$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Set-up
- Set-up chirurgische gebied zoals getoond in Fig. 1A, A '. Belangrijke onderdelen van de set-up onder andere een Eppendorf Femtojet microinjector, Narishige micromanipulator met naaldhouder, Leica steromicroscope, glasvezel verlichting, ECM 830 Square Wave Elektroporatie System met elektroden, verwarming pad en een vaporizer voor isofluraan anesthesie.
- Reinig alle gereedschappen met een BRANSONIC Ultrasonic Cleaner gebruik Metriclean2 Laagschuimende oplossing voor sonicating chirurgische instrumenten. Steriliseer tools in autoclaaf. Gesteriliseerde instrumenten worden dan bewaard in Germex.
- Bereid spuiten met warm steriele zoutoplossing en steriele Ringer lactaat-oplossing.
2. Anesthesie
- Plaats dier in een kleine (12cm x 20cm) verdoving kamer. Met behulp van een vaporizer, leveren 5% isofluraan anesthesie en zuurstof bij 1L/min (Fig. 1A, A '). Met name is het belangrijk om isofluraan uitlaat verzamelen met behulp van een scavenging systeem.
- Verwijder dieren uit de kamer toen ademhaling diep en regelmatig. Toe te knijpen en de ogen knipperen reflex testen worden gebruikt om volledige narcose te verzekeren.
- Plaats zwangere muis op zijn rug op de top van een verwarmingselement (37 ° C). Het verwarmingselement wordt eerst gesteriliseerd door af te vegen met 70% ethanol, en vervolgens bedekt met een gesteriliseerde, niet pluizend gaasje. Gebruik een respirator tube en masker apparatuur te leveren isofluraan (2,25%) tijdens de operatie.
- Injecteren buprenorfine (0.1mg/kg lichaamsgewicht) subcutaan onder de huid in de nek van de hals.
- Monitor dier gedurende een operatie voor een diepe en regelmatige ademhaling. Het dier moet niet naar adem snakken, ademen oppervlakkig en snel. Oppervlakkige, snelle ademhaling kan een teken zijn van lichte anesthesie, en de stroom van isofluraan dient te worden verhoogd. Als het dier begint adem te beperken de stroom van isofluraan. In het geval van een ademhalingsstilstand, zet isofluraan uit, en de toevoer van zuurstof tot dier zich herstelt. Herstart isofluraan bij een lagere concentratie.
3. Dier voorbereiding op een operatie
- Tape voorpoten van dier naar de verwarming pad en controleer opnieuw voor een herroeping reactie van knijpen de achterste voet met stompe tang.
- Met behulp van een steriel wattenstaafje, verspreid over een dikke laag van ontharingscrème (dat wil zeggen, Nair) op de buik. In harde bewegingen, zorgen voor de ondervacht is volledig bedekt. Laat het voor een gemiddelde van drie minuten, controle met tussenpozen met een steriel schoon wattenstaafje voor ontharing. Natte een steriel gaasje met steriel water en veeg de buik totdat alle sporen zijn verdwenen. Herhaal dit met chloorhexidine (dat wil zeggen, Stanhexidine) huid schoner en meer water. Droog de buik met schoon, steriel gaas.
- Steriliseren incisie site met een chloorhexidine (dat wil zeggen, Stanhexidine), gevolgd door meer steriel water. Droog de buik met schoon, steriel gaas. Herhaal deze stap met behulp van 70% ethanol en een frisse, gesteriliseerd wattenstaafje.
- Leg een steriel gaasje op de buik met een gleuf in het midden waardoor de baarmoeder hoornen zullen worden getrokken tijdens de operatie.
4. Incisie en Blootstelling van baarmoederhoorns
- Bloot te leggen van de baarmoeder hoornen, eerst zoek de linea alba als de vage lijn onder de huid op de middenlijn. Met behulp van een tang, trek de huid weg van de buikwand en snij een kleine, rechte snede van het midden van de buik naar beneden met de huid schaar (ongeveer 1 cm in lengte).
- Met behulp van gebogen tang en schaar, herhaal het proces met het buikvlies.
- Plaats steriel gaasje met een kleine verticale spleet boven incisie en bevochtigen met verwarmde steriele zoutoplossing.
- Schuif pincet in de incisie en zoek de baarmoeder. Openhouden incisie met een pincet, terwijl het verwijderen van de baarmoeder hoornen.
- Pak het baarmoeder tussen de eerste en de tweede zichtbare embryo's en trek de embryo's op het gaas. Verwijder beide zijden van de baarmoeder horens, het plaatsen op de steriele gaas en tel het aantal embryo's, en merkt elke resorpties of "ongezond" (bijv. kleinere body) embryo's. Nat de baarmoederhoorns met zout en voorzichtig de helft van de baarmoeder terug te keren in de buik.
