Fotolyse van gekooide verbindingen maakt de productie van snelle en gelokaliseerde toename van de concentratie van diverse fysiologisch actieve verbindingen. Hier laten we zien hoe de patch-clamp opnames gecombineerd met fotolyse van gekooide cAMP of gekooid Ca voor de studie van olfactorische transductie in gedissocieerde muis olfactorische sensorische neuronen te verkrijgen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Flash fotolyse van Gekooide verbindingen in de Cilia van olfactorische sensorische neuronen
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Fotolyse van gekooide verbindingen maakt de productie van snelle en gelokaliseerde toename van de concentratie van diverse fysiologisch actieve verbindingen 1. Gekooide verbindingen zijn moleculen gemaakt fysiologisch inactief door een chemische kooi die kan worden doorbroken door een flits van ultraviolet licht. Hier laten we zien hoe de patch-clamp opnames gecombineerd met fotolyse van gekooide verbindingen voor de studie van olfactorische transductie in gedissocieerde muis olfactorische sensorische neuronen te verkrijgen. Het proces van olfactorische transductie (figuur 1) vindt plaats in de cilia van olfactorische sensorische neuronen, waar odorant binding aan receptoren leidt tot de toename van cAMP dat cyclische nucleotide-gated (CNG) kanaal 2 wordt geopend. Ca ingang door CNG kanalen activeert Ca-geactiveerde Cl kanalen. We laten zien hoe de neuronen distantiëren van de muis olfactorische epitheel 3 en hoe CNG kanalen of Ca-geactiveerde Cl-kanalen activeren door fotolyse van gekooide cAMP 4 of gekooid Ca 5 </ Sup>. We maken gebruik van een flitslamp 6,7 aan ultraviolette flitsen van toepassing op de ciliaire regio vrij maken cAMP of Ca, terwijl patch-clamp opnames worden genomen om de stroom te meten in de whole-cell voltage-clamp configuratie 8-11.
Protocol
1. Instrumentatie
- Om de respons van olfactorische sensorische neuronen op fotolyse van caged verbindingen te meten, gebruiken we een flitslamp in combinatie met een typisch patch-clamp registratiesysteem bestaande uit: een patch-clamp versterker, een registratie-elektrode en een referentie-elektrode verbonden met de head-stage van een patch-clamp versterker, een digitizer, een computer, software voor data-acquisitie, micromanipulatoren, een epifluorescentiemicroscoop, een perfusiesysteem, een trillingsvrije tafel en een Faraday-kooi (Figuur 2).
- Om een hoogintensieve flits ultraviolet (UV) licht te genereren, gebruiken we een Xenon-flitslamp (Rapp OptoElectronic JML-C2 Flash Unit, Figuur 3A) die werkt door een hoogspanningscondensator te ontladen over een short-arc flitsbuis gevuld met Xenon-gas6-7. De lichtflits kan handmatig of via de computer worden getriggerd, met behulp van dezelfde software die de elektrofysiologische acquisitie aanstuurt.
- Een UV short-pass filter, geoptimaliseerd voor uncaging-toepassingen (270-390 nm), wordt in een uitgangssleuf van de flitslamp geplaatst en een kwartsvezeloptische lichtgeleider wordt aangesloten op de microscoop (zie 1.5).
- De intensiteit van de lichtflits en daarmee de mate van fotolyse kan worden aangepast door specifieke parameters te wijzigen:
spanning of capaciteit6. De lichtintensiteit is namelijk gerelateerd aan de in de condensator opgeslagen energie en is afhankelijk van de capaciteitswaarde en de spanning erover, volgens de standaardrelatie 0.5 CV2. Op het voorpaneel van onze flitslamp kan een van drie capaciteitswaarden worden geselecteerd (C1=1000 μF, C2=2000 μF, of C3=3000 μF) en de spanning kan worden gevarieerd tussen 100 en 385 Volt (Figuur 3A), wat een opgeslagen energie oplevert variërend tussen 5 en 220 J. De flitsduur varieert van 0,5 tot 1 ms bij volledige halve maximale breedte en is afhankelijk van de geselecteerde capaciteitswaarde. Voordat een andere capaciteit wordt gekozen of de spanning op een lagere waarde wordt ingesteld, is het noodzakelijk de condensator te ontladen door de ontladingsmodus op het voorpaneel van de flitslamp te selecteren (Figuur 3A).
