi-foton excitatie beperkt tot het brandpunt van de doelstelling, het minimaliseren van foto's bleken en weefselbeschadiging buiten kant van het brandvlak. Zoals met elke nieuwe techniek, echter twee-foton imaging is geen wondermiddel en de beperkingen en mogelijke valkuilen moet in gedachten worden gehouden 5. Daarvan is de eis dat - met uitzondering van intrinsieke signalen zoals tweede-harmonische generatie door collageen-cellen van belang moet worden fluorescent gelabelde door extrinsieke probes of door expressie van fluorescerende eiwitten. De indruk wordt dus gewekt dat deze gelabelde cellen zwemmen in een zwarte leegte, en dat in werkelijkheid zijn ze ondergedompeld in, en de interactie met een complexe omgeving van structurele elementen en talloze andere niet-gemerkt, onzichtbaar cellen.
In de zes jaar sinds de invoering van twee-foton beeldvorming te immunologie, is deze techniek mogelijk onderzoekers om al lang bestaande vraagstukken aan te pakken door rechtstreeks visualiseren in intacte levende weefsels processen, zoals cel-cel interacties, celbeweeglijkheid en lokalisatie, cellulaire signaalwegen en cytotoxische cel het doden van evenementen. Het veld heeft zich snel ontwikkeld dan de eerste fenomenologische beschrijvingen, en kwantitatieve analyses, samen met de computer modellering en simulatie beginnen nu te voelen hoe de schijnbaar chaotische bewegingen en cellulaire interacties binnen lymfeklieren leiden tot een efficiënte immuunrespons te maken. Deze vooruitgang is uitgebreid besproken in een recente publicatie 1, die bevat meer dan 100 papers beschrijven van de toepassing van twee-foton microscopie voor immunoimaging.
Dankbetuigingen
We willen Rebecca Paquette bedanken voor hulp bij het reagens voorbereiding. MPM wordt ondersteund door een Ruth L. Kirchstein predoctorale beurs van de National Institutes of Health en de ondersteuning uit subsidies GM-41514 (MDC), NS-48252 (KGC), GM-48.071 (IP) ook van de National Institutes of Health.
Referenties
- Cahalan, M. D., Parker, I. Choreography of Cell Motility and Interaction Dynamics Imaged by Two-Photon Microscopy in Lymphoid Organs. Annu Rev Immunol. Annu Rev Immunol. , (2008).
- Miller, M. J., Wei, S. H., Parker, I., Cahalan, M. D. Two-photon imaging of lymphocyte motility and antigen response in intact lymph node. Science. 296, 1869-1873 (2002).
- Van den Broeck, W., Derore, A., Simoens, P. Anatomy and nomenclature of murine lymph nodes: Descriptive study and nomenclatory standardization in BALB/cAnNCrl mice. J Immunol Methods. 312, 12-19 (2006).
- Cahalan, M. D., Parker, I., Wei, S. H., Miller, M. J. Two-photon tissue imaging: seeing the immune system in a fresh light. Nat Rev Immunol. 2, 872-880 (2002).
- Germain, R. N., Miller, M. J., Dustin, M. L., Nussenzweig, M. C. Dynamic imaging of the immune system: progress, pitfalls and promise. Nat Rev Immunol. 6, 497-507 (2006).
Herprints en machtigingen
