Menselijk In Vitro Onderdrukking als Screening Tool voor de erkenning van een vroege staat van Immune Imbalance

Samenvatting

Tregs zijn krachtige onderdrukkers van het immuunsysteem. Er is een gebrek van unieke oppervlakte markers om ze te definiëren, dus, de definities van Tregs zijn vooral functioneel. Hier beschrijven we een geoptimaliseerde In vitro Assay kunnen identificeren immuun onbalans bij patiënten in gevaar te ontwikkelen T1D.

Samenvatting

Regulerende T-cellen (Tregs) zijn kritisch bemiddelaars van immuun tolerantie voor zelf-antigenen. Daarnaast zijn ze van cruciaal belang zijn regulatoren van de immuunrespons na een infectie. Ondanks inspanningen om unieke oppervlakte marker op Tregs te identificeren, het enige unieke eigenschap is hun vermogen om de proliferatie en de functie van effector T-cellen te onderdrukken. Hoewel het duidelijk is dat alleen in-vitro-testen kunnen worden gebruikt bij de beoordeling van de menselijke Treg functie, wordt dit probleem bij de beoordeling van de resultaten van cross-sectionele studies waarbij gezonde cellen en cellen geïsoleerd uit patiënten met auto-immuunziekten (zoals type 1 diabetes-T1D) nodig te vergelijken. Er is een grote variabiliteit tussen laboratoria in het aantal en type van de reagerende T-cellen, de aard en de sterkte van de stimulatie, Treg: responder ratio's en het aantal en type van antigeen-presenterende cellen (APC) gebruikt in de menselijke in vitro onderdrukking assays. Deze variabiliteit maakt een vergelijking tussen de studies meten van Treg functie moeilijk. De Treg veld heeft behoefte aan een gestandaardiseerde test onderdrukking die goed werkt met zowel bij gezonde vrijwilligers en mensen met auto-immuunziekten. Hebben we een in vitro assay onderdrukking dat er zeer weinig intra-assay variabiliteit in de stimulatie van T-cellen geïsoleerd uit gezonde vrijwilligers in vergelijking met proefpersonen met een onderliggende auto-immune vernietiging van de pancreas β-cellen shows. Het belangrijkste doel van dit stuk is om een te beschrijven in vitro humane onderdrukking test die vergelijking tussen de verschillende groepen onder voorbehoud maakt. Bovendien, deze test heeft de potentie om een klein verlies in nTreg functie af te bakenen en te anticiperen op verder verlies in de toekomst, waardoor het identificeren van patiënten die baat kunnen hebben bij preventieve immunomodulerende therapie ^1. Hieronder geven we een grondige beschrijving van de stappen in deze procedure. We hopen een bijdrage te leveren aan de standaardisatie van de in vitro onderdrukking-test gebruikt om de Treg functie te meten. Daarnaast bieden wij u deze test als een hulpmiddel om een ​​vroege staat van het immuunsysteem onbalans en een mogelijke functionele biomarker voor T1D herkennen.

Protocol

1. Voordat u een onderdrukking-test, moet men de vacht tosylactivated kralen met anti-humaan CD3 (kloon UCHT1, eindconcentratie 1μg/ml) voor de cel stimulatie en daarna controleren of de kralen efficiënt worden bekleed met het opzetten van een in vitro proliferatie assay gebruik van menselijke T-cellen