De lichtenergie is echter niet simpelweg proportioneel aan de opgeslagen energie vanwege diverse redenen gerelateerd aan de fysica van gasontladingen en aan niet-lineaire verliezen in het circuit naarmate de elektrische energie toeneemt6. Om de energie geassocieerd met een lichtflits te meten, kan een joulemeter worden gebruikt, zoals de JM10 van RappOptoElectronics. Let op dat de energie bij de uitgang van de kwarts lichtgeleider met het UV-filter op zijn plaats in de range 1-15 mJ per flits ligt, zoals vermeld in de gebruikershandleiding van de Rapp OptoElectronic Flash Unit.
Een fotodiodeset (Figuur 3B) wordt meegeleverd met de flitslampunit en kan worden gebruikt om variaties in lichtintensiteiten te schatten als functie van C en V. De output van de fotodiode is namelijk proportioneel aan de lichtintensiteit. Volgens de instructies in de gebruikershandleiding wordt de lichtgeleider aangesloten op de ingang van de fotodiodeset, terwijl de uitgang wordt aangesloten op een oscilloscoop. Figuur 3C toont de piek-outputspanning van de fotodiode als respons op lichtflitsen voor de drie capaciteitswaarden C1, C2, of C3, beschikbaar in onze flitslampunit, tegenover de aangelegde spanning. Deze waarden zullen veranderen naarmate de flitslamp veroudert. Het is goede praktijk om regelmatig de fotodiode te gebruiken om de verslechtering van de flitslamp te controleren.
In plaats van de capaciteit en/of spanning op het voorpaneel aan te passen, wordt een preciezere en snellere controle van de lichtintensiteit verkregen door neutraaldichtheidsfilters in een tweede filtersleuf van de flitslamp te plaatsen (Figuur 3A). Deze aanpak is sneller en bovendien wordt de flitsduur, die afhankelijk is van de geselecteerde capaciteitswaarde, niet gewijzigd. Met neutraaldichtheidsfilters variërend van 100% tot 0,1% transmissie kan de flitsintensiteit snel over een groot bereik worden aangepast. - De lichtflits wordt via een kwartsvezeloptische lichtgeleider naar het neuron gericht, dat is geplaatst op schaaltjes met een glazen bodem (Figuur 2). De lichtgeleider is met behulp van een adapter verbonden met de epifluorescentie-opstelling van de omgekeerde microscoop. Een aangepaste filterkubus zonder excitatiefilter richt de UV-straal via een dichroïsche spiegel op het neuron.
- Het licht wordt gefocust via een 100x olie-immersieobjectief. Het door de flits beslagen gebied wordt gevisualiseerd door de lichtgeleider in een illuminator te plaatsen die een continue bron van zichtbaar licht levert. Het beeld (geel weergegeven in de video) wordt via een CCD-camera die met de microscoop is verbonden op een monitor bekeken. De contour van het verlichte gebied wordt op de monitor getekend om het UV-flitsgebied voor de experimenten te lokaliseren. Voordat de UV-flits wordt afgegeven, wordt de ciliaire regio van het neuron in het op de monitor getekende gebied gebracht.
- De afmeting van de UV-lichtspot wordt bepaald door de vergroting van het objectief, de diameter van de lichtgeleider en de positie van de lichtgeleider aan de achterzijde van de microscoop. We gebruiken een 100x vergroting olie-immersieobjectief. De diameter van de cirkelvormige spot wordt gemeten door het licht van een illuminator op een micrometer-slide te richten die op de tafel van de microscoop is geplaatst. De spotdiameter in onze opstelling is ongeveer 16, 33, 50 of 105 μm voor een lichtgeleider met een diameter van respectievelijk 200, 400, 600 of 1250 μm.
2. Oplossingen bereiden
Dissectie
- Ringersoplossing: 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 10 mM HEPES, 10 mM glucose, 1 mM natriumpyruvaat (pH 7.4 ingesteld met 1M NaOH).
- Stopmix-oplossing: Ringersoplossing met 0,1 mg/ml BSA, 0,3 mg/ml leupeptine en 0,02 mg/ml DNaseI.
- Divalent-vrije Ringersoplossing: 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 10 mM HEPES, 1 mM EDTA, 10 mM glucose, 1 mM natriumpyruvaat (pH 7.4 met 1M NaOH). Voeg 200 μM cysteïne en 2 U/ml papaïne toe voor enzymatische dissociatie.
