Isolatie van Functionele Cardiac immuuncellen

Samenvatting

Deze methode voor het isoleren van functionele immuun cellen van het hart biedt een alternatief voor de conventionele methoden van collagenase spijsvertering, die ongewenste immuun-cel activatie veroorzaakt, wat resulteert in een verminderde respons van deze cellen. Onze methode van isolatie levert functionele hart immuuncellen door het vermijden van problemen die samenhangen met enzymatische spijsvertering.

Samenvatting

Cardiale immuuncellen worden steeds belangstelling voor de rollen die zij spelen in de pathologische remodeling in veel hartaandoeningen ^1-5 Deze immuuncellen, die mestcellen, T-cellen en macrofagen bevatten;. Bewaren en laat een verscheidenheid van biologisch actieve mediators zoals cytokines en proteases zoals tryptase. ^6-8 Deze bemiddelaars is aangetoond dat de belangrijkste spelers in de extracellulaire matrix metabolisme worden door het activeren van matrix metalloproteinases of het veroorzaken van collageen accumulatie door het moduleren van de cardiale fibroblasten 'functie. ^9-11 echter beschikbare technieken voor het isoleren van het hart immune cellen is problematisch omdat ze bacterieel collagenase om de myocardweefsel verteren. Deze techniek zorgt voor de activatie van het immuunsysteem cellen en dus een verlies van functie. Bijvoorbeeld, cardiale mestcellen worden aanzienlijk minder reageren op stoffen die degranulatie kunnen veroorzaken. Daarom ^12, hebben we een techniek ontwikkeld die het mogelijk maakt voor tHij isolatie van functionele hart immune cellen, die zou leiden tot een beter begrip van de rol van deze cellen in hart-en vaatziekten. ^{13, 14}

Deze methode vereist een vertrouwdheid met de anatomische locatie van zwaardvormig de rat het proces, oksel en gebogen ligament, en hartzakje van het hart. Deze monumenten zijn belangrijk voor het succes van de procedure te verhogen en een hogere opbrengst van de cardiale immune cellen te verzekeren. Deze geïsoleerde hart immune cellen kunnen vervolgens worden gebruikt voor de karakterisering van functionaliteit, fenotype, volwassenheid en co-cultuur experimenten met andere hartcellen tot een beter begrip van hun interacties te krijgen.

Protocol

1. Voorbereiding van de Balance Hanks 'Salt Solution (HBSS)

1. Autoclaaf een L glazen beker, 1000 ml maatcilinder, en roer bar.
2. Los het poeder HBSS oplossing in de geautoclaveerde een L glazen beker op de 900 ml maatstreep met dubbel gedestilleerd water.
3. Meng HBSS oplossing met 3,4 g van Hepes Na + zout en breng de pH op een waarde tussen 7,35-7,41 met behulp van geconcentreerde HCl of NaOH.
4. Zodra de gewenste pH is bereikt en blijft stabiel, voeg 5 g runder serum albumine aan de oplossing op kamertemperatuur tot de albumine volledig is opgelost.
5. Voeg 10 ml van het antibioticum, antimyotic, aan de oplossing en dubbel....

Discussie

Deze methode van isoleren van cardiale immuuncellen maakt de analyse van hun functie, fenotype, en volwassenheid zonder de ongewenste activering die normaal gesproken optreedt tijdens een traditionele enzymatische vertering isolatie techniek. De gemiddelde totale aantal cellen verkregen met deze techniek is ongeveer 400.000 per rat hart, en differentiële kleuring en flowcytometrie-analyse van deze cellen geeft aan gemengde populatie van T-lymfocyten (~ 70%), macrofagen (~ 12%) en mast cellen met het gebruik van deze tec.......

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Naam van de Reagens en apparatuur	Vennootschap	Catalogus nummer	Reacties
Balanced Salt Hanks '	Sigma	H4891	Een fles maakt een L van Balance Hanks 'Salt Oplossing. Reconstitueer Hanks 'Balance Salt Oplossing als een onderdeel van de procedure.
Antibiotica-Antimyotic	Gibco	15240-062
HEPES	Sigma	H3784
Bovine Serum Albumine	Sigma	A3912
250 ml Nalogene Filter Bottle	Thermoscientific	157-0020
12 N HCL	Fisher Scientific	CAS 7647-01-0	Voor 6 N, voegt gelijke volumes van HCL aan gedeïoniseerdhet water.
10 N NaOH	Fisher Scientific	SC267	Voor 5 N, voegt gelijke volumes van NaOH aan gedeïoniseerd water.
Dubbel gedestilleerd water

Tabel van specifieke apparatuur:

Naam van de Reagens en apparatuur	Vennootschap	Catalogus nummer	Reacties
3-O Suture Silk Gevlochten	Ethicon Products	SA64H
Small Animal Ventilator	CWE Incorporated	SAR-830	Stel ademhaling tot 40,5 ademhalingen per minuut.
Bevel 18 gauge naald	BD Biosciences	305199	Trim naald door 1 / 2 tot 3 / 4 van de oorspronkelijke lengte voor gebruik als een tracheale tube.
Tip teflon (met naald verwijderd) van 24-gauge Baxter quick-cath catheter	Baxter	2N111	Verminder de Teflon Tip lengte door 1 / 2 tot 3 / 4.
10 cc spuit	Fisher Scientific	14 tot 823-16B
15 ml Falcon buizen	BD Biosciences	352097
Sorvall RT6000B gekoelde centrifuge	Fisher Scientific	75-004-377	Vergeet niet om pre-cool en houdt bij 4 ° C.
Hyclone	Thermoscientific	S300030.02
Hemocytometer	Hausser Wetenschappelijke	HS-LB-1483