1. Neem 1 ml van de M-450 tosylactivated kralen uit originele flacon, plaats in de magnetische voet en houdt totdat alle kralen hebben gehandeld op grond van de kant van de buis. Verwijder de buffer, terwijl buis is nog steeds in de magnetische stand. Neem de tube uit de magnetische staan ​​en voeg 1 ml buffer1, de buis weer plaats in de magnetische staan ​​en verwijder de buffer1 terwijl de buis in de magnetische stand; resuspendeer kralen in 1 ml van buffer1 en voeg 40μl van anti-humaan CD3, schud bij 37 ° C gedurende 15 minuten, voeg 0,1% w / v BSA en blijven roeren voor de volgende 16 uur.
2. Was de kralen in buffer2 twee keer gedurende 5 minuten bij 2-8 ° C en een keer in buffer3 gedurende 5 minuten bij 2-8 ° C met behulp van magnetische staan ​​zoals hierboven uitgelegd, verwijder de buffer en resuspendeer de kralen in 1 ml van buffer2, de kralen zijn 4x10 ⁸ / ml uiteindelijke concentratie en klaar voor gebruik.
3. Aliquot 50.000 en 25.000 PBMC / putje in drie exemplaren in een 96-well plaat en voeg wisselend aantal CD3-gecoate kralen (4x10 ⁸ kralen / ml, CD3 1μg/ml, bijvoorbeeld 1, 2, 3, 4, 5 kralen / cel ) om het optimale aantal kralen per cel te bepalen. Na 72 uur in de cultuur, voeg 1μCi ^[3H] thymidine en blijven incuberen bij 37 ° C voor de komende 16 uur. Oogst cellen in Multiscreen oogst plaat (Millipore), voeg scintillatievloeistof en lees de tellingen per minuut (cpm) / goed met Top Count NXT (Packard, CT). Gebruik maken van de kralen / cel-verhouding bij CPM's boven 5000, maar minder dan 15.000 van overstimulatie van Tregs, die onderdrukkende functie kan verliezen te vermijden. Meestal verhouding van 3 kralen / cel stimuleert zowel de responder en Treg cellen in alle groepen onderwerp tot nu toe ^1-4 getest.

2. PBMC geïsoleerd uit vol bloed van gezonde donoren of van menselijke leukopacks of buffy coat (BC), meestal afkomstig van gezonde vrijwilligers en gratis verkrijgbaar bij de plaatselijke Bloedtransfusie Centers (figuur 1)

1. Verdun de BC (~ 50 ml) 1:6 met PBS (voeg 250ml). Nu is er 300ml totale volume. Langzaam laag 25ml van de verwaterde BC op de top van 15ml Ficoll-Paque PLUS toegevoegd aan 50 ml Falcon buizen, zonder de lagen. Centrifugeer op 800xg (1400 toeren in een Sorvall centrifuge met swingende emmer rotor SH-3000) gedurende 30 minuten bij 4 ° C, met remmen uitgeschakeld.
2. Zorgvuldig verzamelen PBMC laag (intermediaire fase) en overbrengen naar een nieuw 50 ml Falcon buizen. Was PBMC door het vullen van de buizen tot 50 ml met DPBS. Verzamel twee celpellets in een buis. Centrifugeer bij 400xg gedurende 10 min bij 4 ° C. Herhaal wasstap twee keer, telkens een combinatie 2 celpellets in een enkele buis. Combineer alle celpellets in een 50 ml buis.
3. Tellen met behulp van PBMC trypan Blue uitsluiting te testen. Maak een 1:10 verdunning in trypan Blue door het toevoegen van 20μl van PBMC aan 180μl van trypan Blue vlek. Meng goed en neem 20μl onmiddellijk tellen in hemacytometer. Tel-nummers van alle ongekleurde en alleen blauw gekleurde cellen zich in twee vierkante blokken met elk 16 kleinere pleinen. Neem het gemiddelde van beide getallen en vermenigvuldig met 10. Deel dit getal door 100 om het aantal PBMC / ml te krijgen. Percentage van de levensvatbare cellen te berekenen als [1 - (aantal blauwe cellen / totaal aantal cellen) x100]. Verder als levensvatbaarheid is ≥ 95%.

3. MACS pre-soort van CD4 T-cellen

1. Alvorens verder te gaan, overdracht 1 ml van PBMC in een nieuwe buis, voeg 4 ml van de media aan cellen voor te bereiden op bestraling met 5000rad-deze zullen worden antigen-presenterende cellen (APC).
2. Centrifugeer de rest van de cellen op 250xg in PBS/2mM EDTA/0.5% BSA buffer voor 10 min. bij 4 ° C. Giet supernatant en resuspendeer cellen in 4 ml van PBS/2mM EDTA/0.5% BSA buffer.
3. Voeg 200μl van MACS anti-CD4 microbolletjes en incuberen bij 4 ° C gedurende 20 minuten.
4. Was door het toevoegen van 40ml van PBS/2mM EDTA/0.5% BSA-buffer en centrifugeer bij 250xg voor 10min bij 4 ° C. Giet supernatant en resuspendeer in 8 ml ontgast, kamertemperatuur PBS/2mM EDTA/0.5% BSA buffer.
5. Filter-scheiden de celsuspensie met behulp van pre-scheiding filters voordat u ze op een LS kolom.
6. Splits de celsuspensie en laag 4ml elk meer dan gekalibreerde LS kolom (met 3 ml van deggassed PBS/2mM EDTA/0.5% BSA buffer). LS column is vastgesteld in de MidiMACS separator. Voordat celsuspensie opraakt, zowel re-run doorstroomsysteem of voeg 3 ml van deggassed kamertemperatuur PBS/2mM EDTA/0.5% BSA buffer en laat de buffer doorlopen. Voeg meer buffer totdat het komt duidelijk.
7. Pipetteer 5 ml deggassed buffer op de LS kolom, verwijder LS Column uit de MidiMACS afscheider en plaatsen in een nieuwe steriele 15 ml buis collectie te laten ~ 1,0 ml doorlopen. Zet de zuiger in de kolom en langzaam druk op de rest van devolume uit.
8. Doe hetzelfde met zowel LS kolommen en combineren de twee CD4 + fracties. Voeg tot 50 ml PBS en te tellen cellen. Verwachte opbrengst is aan 5x10 ⁸ cellen. Centrifugeer bij 400xg gedurende 10 minuten en resuspendeer cellen goed in 2 ml PBS/2mM EDTA/0.5% BSA buffer.