Opmerking: Filter de oplossingen steriel voor dissectie.
Patch-clamp registratie-oplossingen
Extracellulaire oplossingen
- Extracellulaire Ringer-oplossing: 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 10 mM HEPES, 10 mM glucose, 1 mM natriumpyruvaat (pH 7,4 ingesteld met 1M NaOH).
- Ringer-oplossing met laag Ca-gehalte: 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 10 mM EGTA, 1 mM MgCl2, 10 mM HEPES, 10 mM glucose, 1 mM natriumpyruvaat (pH 7,4 ingesteld met 1M NaOH).
Intracellulaire oplossingen
Bereid en gebruik oplossingen van "caged" verbindingen altijd bij zwak licht om degradatie van de "caged" verbindingen door omgevingslicht te voorkomen. Bescherm de containers tegen licht met aluminiumfolie.
Gekooide cAMP:
- Maak een intracellulaire oplossing bestaande uit 145 mM KCl, 4 mM MgCl2, 0.5 mM EGTA, 10 mM HEPES, 1 mM MgATP en 0.1 mM NaGTP (pH 7.4 ingesteld met 1M KOH).
- Maak een stamoplossing door caged cAMP (BCMCM-cAMP4) op te lossen in DMSO tot een concentratie van 50 mM. Verdeel dit in aliquoten van 5 μl. Bewaar deze tot een jaar bij -20°C.
- Los een aliquot van de caged cAMP-stamoplossing op in de intracellulaire oplossing om een eindconcentratie van 50 μM caged cAMP te verkrijgen. Meng dit met een vortex.
- Maak aliquoten van 1 ml van de intracellulaire oplossing met caged cAMP. Bewaar deze tot twee maanden bij -20°C tot aan gebruik.
Gekooide Ca:
We bereiden intracellulaire oplossingen voor die 3 mM DMNP-EDTA5 bevatten, waarvan 50% is geladen met 1.5 mM Ca.
- Maak een intracellulaire oplossing bestaande uit 140 mM KCl (of CsCl) en 10 mM HEPES (pH 7.4, ingesteld met 1M KOH of CsOH).
- Open een vial met 5 mg DMNP-EDTA. Voeg 52.8 μl van een 0.1 M calciumchloride-standaardoplossing en 1 ml intracellulaire oplossing toe. Meng dit met een vortex.
- Om het vrijkomen van gecaged Ca door omgevingslicht te voorkomen, wordt de oplossing overgebracht naar een buis die met aluminiumfolie tegen licht is afgeschermd. Voeg intracellulaire oplossing toe tot een eindvolume van 3.5 ml is bereikt. Meng dit met een vortex. Maak aliquots van ongeveer 1 ml van de intracellulaire oplossing met gecaged Ca en bewaar deze tot twee maanden bij -20°C tot gebruik.
Opmerkingen: Bescherm tijdens de experimenten de oplossingen van de gecaged verbindingen tegen licht met aluminiumfolie en bewaar deze op ijs. Filter de intracellulaire oplossing steriel.
3. Dissociatie van olfactorische sensorische neuronen van muizen
De dieren werden behandeld in overeenstemming met de Italiaanse richtlijnen voor het gebruik van laboratoriumdieren (Decreto Legislativo 27/01/1992, no. 116) en de richtlijnen van de Europese Unie voor dieronderzoek (No. 86/609/EEC).
- Bereid drie glazen bodemschalen voor die zijn gecoat met 10 mg/ml concanavaline-A en 10 mg/ml poly-L-lysine.
- Bereid ter voorbereiding op de dissectie 1 ml nul-divalente Ringer-oplossing. Vul twee met Sylgard gecoate Petrischalen van 50 mm met Ringer-oplossing en plaats deze op ijs. Koel daarnaast een papaine-cysteïne mengsel, 0,5 ml van de stop-mix oplossing en een spuit met een 0,22 μm filter met ongeveer 10 ml Ringer-oplossing.
- Offer een muis voordat door CO2 asfyxie gevolgd door decapitatie. Verwijder de huid boven de schedel, snijd langs de kaaklijnen en plaats de kop in een met Sylgard gecoate Petrischaal.