5. Injectie van DNA in ventrikels
- Chirurgische naalden worden bereid met een Sutter Flaming Micropipet Puller met behulp van borosilicate micropipetten met capillairen (Programma: warmte = 750, = 30 Pull, Vel = 90, Tijd = 150). Met behulp van een steriel scalpel, is de naald zachtjes afgeschoren op een hoek van 45 graden.
- Voor het laden van de naald, zijn pasteurpipetten getrokken naar een kleine diameter onder een vlam. Een mondstuk is verbonden aan het laden pipet voor het opstellen van ~ 10 ul van 3mg/ml endotoxine-vrije DNA gemengd met 0,01% methyl-groen (let op: methyl groene kleurstof maakt DNA-injecties in beeld worden gebracht). De gevulde naald is vervolgens gemonteerd op een micromanipulator staan en aan de Femtojet injector.
- Te beginnen met het embryo het dichtst bij de eierstok, ronde tangworden gebruikt om de embryo zachtjes draaien binnen de decidua, zodat het gepositioneerd is "face-forward", waardoor injecties voor te komen in een rostraal van caudale richting. Een glasvezel lichtbron voor verlichting wordt gebruikt om de middellijn van het embryonale hersenen, die wordt geflankeerd door de grote laterale ventrikels in de rostrale regio's (Fig. 1B, B ') te visualiseren.
- Het embryo wordt gehouden in positie met behulp van ronde tang. De naald is gepositioneerd boven de baarmoeder, zodat de hoek van binnenkomst in de hersenen is ongeveer 45 graden. Met behulp van de micromanipulator, en een snelle en gestage beweging, wordt de naald ingebracht via de baarmoederwand en in de laterale ventrikel van het embryo. Injecties zijn gericht op de laterale ventrikels, 3de ventrikel of subretinale ruimte aan de telencephalon, diencephalon en het netvlies, respectievelijk doel. Merk op dat de embryonale hersenen blaasjes open zijn in een vroeg embryonaal stadium zodanig dat DNA ingespoten in de laterale ventrikels stroomt in de 3 e ventrikel.
- Druk op het voetpedaal om endotoxine-vrij DNA (1-3 pi) met behulp van een Eppendorf Femtojet microinjector injecteren. Een succesvolle injectie is gemakkelijk gevisualiseerd door het verspreiden van de methyl-groene kleurstof in de embryonale hersenen ventrikels. De naald wordt dan langzaam verwijderd door het opstellen back-up om breuk te voorkomen.
6. Elektroporatie
- De geïnjecteerde embryo (nog steeds in de baarmoeder) is geplaatst op de bovenliggende steriel gaasje van de moeder de buik en natte grondig met warm zout. Let op: ** De toevoeging van een zoutoplossing aan het membraanoppervlak is essentieel voor een efficiënte doorgang van een elektrische stroom.
- GenePaddle elektroden worden gebruikt om de baarmoeder na de injectie van DNA grip. Vijf vierkante elektrische pulsen van 40-50V en 50 ms worden geleverd met een snelheid van een puls per seconde met behulp van een ECM8300 BTX elektroporatie systeem (Fig. 1C, C ').
- Dek de geïnjecteerde / geëlektroporeerd embryo met beschermende nat gaasje en verder met de volgende embryo.
- Na voltooiing van de injectie / elektroporatie van alle gewenste embryo's, voorzichtig terug te duwen de baarmoederhoorns in de buik (fig. 1D).
- Verwijder voorzichtig de andere baarmoeder hoorn en opnieuw beginnen met het embryo het dichtst bij de eierstok.
7. Hechtdraad en nieten
- Als alle embryo's worden terug in de baarmoeder, toe te voegen aan de buikholte ~ 2-3 ml warm zoutoplossing.
- U sluit de wond, te beginnen door het verwijderen van het gaas op de buik en het identificeren van de zijkanten van het buikvlies. Begin hechten het buikvlies met behulp van zwarte zijde gevlochten lijn. Het is niet aan te raden om resorbeerbaar garen gebruiken voor deze procedure is het meestal zwakker en kan leiden tot post-operatieve bloeden en infecties. Anker van de lijn op het buikvlies die het dichtst bij het borstbeen en ga verder met steek uit de buurt van het anker. Zorg ervoor dat alle hechtingen vast zitten, en dat er geen onderliggende organen of de huid per ongeluk is genaaid in het buikvlies. Clip de rest van hechtdraad lijn en gooi deze weg.
- Trek de huid gesloten over de hechting met een tang. Met behulp van 9 mm Reflex ™ wondsluiting nietjes, clip van de huid over de wond, zorg ervoor dat u nieten de hechting lijn eronder, of om de huid te strak te trekken. De aanbevolen methode is om de huid te houden en weg van het lichaam met een pincet, en in komen op een hoek van 90 graden met het nietje tool. Ga door totdat wond is gesloten (ongeveer drie nietjes). Eenmaal klaar, zorg nietjes zijn strak door zachtjes te drukken, samen met de hechting tool (fig. 1D ').
