Verschillende 2'-fluor RNA aptameren tegen HIV-1Ba-L gp120 met nanomole affiniteit geïsoleerd zijn van een RNA bibliotheek door In vitro SELEX procedure. Een nieuwe dual remmende functie anti-gp120 aptameer-siRNA chimera is gemaakt en toont grote belofte voor de systemische anti-HIV therapie.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Ontwikkeling van Cell-type-specifieke anti-HIV-gp120 aptameren voor siRNA levering
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
De wereldwijde epidemie van een infectie met HIV heeft een dringende behoefte aan nieuwe klassen van antiretrovirale middelen. Het krachtige vermogen van kleine storende (si) RNA's om de expressie van complementaire RNA-transcripten te remmen wordt benut als een nieuwe klasse van geneesmiddelen voor een verscheidenheid van ziekten, waaronder HIV. Vele eerdere rapporten is gebleken dat nieuwe RNAi-gebaseerde anti-HIV/AIDS therapeutische strategieën aanzienlijk belofte hebben, maar een belangrijke belemmering voor de succesvolle therapeutische toepassing en de klinische vertaling van siRNA's is een efficiënte levering. In het bijzonder, gelet op de veiligheid en werkzaamheid van RNAi-gebaseerde therapieën, is het zeer wenselijk om de ontwikkeling van een gerichte intracellulaire siRNA levering benadering van specifieke cel populaties of weefsels. De HIV-1 eiwit gp120, een glycoproteïne envelop op het oppervlak van HIV-1, speelt een belangrijke rol bij het binnendringen van het virus in de CD4-cellen. De interactie tussen gp120 en CD4-triggers die HIV-1 entry en start celfusie is gevalideerd als een klinisch relevant anti-virale strategie voor drug discovery.
Hierin bespreken we eerst de selectie en de identificatie van 2'-F gewijzigd anti-HIV-RNA gp120 aptameren. Met behulp van een conventionele nitrocellulosefilter SELEX methode, werden verschillende nieuwe aptameren met nanomolaire affiniteit geïsoleerd uit een 50 willekeurige nt RNA bibliotheek. Om met succes gebonden soorten te verkrijgen met een hogere affiniteit, is de selectie streng zorgvuldig gecontroleerd door het aanpassen van de voorwaarden. De geselecteerde aptameren kan specifiek binden en worden snel geïnternaliseerd in cellen die het HIV-1 envelop eiwit. Daarnaast kan de aptameren alleen neutraliseren HIV-1 besmettelijkheid. Op basis van de best aptameer A-1, creëren we ook een nieuw, tweevoudig remmende functie anti-gp120 aptameer-siRNA chimera waarin zowel de aptameer en de siRNA porties zijn krachtige anti-HIV-activiteiten. Verder maken we gebruik van de gp120 aptameer-siRNA hersenschimmen voor cel-type specifieke levering van de siRNA in HIV-1 geïnfecteerde cellen. Deze dubbele functie chimera laat zien grote mogelijkheden voor het combineren van verschillende nucleïnezuur therapeutische middelen (aptameer en siRNA) bij het onderdrukken van HIV-1-infectie, waardoor de aptameer-siRNA hersenschimmen aantrekkelijke therapeutische kandidaten voor patiënten bij zeer actieve antiretrovirale therapie (HAART).
Protocol
1. Voorbereiding van de RNA-bibliotheek
- Het uitgangspunt DNA-bibliotheek bevatte 50 nucleotiden van willekeurige sequenties en werd gesynthetiseerd door Integrated DNA Technologies (Coralville, Iowa). De enkelstrengs DNA-oligo-bibliotheek sequentie is 5'-GGG AGG ACG ATG CGG - N 50 - CAG ACG ACT CGC CCG A - 3 '(81 nt). De willekeurige regio wordt geflankeerd door een constante regio's, die de T7 promoter voor in vitro transcriptie en een 3 "-tag voor RT-PCR op te nemen. De 5 'en 3' constante sequenties zijn 5 '- TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA GGA CGA TGC GG - 3' (32 mer) en 5 '-TCG GGC TCG GAG TCT G - 3' (16 mer), respectievelijk. Maak voor....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Aptameren zijn in vitro ontwikkelde nucleïnezuren die specifieke en stabiele drie-dimensionale vormen aannemen, waardoor een uiterst specifieke, sterke binding gerichte moleculen 8. De lage nanomolaire bindingsaffiniteit en specificiteit van exquise aptameren om hun doelstellingen maken veelzijdige tools voor diagnose, in vivo beeldvorming, en therapeutica 9. Met de komst van aptameer technologie voor gerichte siRNA levering is het nu mogelijk om de aptameer bindende functie voor .......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
J. R en JZ heeft een patent aangevraagd op de "Cell-type-specifieke aptameer-siRNA systeem voor de HIV-1 therapie". USPTO, Nee. 12/328994, De publicatiedatum: 11 juni, 2009.