4. Fluorescent Activated Cell Sorting (FACS) isolatie (figuur 2)

1. Maak een cocktail van antilichamen tegen CD markers om de volgende celoppervlaktemerkers (blijven beschermd tegen licht): 20 ui van anti-humaan CD8-FITC (kloon RPA-T8), 20 ui van anti-humaan CD14-FITC (kloon M5E2; LPS receptor), 20 ui van anti-humaan CD32-FITC (kloon FLI8.26, FcγR-type II) en 6 pl van anti-humane CD116-FITC (kloon M5D12, GM-CSFRα keten) en, subsidiair, voeg 40μl anti -menselijke CD4-APCCy7 (kloon RPA-T4).
2. Neem 5μl uit de 2 ml celsuspensie en vlek met 2μl van de vlek cocktail, dit is een buis voor het bepalen van de drempel (fluorochroom Minus One-FMO) ^5.
3. Voeg 50 ui van anti-humaan CD25-PE (kloon M-A251, IL-2Rα) om de vlek cocktail, en voeg de cocktail aan celsuspensie en incuberen bij 4 ° C 30 minuten. Was cellen in PBS buffer, centrifugeer dan bij 400xg gedurende 10 minuten en resuspendeer cellen tot een cel concentratie van 10 ⁷ / ml.
4. Bereid ongekleurd cellen en cellen of kralen gekleurd met enkele fluorochroom als compensatieregeling, gebruiken voor cell sorteren op FACS Aria (BD Biosciences, San Jose, NJ).
5. Verwerven van cellen in de FMO buis waarmee de gebruiker de drempel voor het sorteren van CD25 + T-cellen (Figuur 2a). Stel een hek rondom FITC-negatieve cellen om FITC-positieve cellen, bestaande uit monocyten, macrofagen en alle andere CD4 +-non-T-cellen (Figuur 2b) uit te sluiten.
6. In een aparte plot, trekken poorten voor CD25-, CD25low en CD25high T-cellen-Tregs (top 1% van de cellen die het hoogste aantal CD25) (figuur 2c). Cel subsets Typisch voor een hoge zuiverheidsgraad (figuur 2d, 2e en 2f).
7. Centrifuge verzameling buizen met cellen op 400xg gedurende 10 minuten en bewaar ze op ijs tot plating.

5. Stel celcultuur in 96-well plaat (schema bijgevoegd als Tabel 1) in 200μl/well

1. Aliquot 50μl van CD3-gecoate kralen (1 ug / ml) berekend op 3 kralen / responder cel in een goed, geresuspendeerd in volledige media met 10% gepoolde humane AB-serum in U-bodem 96-wells platen. (Bijvoorbeeld, om 2 ml media te maken met CD3-coating, 7.5μl te nemen van de balans opgemaakt van CD3-gecoate kralen-eindconcentratie 4x10 ⁸ / ml en verdun in 2 ml van de media; elke 50μl zal 75.000 beads-3beads/cell bevatten).
2. Verdunnen bestraald APC tot 5x10 ⁵ / ml celconcentratie en voeg 50μl (bevat 2,5 x 10 ⁴ cellen) in elk putje met een eerder toegevoegd stimulatie, met inbegrip van bronnen bestempeld als "Tregs only", "APC only" en "media alleen maar" in tabel 1.
3. Voeg 2,5 x 10 ⁴ / goed CD4CD25-of CD4CD25low T-cellen in triplo volgende ontwerp in tabel 1.
4. Voeg Tregs aan co-culturen (rij B, tabel 1) in de verhouding 01:10 (2500 Treg cellen) en te putten bestempeld als "Tregs only" en incubeer de plaat bij 37 ° C in CO ₂ incubator met 5% CO ₂ , in verzadigde luchtvochtigheid voor 72 uur.
5. Pulse putten met 1μCi ^[3H] thymidine en blijven incubatie bij 37 ° C voor de volgende 16 uur.