8. Post-operatieve zorg
- Voor het bewaken van verdoving herstel zet vrouwelijke op haar buik en zet isofluraan. Het houden van het dier gezicht binnen de ademhalingsapparatuur, zet zuurstof tot 3% tot herstel van de anesthesie te helpen. Het dier moet worden gelegd op een schone, droge gaasje op de top van de verwarming pad om onderkoeling te voorkomen.
- Terwijl het dier is suf, subcutaan injecteren 2 ml Ringer-oplossing in het kader nek van het dier huid.
- Houd het dier onder zuurstoftoevoer gedurende enkele minuten en de opwarming gaasjes om te wekken het dier. Korte spurts van de beweging van het dier moet in acht worden genomen omdat het weer een normale ademhaling. Observeer gedurende enkele minuten totdat dier lijkt bewust en wakker.
- Spray de vrouwelijke buik met Gentamicine spray en wikkel het dier in een steriel gaasje.
- Overdracht van het dier in een steriele kooi met geautoclaveerd beddengoed en kartonnen behuizing.
- Water flessen moeten grondig worden gereinigd, gesteriliseerd en gevuld met steriel water. Tot 500 ml water 2 ml sulfamethazine antibiotica (25% aandelen).
- Dien 0,05 mg / kg subcutaan buprenorfine de ochtend na de operatie.
- Monitor de vrouwelijke voet voor de eerste 24 uur na de operatie. Indien de dieren langer dan 24 uur bewaard, zijn vrouwen verplaatst naar nieuwe sterile kooien op dag 2.
9. Representatieve resultaten
Neocortex
De neocortex is het gebied van het CZS, die verantwoordelijk is voor het visuele en sensomotorische verwerking en hogere cognitieve functioneren. Het bestaat uit glutamaat projectie neuronen en GABA-erge interneuronen die zijn afgeleid van de dorsale en ventrale telencephalon respectievelijk. Om de rol van verschillende genen in neocorticale ontwikkeling, gebruiken we in utero electroporatie om ofwel misexpress of blokkeren van de expressie (dat wil zeggen, door het gebruik van shRNA constructies) van verschillende genen in het dorsale of ventrale telencephalon 1,3,4. Om misexpress genen in de embryonale telencephalon, gebruiken we een bicistronische expressievector (pCIG2), met een CMV-promoter-enhancer βactin en een interne ribosoom entry site (IRES)-enhanced green fluorescent eiwit (EGFP, in pCIG2) cassette, waardoor getransfecteerde cellen worden gedetecteerd door epifluorescentie (Fig. 2A-C). We hebben gebruik gemaakt van deze technologie om expressie constructen te introduceren in de telencephalon van E11.5 tot E15.5 (zie gegevens op E12.5;. Afb. 2). Doordat embryo's te ontwikkelen enkele dagen na de elektroporatie, we zijn in staat om de differentiatie en migratie van GFP-gelabelde voorlopercellen track. Als differentiatie de opbrengst, 3 dagen na de elektroporatie GFP + cellen differentiëren en uit de ventriculaire zone (vz), subventriculaire zone (SVZ) en de tussenliggende zone (iz) en in de corticale plaat (cp.; Fig 2C) migreren. Als hersenen geëlektroporeerd op E12.5 worden geanalyseerd na 24 uur, kunnen we monitoren eerdere gebeurtenissen in progenitor rijping en neuronale migratie door co-labeling met markers van de apicale voorvaderen (dat wil zeggen, PAX6;. Afb. 2A), basale voorvaderen (dat wil zeggen, tbr2; . fig. 2B) en postmitotische neocorticale neuronen (dat wil zeggen, Tbr1;. figuur 2C).