Dankbetuigingen
Wij danken Britta Hoehn, Guihua zon, Harris Soifer en Lisa Scherer voor nuttige discussies. Dit werk werd ondersteund door subsidies van de National Institutes of Health AI29329 en HL07470 uitgereikt aan de volgende reagentia JJR werden verkregen door het NIH AIDS-onderzoek en referentiereagens Program, Division van aids, NIAID, NIH: De CHO-EE en CHO-cel GP160 lijn, de pNL4-3 luc vector; HIV-1-BAL gp120 uit dan DAIDS, NIAID.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Naam van het serum | Vennootschap | Catalogus nummer | Commentaar (optioneel) |
| MF-Millipore membraanfilter | Millipore | HAWP01300 | Poriegrootte 0,45 pm |
| Swinnex Filterhouder | Millipore | SX0001300 | 13 mm diameter |
| QIAquick Gel Extraction Kit | QIAGEN | 28706 | DNA-zuivering |
| Microcontroller YM-30 kolom | Millipore | 42410 | RNA-concentratie |
| Bio-spin 30 column | Bio-Rad | 732-6250 | RNA-zuivering |
| Taq PCR DNA-polymerase | Sigma-Aldrich | D1806 | |
| ThermoScript RT-PCR-systeem | Invitrogen | 11146-024 | |
| DuraScribe T7 transcriptie Kit | Epicentrum | DS010925 | |
| dNTP voor PCR | Roche | 1 581 295 | |
| Ribonucleïnezuur, transfer van E. coli | Sigma-Aldrich | R1753 | tRNA concurrent |
| HIV-1 Ba-L eiwit gp120 | de AIDS-onderzoek en referentiereagens Programma | 4961 | Doelwiteiwit |
| Silencer siRNA labeling kit - Cy3 | Ambion | 1632 | |
| Zuur fenol / chloroform 5 / 1-oplossing (pH 4,5) | Ambion | AM9720 | |
| Chloroform / isopropanol 24 / 1-oplossing | Sigma | C0549 | |
| Kalf intestinale fosfatase (CIP) | New England BioLab | M0290L | |
| T4 polynucleotide kinase | New England BioLab | M0201L | |
| Glycogeen | Roche | 10 901 393 001 | RNA neerslag |
| Gamma-P 32-ATP | MP Biomedische | 013502002 | Radiactivity |
| 40% AccuGel 19:1 | Nationale Diagnostics | EC-850 | |
| 10xTBE | Nationale Diagnostics | EC-860 | |
| N, N, N, N'-Tetramethylethylenediamine (TMEMD) | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Ammoniumpersulfaat (APS) | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| L-methioine sulfoximine | Sigma-Aldrich | M5379-250 mg | |
| RPMI Media 1640 | Invitrogen | 11835-030 | |
| Natriumbicarbonaat oplossing, 7,5% w / v | Invitrogen | 25080-094 | |
| Minimum Essential Medium (MEM) (10 ) | Invitrogen | 11430-030 | |
| MEM niet-essentieel aminozuur (100 ) | Invitrogen | 11140-050 | |
| TA klonering kit met pCR 2.1 | Invitrogen | K2040-01 |
Referenties
- Tuerk, C., Gold, L. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase. Science. 249, 505-510 (1990).
- Ellington, A. D., Szostak, J. W. In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands. <....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