6. Oogsten en tellen

1. Oogst cellen op multiscreen oogst plaat met behulp van Packard filtermate harvester of alternatief systeem.
2. Voeg scintillatievloeistof (Microsint 20), te dekken oogsten plaat met doorzichtige kunststof afdekking ter voorbereiding van de laatste stap.
3. Lees tellingen per minuut (cpm) / goed met Top Count NXT (Packard, CT) of alternatief systeem.

7. Computing percentage van de onderdrukking

1. Als cellen werden gekweekt in triplo, is het gemiddelde berekend voor elke conditie. Als de variatiecoëfficiënt is> 30%, is de uitschieter geëlimineerd en slechts cpm uit twee putten zijn gemiddeld. Percentage van de onderdrukking wordt verkregen door het berekenen van [(sc) / s] x 100%, waarbij s = cpm in enkele cultuur-en c = cpm in co-cultuur.
2. Als naïef (CD25-) en in vivo geactiveerd (CD25low) effector T-cellen worden uitgeplaat als responder T-cellen, wordt het verschil in het vermogen van Tregs aan elk van deze deelverzamelingen te onderdrukken gevangen en gebruikt als een potentiële functionele prognostische indicator gebaseerd op de vooronderstelling dat de geactiveerde cellen moeilijker te onderdrukken.

8. Representatieve resultaten:

Grote variabiliteit in de gebruikte methoden en de resultaten zijn afgeleid van in vitro humane onderdrukking-test voor ons aanleiding om een uitgebreide studie van omstandigheden beïnvloeden van de test ^een uit te voeren. We hebben een test die niet alleen Treg functie tests, maar ook hun zuiverheid, gezien de lage verhouding tussen Tregs: Teffs (1:10), die we eerder vastgesteld ^6. Daarnaast, Tregs verschillen in thMER vermogen om met succes te onderdrukken naïef en in vivo-geactiveerde T-cellen, zelfs bij gezonde personen, zoals weergegeven in figuur 3 en in onze vorige studies ^2,4, die overgaat in meer op de voorgrond als immuun balans is aangetast, zoals bij patiënten in gevaar te ontwikkelen T1D . De test werkte heel goed in de studie, waar we ten opzichte van onderdrukkende functie van de natuurlijke (nTregs), induceerbare (iTregs) en in vitro uitgebreid nTregs, waardoor we hun functie vergelijken tussen gezonde controlepersonen, recent-onset (RO) T1D en langdurige (LS ) T1D onderwerpen. We concludeerden dat RO T1D onderwerpen betere capaciteit van het genereren van functionele zowel iTregs en ​​uitgebreid nTregs in vergelijking met LS T1D en gezonde controlepersonen ⁷ had. Zo kan deze test gebruikt worden als een uitstekend hulpmiddel in de erkenning van zowel een vroege en late toestand van het immuunsysteem onbalans.

Schema 1 Schematische voorstelling van de stappen die betrokken zijn bij in-vitro-onderdrukking-test

Figuur 1. Stappen van de in vitro assay onderdrukking gepresenteerd met foto's

Figuur 2. Poortsignalen strategie in FACS celisolatie. a) de CD25 + drempel was aangepast aan fluorochroom Minus One (FMO), b) cellen werden gated als FITC-negatief, c) FITC-negatieve cellen werden verder gated en verzameld als CD + CD25-, CD + CD25low en CD + CD25high ( Tregs) afgebeeld met percentages, d), FACS gesorteerd Tregs na sortering,) e FACS gesorteerd CD + CD25low na sortering, en f), FACS gesorteerd CD4 + CD25-T-cellen na sortering