- Plaats de schaal onder een stereomicroscoop. Bissecteer de kop sagittaal langs de middellijn met een scalpel. Draai de helft van de kop met de mediale zijde naar boven. Verwijder voorzichtig het septum om de turbinate (zie ook Cygnar et al., 201013) bloot te leggen.
- Verwijder met pincet nummer 3 en een scalpel de turbinate die bekleed zijn met het olfactorische epitheel. Draag deze over naar een met Sylgard gecoate Petrischaal.
- Scheid de stukken olfactorisch epitheel van de aangehechte delen van de turbinate met superfijn pincet nummer 55. Draag deze over naar een buisje met 1 ml nul-divalente Ringer-oplossing. Voeg het papaine- en cysteïne mengsel toe. Hak het epitheel fijn met microschaartjes en incubeer 3 minuten bij kamertemperatuur. Hak voorzichtig opnieuw fijn met de microschaartjes en wacht nog 5 minuten.
- Draag de inhoud over naar een buisje met 0,5 ml van de stop-mix oplossing met behulp van een vlamgepolijste Pasteur-pipet.
- Centrifugeer 5 minuten bij 300 g (1500 RPM). Verwijder het supernatant en voeg ongeveer 1 ml gefilterde Ringer-oplossing toe. Tritureer voorzichtig met een vlamgepolijste Pasteur-pipet.
- Plateer ongeveer 0,3 ml van de oplossing met de cellen in het midden van de drie glazen bodemschalen. Laat de cellen ongeveer één uur bezinken bij +4°C. Voeg Ringer-oplossing toe.
4. Opname
- Bereid patchpipetten voor uit borosilicaatcapillairen om weerstanden van 3-7 MΩ te verkrijgen wanneer deze gevuld zijn met intracellulaire oplossing.
- Plaats een glazen bodemschaaltje met de gedissocieerde olfactorische sensorische neuronen op de tafel van de omgekeerde microscoop. Perfuseer met Ringers-oplossing.
- Bescherm een spuit met de intracellulaire oplossing die caged compounds bevat tegen licht met aluminiumfolie en bewaar deze gekoeld. Werk bij gedimd licht om degradatie van de caged compounds door omgevingslicht te voorkomen.
- Zoek bij een vergroting van 100x naar een geïsoleerd olfactorisch sensorisch neuron met intacte cilia. Verplaats de microscooptafel om het ciliaire gebied binnen de cirkel op de monitor te positioneren om het eerder geïdentificeerde UV-flitsgebied te lokaliseren.
- Vul een patchpipet met de intracellulaire oplossing die de caged compound bevat met behulp van een flexibele naald. Verwijder luchtbellen uit de pipetpunt. Plaats de pipet in de houder op de headstage van de patch-clampversterker. Benader het soma van het neuron met de micromanipulator en pas een lichte zuigkracht toe om een gigaohm-seal te verkrijgen. Stel de spanning in op -60 mV en pas extra zuigkracht toe om de whole-cell modus te bereiken met behulp van standaard patch-clamptechnieken12.
- Wacht ten minste twee minuten voor de diffusie van de caged compound in de cilia.
- Start op de computer een stimulatieprotocol en registreer de respons. Gebruik een low-pass filter op 1 kHz en digitaliseer met een samplefrequentie van ten minste 2 kHz.
- Een typisch stimulatieprotocol klemt de spanning op een constante waarde en triggert het afgeven van een UV-flits vanuit de flitslamp voor fotolyse van de caged compound in het ciliaire gebied.
5. Representatieve resultaten:
U moet in staat zijn om lokale uncaging van gecaged cAMP of gecaged Ca uit te voeren in de ciliaire regio van een geïsoleerde olfactorische sensorische neuron en de stroomrespons te registreren in de whole-cell voltage-clamp configuratie.
Figuur 4 laat een typische binnenwaartse stroom zien die is opgewekt door een UV-flits die fotolyse van gecaged cAMP veroorzaakt, geregistreerd bij een voltage van -60 mV in aanwezigheid van een extracellulaire Ringer-oplossing met een laag Ca-gehalte. Onder deze conditie is de binnenwaartse stroom te wijten aan Na-instroom via CNG-kanalen. De stijgende fase van de stroom was snel en werd gefit met een enkele exponentiële functie met een tijdconstante van 3,4 ms.
