Menselijk In Vitro Onderdrukking als Screening Tool voor de erkenning van een vroege staat van Immune Imbalance

Summary

Tregs zijn krachtige onderdrukkers van het immuunsysteem. Er is een gebrek van unieke oppervlakte markers om ze te definiëren, dus, de definities van Tregs zijn vooral functioneel. Hier beschrijven we een geoptimaliseerde In vitro Assay kunnen identificeren immuun onbalans bij patiënten in gevaar te ontwikkelen T1D.

Abstract

Regulerende T-cellen (Tregs) zijn kritisch bemiddelaars van immuun tolerantie voor zelf-antigenen. Daarnaast zijn ze van cruciaal belang zijn regulatoren van de immuunrespons na een infectie. Ondanks inspanningen om unieke oppervlakte marker op Tregs te identificeren, het enige unieke eigenschap is hun vermogen om de proliferatie en de functie van effector T-cellen te onderdrukken. Hoewel het duidelijk is dat alleen in-vitro-testen kunnen worden gebruikt bij de beoordeling van de menselijke Treg functie, wordt dit probleem bij de beoordeling van de resultaten van cross-sectionele studies waarbij gezonde cellen en cellen geïsoleerd uit patiënten met auto-immuunziekten (zoals type 1 diabetes-T1D) nodig te vergelijken. Er is een grote variabiliteit tussen laboratoria in het aantal en type van de reagerende T-cellen, de aard en de sterkte van de stimulatie, Treg: responder ratio's en het aantal en type van antigeen-presenterende cellen (APC) gebruikt in de menselijke in vitro onderdrukking assays. Deze variabiliteit maakt een vergelijking tussen de studies meten van Treg functie moeilijk. De Treg veld heeft behoefte aan een gestandaardiseerde test onderdrukking die goed werkt met zowel bij gezonde vrijwilligers en mensen met auto-immuunziekten. Hebben we een in vitro assay onderdrukking dat er zeer weinig intra-assay variabiliteit in de stimulatie van T-cellen geïsoleerd uit gezonde vrijwilligers in vergelijking met proefpersonen met een onderliggende auto-immune vernietiging van de pancreas β-cellen shows. Het belangrijkste doel van dit stuk is om een te beschrijven in vitro humane onderdrukking test die vergelijking tussen de verschillende groepen onder voorbehoud maakt. Bovendien, deze test heeft de potentie om een klein verlies in nTreg functie af te bakenen en te anticiperen op verder verlies in de toekomst, waardoor het identificeren van patiënten die baat kunnen hebben bij preventieve immunomodulerende therapie ^1. Hieronder geven we een grondige beschrijving van de stappen in deze procedure. We hopen een bijdrage te leveren aan de standaardisatie van de in vitro onderdrukking-test gebruikt om de Treg functie te meten. Daarnaast bieden wij u deze test als een hulpmiddel om een ​​vroege staat van het immuunsysteem onbalans en een mogelijke functionele biomarker voor T1D herkennen.

Protocol

1. Voordat u een onderdrukking-test, moet men de vacht tosylactivated kralen met anti-humaan CD3 (kloon UCHT1, eindconcentratie 1μg/ml) voor de cel stimulatie en daarna controleren of de kralen efficiënt worden bekleed met het opzetten van een in vitro proliferatie assay gebruik van menselijke T-cellen

1. Neem 1 ml van de M-450 tosylactivated kralen uit originele flacon, plaats in de magnetische voet en houdt totdat alle kralen hebben gehandeld op grond van de kant van de buis. Verwijder de buffer, terwijl buis is nog steeds in de magnetische stand. Neem de tube uit de magnetische staan ​​en voeg 1 ml buffer1, de buis weer plaats in de magnetische st....

Discussion

Als enige unieke eigenschap om Tregs, moet onderdrukkende betrouwbaar functioneren en op uniforme wijze worden getest tussen de onderwerpen op verschillende fasen van de ziekte ontwikkeling binnen het zelfde en tussen de verschillende studies. Wij bieden u de details van de onderdrukking test ontwikkeld in ons laboratorium als onze bijdrage aan de standaardisatie van deze test. In onze uitgebreide optimalisatie studie hebben we vastgesteld dat T-cel stimulatie met anti-humaan CD3-gecoate kralen (UCHT1 kloon, de concentr.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Naam van het reagens of het instrument	Vennootschap	Catalogus nummer	Commentaar (optioneel)
Ficoll-Paque PLUS	Amersham Pharmacia Biotech	17-1440-03
DPBS-1X	Gibco	14190-144
Trypan Blue	Invitrogen	15250-061
anti-CD4 microbolletjes	Miltenyi	130-045-101
Pre-scheiding filters	Miltenyi	130-041-407
LS kolom	Miltenyi	130-042-401
EDTA	Invitrogen	15575-020
BSA	Sigma-Aldrich	B4287
Anti-humaan CD4-APCCy7 (kloon RPA-T4)	BD Pharmingen	557852
Anti-humaan CD25-PE (kloon M-A251, IL-2Rα)	BD Pharmingen	555432
Anti-humaan CD8-FITC (kloon RPA-T8)	BD Pharmingen	555366
Anti-humaan CD14-FITC (kloon M5E2, LPS receptor)	BD Pharmingen	555397
Anti-humaan CD32-FITC (kloon FLI8.26, FcγR-type II)	BD Pharmingen	555448
Anti-humaan CD116-FITC (kloon M5D12, GM-CSFRα keten)	BD Pharmingen	554532
Dynalbeads M-450 tosylactivated	Invitrogen	140-13
Anti-humaan CD3	Ancell	144-024
Buffer1	Eigengemaakt		0,1 M Na 2 B 4 O 7 pH7.6
Buffer2	Eigengemaakt		PBS/2mM EDTA / 0,1% BSA pH 7,4
Buffer3	Eigengemaakt		0,2 M Tris/0.1% BSA pH8.5
Compleet RPMI media	Eigengemaakt		RPMI 1640 media 2 mM L-glutamine 5 mM HEPES 100 U / ug / ml Peni / strept 0,5 mM natriumpyruvaat
[3 H] thymidine	Perkin Elmer	NET027Z005MC
menselijke gepoolde AB serum	Atlanta Biologicals	S40110
Multiscreen oogst plaat	Millipore	MAHFC1H60
Microsint 20	Perkin Elmer	6013621