Diencephalon
De hypothalamus ligt aan de ventrale basis van het CZS en fungeert als een gateway tussen het endocriene en autonome zenuwstelsel. Tijdens de ontwikkeling, de vele kernen die deel uitmaken van de volwassen hypothalamus te onderscheiden van een gemeenschappelijke voorouder zone die de lijnen van de ventrale meest gebied van de embryonale diencephalon. Momenteel worden de moleculaire pathways die progenitor cel proliferatie, neuronale differentiatie en de vorming van hypothalame kernen te reguleren niet goed begrepen. We gebruikten in utero electroporatie te reporter genexpressie te richten op de embryonale diencephalon door het injecteren van DNA in de 3 e ventrikel van de E12 embryos.We daarna volgde de distributie van GFP in het differentiëren van neuronen bij E14. Met deze methodiek hebben we met succes gericht GFP expressie van de thalamus, pre-thalamus en hypothalamus (Fig. 3A). Analyse van de coronale secties blijkt dat we met succes hebben GFP expressie gericht op progenitor cellen die de ventriculaire zone van de 3 e ventrikel en neuronen die uit te migreren naar de mantel zone kernen vormen (Fig. 3B)
Netvlies
Het netvlies is de neurale laag van het oog, die verantwoordelijk is voor het omzetten van licht fotonen in elektrische impulsen doorgegeven aan de hersenen. Het ontwikkelt zich als een outpocketing van de embryonale diencephalon, en dus is afgeleid van de neurale buis. De neurale netvlies ontwikkelt zich uit een apicale stamvader compartiment dat ligt naast de subretinale ruimte, een holte dat het oog scheidt van het hoofd mesenchym. Targeting DNA-constructen op het netvlies voorouders dan ook vereist dat de injecties worden gemaakt in een klein doelgebied. Met behulp van micromanipulators zijn we erin geslaagd om dit kleine gebied goed doel in embryo's van E13.5 tot E15.5 (getoond is E15.5 electroporations van PCIC met mCherry verslaggever; figuur 4.). Als geëlektroporeerd retinae zijn onderzocht 24 uur na transfectie, zien we dat de meeste mCherry + cellen bevinden zich in de buitenste laag neuroblast (onbl), waar delen voorouders zich bevinden, en niet in de retinale ganglion cel laag (gcl; inzet afbeelding), waar postmitotische cellen te lokaliseren.
Figuur 1. Inleiding tot in utero elektroporatie set-up en methodologie. (A) De belangrijkste componenten van de chirurgische set-up onder andere een Eppendorf Femtojet microinjector (1), Narishige micromanipulator met naald houder (2), Leica steromicroscope (3), glasvezel verlichting systeem (4), ECM 830 Square Wave Elektroporatie systeem met elektroden (5) en verwarming pad (6). (A ') Het dier is verdoofd met behulp van een verdamper voor isofluraan anesthesie. (B, B '), kort, na verdoving, worden de baarmoeder hoornen blootgesteld en DNA vermengd met snelle groen wordt geïnjecteerd in de embryonale hersenen blaasjes. Een succesvolle injectie wordt gevisualiseerd door het volgen van de snelle groene kleurstof (B '). (C, C ') Nadat het DNA is met succes geïnjecteerd, wordt de peddel elektroden aan weerszijden van de baarmoeder, positioning het embryo, zodat de DNA zal worden getrokken naar de positieve pool naar de hersenen regio van uw keuze. (D, D ') Zodra alle gewenste embryo's worden geïnjecteerd, de baarmoeder wordt teruggeduwd in de buik (D), is het peritoneum gehecht, en de huid is geniet (D'). De zwangere vrouw is dan toegestaan om te herstellen en de geëlectroporeerd pups worden verzameld op de gewenste tijdstippen.
Figuur 2. Representatief voorbeeld van dorsale telencephalic elektroporatie. (AC) microfoto van een coronale doorsnede door een E13.5 dorsale telencephalon geëlektroporeerd op E12.5 met pCIG2. Geëlektroporeerde GFP + cellen worden geanalyseerd op hun expressie van merkers van apicale voorouders (PAX6 +, rood, A), basale voorouders (tbr2 +, rood, B) en postmitotische neuronen (Tbr1 +, rood, C). cp, corticale plaat, SVZ, subventriculaire zone, vz, ventriculaire zone.
Figuur 3. Representatief voorbeeld van diencephalic elektroporatie. (A) Een ventrale mening van een E14 de hersenen dat is op E12 geëlektroporeerd met pCIG2. GFP epifluorescentie zichtbaar is in de thalamus, pre-thalamus en de hypothalamus, het aantonen van de verspreiding van de gemicroinjecteerd pCIG2 plasmide in de 3 e ventrikel. (B) microfoto van coronale doorsnede van geëlektroporeerd hersenen, met de migratie van GFP + cellen uit de ventriculaire zone en in de mantel zone, waar de hypothalame kernen zal vormen. 3V, derde ventrikel, T, thalamus, Hy, hypothalamus, MZ, mantel-zone, Tel, telencephalon, Pret, prethalamus, vz, ventriculaire zone.
Figuur 4. Representatief voorbeeld van het netvlies elektroporatie. Coronale doorsnede door een E16.5 oog geëlektroporeerd met PCIC op E15.5 met de accumulatie van mCherry + cellen in de buitenste laag neuroblast en niet in Brn3b + retinale ganglioncellen in het ganglion cel laag. De inzet is een hogere vergroting beeld van de boxed gebied. GCL, retinale ganglion cellaag, le, lens, onbl, buitenste laag neuroblast, re, netvlies.