Figuur 5A-B tonen de responsen van een andere olfactorische sensorische neuron in een lage Ca-concentratie en in Ringer-oplossing met 1mM Ca. De stijgende fase van de stroom bij -60 mV werd veel trager en multifasisch (Figuur 5 A-B). Dit is te wijten aan de werking van Ca dat de cilia binnendringt via CNG-kanalen en een secundaire Cl-stroom activeert10. De eerdere cationische stroomcomponent, veroorzaakt door activatie van CNG, is kleiner in Ringer-oplossing met 1mM Ca dan in een oplossing met lage Ca vanwege de blokkade door de permeerende Ca-ionen die de totale stroom verminderen.
Een andere manier om de toename van Ca in de cilia te verminderen, is door het neuron te klemmen op +60 mV (Figuur 5 C-D). De stijgende fase van de respons door cAMP-uncaging bij +60 mV werd goed beschreven door een enkele exponentiële functie met een tijdconstante van 6,7 ms, wat duidt op de aanwezigheid van slechts één stroomcomponent.
Door Ca via fotorelease vrij te maken in de cilia van een olfactorisch sensorisch neuron, zou u een snel stijgende stroom moeten kunnen meten. Deze stroom wordt gedragen door Cl-ionen. Figuur 6 A toont binnenwaartse stromen bij -50 mV die worden geïnduceerd door fotorelease van gecaged Ca in reactie op UV-flitsen van verschillende intensiteiten. De stijgingsfase van de Ca-geactiveerde Cl-stromen werd goed beschreven door een enkele exponentiële functie met tijdconstanten variërend tussen 3,8 en 5 ms (Figuur 6 B).
Figuur 1. Olfactorische transductie in de cilia van olfactorische sensorische neuronen. Geurmoleculen binden aan geurreceptoren (OR), waardoor een G-eiwit wordt geactiveerd dat op zijn beurt adenylylcyclase (ACIII) activeert, wat leidt tot een intracellulaire toename van cAMP. cAMP opent cyclisch nucleotide-gestuurde (CNG) kanalen, waardoor Na- en Ca-ionen kunnen binnendringen. De intracellulaire Ca-toename activeert Ca-geactiveerde Cl-kanalen. Caged cAMP of caged Ca kan in de cilia worden geïntroduceerd door diffusie via een patchpipet. Een flits UV-licht veroorzaakt fotolyse van de caged verbinding (Gewijzigd, met toestemming van Pifferi et al. 20062).
Figuur 2. Het patch-clamp registratie- en flitsfotolysesysteem. De componenten van de opstelling omvatten een patch-clamp versterker, een computer, een digitizer, een epifluorescentiemicroscoop, een xenon-flitslamp, een CCD-camera en een monitor. De blauwe en violette lijnen geven respectievelijk het pad van het zichtbare en het UV-licht aan.
Figuur 3. Xenonflitslamp. (A) Lichtbron gebruikt voor flitsfotolyse van gecageerde verbindingen. (B) Fotodiodu-module gebruikt om de intensiteit van de lichtflits te evalueren. (C) De lichtgeleider van de flitslamp werd aangesloten op de ingang van de fotodiodu en de output werd gevisualiseerd op een oscilloscoop. Een van de drie beschikbare capaciteitswaarden (C1, C2 of C3) werd geselecteerd via de schakelaar op het voorpaneel van de flitslamp en de spanning werd gewijzigd door aan de knop op het voorpaneel te draaien. De outputspanning van de fotodiodu als reactie op verschillende flitsintensiteiten werd uitgezet tegen de aangelegde spanning voor elke capaciteitswaarde: C1 = 1000 μF, C2 = 2000 μF, of C3 = 3000 μF. Er werd een lichtgeleider met een diameter van 600 μm gebruikt.
Figuur 4. Patch-clampmeting als respons op fotolyse van caged cAMP in een extracellulaire oplossing met een laag Ca-gehalte. (A) Whole-cell stroomrespons geïnduceerd in een geïsoleerd olfactorisch sensorisch neuron door fotolyse van caged cAMP gelokaliseerd in de cilia. Een UV-flits werd afgegeven op het tijdstip dat wordt aangegeven door de pijl. Het holdingpotentiaal was -60 mV. (B) De stijgende fase van de stroom werd goed benaderd met een enkele exponentiële functie (stippellijn) met een tijdconstante van 3,4 ms.