Figuur 3. Representatieve resultaten van gezonde proefpersonen een) vertegenwoordiger resultaten van tellingen per minuut (cpm) van gezonde proefpersonen gepresenteerd als losse culturen voor alle cel subsets betrokkenen (naïef-CD25-, in vivo geactiveerde-CD25low, antigeen-presenterende cellen, APC en regulatoire T-cellen-Treg) als co-culturen van responder T-cellen (CD25-of CD25low) en Tregs. b) Percentage van de onderdrukking van elke CD25-en CD25low responder T-cellen door autologe Tregs wordt gepresenteerd voor gezonde proefpersonen (n = 4). Onderdrukking is berekend als [(sc) / s] x 100%, waarbij s = cpm in enkele cultuur-en c = cpm in co-cultuur. Hoewel klein verschil in capaciteit van Tregs aan responder T-cellen te onderdrukken werd opgemerkt, was het niet significant (gepaarde t-test p = 0,08). C) Gepresenteerd worden cpm van het risico onderwerpen voor elke afzonderlijke cultuur, waaronder CD25-en CD25low als responder T-cellen als APC en Tregs, en co-culturen waar elke responder T-cel subset is met Tregs (CD25-/Tregs en ​​CD25low/Tregs). d) Percentage van de onderdrukking van elke CD25-en CD25low responder T-cellen gezaaid door autologe Tregs wordt gepresenteerd voor het risico proefpersonen (n = 4). Het verschil in capaciteit van Tregs aan CD25-versus CD25low responder T-cellen te onderdrukken was significant (gepaarde t-test p = 0,04).

Tabel 1. Schematische opzet van in vitro onderdrukking-test

	1-3	4-6	7-9	10-12
Een	CD4CD25-	CD4CD25low	media alleen	media alleen
B	CD4CD25-/ Tregs	CD4CD25low / Tregs	Tregs alleen	APC alleen
C
D
E
F
G
H

Discussie

Als enige unieke eigenschap om Tregs, moet onderdrukkende betrouwbaar functioneren en op uniforme wijze worden getest tussen de onderwerpen op verschillende fasen van de ziekte ontwikkeling binnen het zelfde en tussen de verschillende studies. Wij bieden u de details van de onderdrukking test ontwikkeld in ons laboratorium als onze bijdrage aan de standaardisatie van deze test. In onze uitgebreide optimalisatie studie hebben we vastgesteld dat T-cel stimulatie met anti-humaan CD3-gecoate kralen (UCHT1 kloon, de concentr...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Naam van het reagens of het instrument	Vennootschap	Catalogus nummer	Commentaar (optioneel)
Ficoll-Paque PLUS	Amersham Pharmacia Biotech	17-1440-03
DPBS-1X	Gibco	14190-144
Trypan Blue	Invitrogen	15250-061
anti-CD4 microbolletjes	Miltenyi	130-045-101
Pre-scheiding filters	Miltenyi	130-041-407
LS kolom	Miltenyi	130-042-401
EDTA	Invitrogen	15575-020
BSA	Sigma-Aldrich	B4287
Anti-humaan CD4-APCCy7 (kloon RPA-T4)	BD Pharmingen	557852
Anti-humaan CD25-PE (kloon M-A251, IL-2Rα)	BD Pharmingen	555432
Anti-humaan CD8-FITC (kloon RPA-T8)	BD Pharmingen	555366
Anti-humaan CD14-FITC (kloon M5E2, LPS receptor)	BD Pharmingen	555397
Anti-humaan CD32-FITC (kloon FLI8.26, FcγR-type II)	BD Pharmingen	555448
Anti-humaan CD116-FITC (kloon M5D12, GM-CSFRα keten)	BD Pharmingen	554532
Dynalbeads M-450 tosylactivated	Invitrogen	140-13
Anti-humaan CD3	Ancell	144-024
Buffer1	Eigengemaakt		0,1 M Na 2 B 4 O 7 pH7.6
Buffer2	Eigengemaakt		PBS/2mM EDTA / 0,1% BSA pH 7,4
Buffer3	Eigengemaakt		0,2 M Tris/0.1% BSA pH8.5
Compleet RPMI media	Eigengemaakt		RPMI 1640 media 2 mM L-glutamine 5 mM HEPES 100 U / ug / ml Peni / strept 0,5 mM natriumpyruvaat
[3 H] thymidine	Perkin Elmer	NET027Z005MC
menselijke gepoolde AB serum	Atlanta Biologicals	S40110
Multiscreen oogst plaat	Millipore	MAHFC1H60
Microsint 20	Perkin Elmer	6013621