Figuur 5. Stroomresponsen geïnduceerd door fotolyse van gecaged cAMP in low Ca- en in Ringersoluties. (A) Een olfactorisch sensorisch neuron werd ondergedompeld in Ringersolutie met 1 mM Ca of in low Ca-olutie bij een holdingpotentiaal van -60 mV. Een UV-flits werd afgegeven op het tijdstip dat wordt aangegeven door de pijl. (B) Stroomresponsen uitgezet op een uitgebreide tijdschaal vertoonden een multifasische stijgfase in Ringer, terwijl de stijgfase voor de respons gemeten in low Ca-olutie goed werd benaderd door een enkele exponentiële functie (stippellijn) met een tijdconstante van 3.5 ms. (C) Stroomresponsen van hetzelfde neuron als getoond in (A), ondergedompeld in Ringersolutie bij een holdingpotentiaal van -60 en +60 mV. (D) Stroomresponsen uitgezet op een uitgebreide tijdschaal vertoonden een multifasische stijgfase bij -60 mV, terwijl bij +60 mV de stijgfase goed werd benaderd door een enkele exponentiële functie met een tijdconstante van 6.7 ms (stippellijn).
Figuur 6. Reacties op fotolyse van gecaged Ca. (A) Whole-cell stromen geïnduceerd door fotolyse van gecaged Ca bij -50 mV. UV-flitsen werden afgegeven op het tijdstip dat door de pijl wordt aangegeven. Flitsintensiteiten werden gevarieerd met neutrale dichtheidsfilters. (B) Een uitgebreidere tijdschaal laat de snelle toename van de stroom zien na Ca-fotovrijgave. De stromen werden goed benaderd door een enkele exponentiële functie (stippellijnen), met tijdconstanten van 5, 4,8, 3,8 ms. (Gereproduceerd, met toestemming, uit Boccaccio & Menini, 200710).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Flash fotolyse van gekooide verbindingen in combinatie met patch-clamp opnames is een handige techniek om een snelle en lokale sprongen te krijgen in de concentratie van fysiologisch actieve moleculen binnen en buiten cellen. Verschillende soorten gekooide compounds1 zijn gesynthetiseerd, en deze techniek kan worden toegepast op verschillende soorten cellen, met inbegrip van gekweekte cellen die ion kanalen die kunnen worden geactiveerd of gemoduleerd door fotolyse van enkele van de beschikbare gekooide verbindingen <...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Geen belangenconflicten verklaard.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Uitrusting | Vennootschap | Catalogus nummer | Reacties |
| Adapter module flitslamp aan microscoop | Rapp Opto-elektronische | FlashCube 70 | |
| Lucht tafel | TMC | MICRO-g 63-534 | |
| Digitizer | Axon Instruments | Digidata 1322A | |
| Data Acquisition Software | Axon Instruments | pClamp 8 | |
| Data Analysis Software | WaveMetrics | Igor | |
| Spiegel voor adapter module | Rapp Opto-elektronische | M70/100 | |
| Elektrode houder | Axon Instruments | 1-HL-U | |
| Faraday-kooi | Op maat gemaakt | ||
| Filter kubus | Olympus | U-MWU | Excitatiefilter verwijderd |
| Flitslamp | Rapp Opto-elektronische | JML-C2 | |
| Pincet Dumont # 55 | Wereld precisie-instrumenten | 14099 | |
| Glazen capillairen | Wereld precisie-instrumenten | PG10165-4 | |
| Glazen bodem schaal | Wereld precisie-instrumenten | FD35-100 | |
| Illuminator | Olympus | Highlight 3100 | |
| Omkeermicroscoop | Olympus | IX70 | |
| Micromanipulators | Luigs & Neumann | SM I | |
| Micropipet Puller | Narishige | PP-830 | |
| Monitor | HesaVision | MTB-01 | |
| Grijsfilters | Omega Optical | varieert | |
| Doelstelling 100X | Zeiss | Fluar 440285 | Ofwel Zeiss of Olympus |
| Doelstelling 100X | Olympus | UPLFLN 100XOI2 | Ofwel Zeiss of Olympus |
| Optisch UV-filter shortpass | Rapp Opto-elektronische | SP400 | |
| Patch-clamp versterker | Axon Instruments | Axopatch 200B | |
| Foto Diode Assembly | Rapp Opto-elektronische | PDA | |
| Kwarts lichtgeleider | Rapp Opto-elektronische | varieert | We maken gebruik van 600 micrometer diameter |
| Zilverdraad | Wereld precisie-instrumenten | AGT1025 | |
| Zilver grond pellet | Warner instrumenten | 64-1309 | |
| Xenon booglamp | Rapp Opto-elektronische | XBL-JML |
| Reagens | Vennootschap | Catalogus nummer |
|---|---|---|
| BCMCM-kooi cAMP | Biolog | B016 |
| Bovine serum albumine (BSA) | Sigma | A8806 |
| CaCl2 standaard oplossing 0,1 M | Fluka | 21059 |
| Gekooide Ca: DMNP-EDTA | Invitrogen | D6814 |
| Cysteine | Sigma | C9768 |
| Concanavaline Een type V (ConA) | Sigma | C7275 |
| CsCl | Sigma | C4036 |
| DMSO | Sigma | D8418 |
| DNAse I | Sigma | D4527 |
| EDTA | Sigma | E9884 |
| EGTA | Sigma | E4378 |
| Glucose | Sigma | G5767 |
| HEPES | Sigma | H3375 |
| KCl | Sigma | P3911 |
| KOH | Sigma | P1767 |
| Leupeptin | Sigma | L0649 |
| MgCl2 | Fluka | 63020 |
| Papaïne | Sigma | P3125 |
| Poly-L-lysine | Sigma | P1274 |
| NaCl | Sigma | S9888 |
| NaOH | Sigma | S5881 |
| NaPyruvate | Sigma | P2256 |
Referenties
- Ellis-Davies, G. C. R. Caged compounds: photorelease technology for control of cellular chemistry and physiology. Nat. Methods. 4, 619-628 (2007).
- Pifferi, S., Boccaccio, A., Menini, A. Cyclic nucleotide-gated ion channels in sensory transduction. FEBS Lett. 580, 2853-2859 (2006).
- Bozza, T. C., Kauer, J. S. Odorant response properties of convergent olfactory receptor neurons. J. Neurosci. 18, 4560-4569 (1998).
- Hagen, V., Bendig, J., Frings, S., Eckardt, T., Helm, S., Reuter, D. Highly Efficient and Ultrafast Phototriggers for cAMP and cGMP by Using Long-Wavelength UV/Vis-Activation. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 40, 1045-1048 (2001).
- Kaplan, J. H., Ellis-Davies, G. C. Photolabile chelators for the rapid photorelease of divalent cations. Proc. Natl. Acad. Sci. 85, 6571-6575 (1988).
- Rapp, G. Flash lamp-based irradiation of caged compounds. Methods. Enzymol. 291, 202-222 (1998).
- Gurney, A. M. Flash photolysis of caged compounds. Microelectrodes: Theory and Applications. Montenegro, I., Queiros, M. A., Daschbach, J. L. , Proc. NATO Adv. Study Inst. Portugal. (1991).
- Lagostena, L., Menini, A. Whole-cell recordings and photolysis of caged compounds in olfactory sensory neurons isolated from the mouse. Chem. Senses. 28, 705-716 (2003).
- Boccaccio, A., Lagostena, L., Hagen, V., Menini, A. Fast adaptation in mouse olfactory sensory neurons does not require the activity of phosphodiesterase. J. Gen. Physiol. 128, 171-184 (2006).
- Boccaccio, A., Menini, A. Temporal development of cyclic nucleotide-gated and Ca2+ -activated Cl- currents in isolated mouse olfactory sensory neurons. J. Neurophysiol. 98, 153-160 (2007).
- Sagheddu, C., Boccaccio, A., Dibattista, M., Montani, G., Tirindelli, R., Menini, A. Calcium concentration jumps reveal dynamic ion selectivity of calcium-activated chloride currents in mouse olfactory sensory neurons and TMEM16B-transfected HEK 293T cells. J. Physiol. 588, 4189-4204 (2010).
- Balana, B., Taylor, N., Slesinger, P. A. Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (44), e2189-e2189 (2010).
- Cygnar, K. D., Stephan, A. B., Zhao, H. Analyzing Responses of Mouse Olfactory Sensory Neurons Using the Air-phase Electroolfactogram Recording. J. Vis. Exp. (37), e1850-e1850 (2010).
- Bernardinelli, Y., Haeberli, C., Chatton, J. Y. Flash photolysis using a light emitting diode: an efficient, compact, and affordable solution. Cell. Calcium. 37, 565-572 (2005).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
