Voorspelling van HIV-1 coreceptor Usage (tropisme) Sequentie analyse met een Genotypische Approach

Summary

De voorspelling van de coreceptor gebruik van HIV-1 is vereist voor de toediening van een nieuwe klasse antiretrovirale geneesmiddelen, namelijk coreceptor antagonisten. Het kan worden uitgevoerd door sequentieanalyse van de Env Gen en de daaropvolgende interpretatie door middel van een op internet gebaseerde interpretatie systeem (geno2pheno _[Coreceptor]).

Abstract

Maraviroc (MVC) is de eerste goedgekeurde antiretrovirale geneesmiddel van de klasse van co-receptor antagonisten. Het bindt aan de coreceptor CCR5 gastheer die wordt gebruikt door de meeste HIV-stammen om de menselijke immune cellen (Fig. 1) infecteren. Andere HIV-isolaten een andere coreceptor, de CXCR4. Die receptor wordt gebruikt, wordt bepaald door het virus Env-eiwit (Fig. 2). Afhankelijk van de coreceptor, worden de virussen geclassificeerd als R5 of X4 respectievelijk. MVC bindt aan de CCR5 receptor remmen van de opneming van R5 virussen in de doelcel. In de loop van de ziekte, kan X4 virussen ontstaan ​​en groeien de R5 virussen. Bepaling van coreceptor gebruik (ook wel tropisme) is daarom absoluut noodzakelijk voor toediening van MVC, waarop door EMA en FDA.

De studies voor MVC efficiëntie te motiveren, MERIT en 1029 zijn uitgevoerd met de Trofile bepaling van het Monogram, San Francisco, Verenigde Staten Dit is een hoge kwaliteit assay gebaseerd op Sophisticated recombinant tests. De aanvaarding van deze test voor de dagelijkse routine is vrij laag buiten de Verenigde Staten, omdat de Europese artsen eerder de neiging om te werken met decentrale deskundige laboratoria, die ook voorzien gelijktijdige weerstand testen. Deze laboratoria hebben ondergaan verschillende kwaliteitsborging evaluaties, de laatste wordt gepresenteerd in 2011 ^1.

Sinds enkele jaren, hebben wij controlewerkzaamheden uitgevoerd tropisme vaststellingen op basis van sequentie-analyse van de HIV env-V3-gen regio (V3) ^2. Deze regio draagt ​​voldoende informatie om een ​​betrouwbare voorspelling te voeren. De genotypische bepaling van coreceptor gebruik biedt voordelen zoals: kortere doorlooptijd (gelijk aan het testen van resistentie), lagere kosten, de mogelijkheid om de resultaten aan te passen aan de behoeften van de patiënt en de mogelijkheid van het analyseren van klinische monsters met een zeer lage of zelfs niet-detecteerbare viral load (VL ), met name omdat het aantal monsters geanalyseerd met VL <1000 kopieën / ulruwweg toegenomen in de laatste jaren (Fig. 3).

De voornaamste stappen voor tropisme testen (Fig. 4) toonde in deze video:

1. Verzamelen van een bloedmonster
2. Isolatie van het HIV RNA uit het plasma en / of HIV proviraal DNA van mononucleaire bloedcellen
3. Amplificatie van het env-gebied
4. Amplificatie van het V3 gebied
5. Sequentie reactie van de V3 amplicon
6. Zuivering van de sequentie samples
7. Sequencen van het gezuiverde monsters
8. Sequence bewerken
9. Sequencing data-interpretatie en tropisme voorspelling

Protocol

Het protocol wordt samengevat in Fig. 4.

1. Nemen van bloedmonsters

1. Verzamel minimaal 3 ml bloed in EDTA buizen op de klinische locatie.
2. De monsters kunnen worden opgeslagen tot een week bij 4 ° C.
3. Stuur het EDTA-bloedmonsters zo snel mogelijk naar het laboratorium per gewone post.

2. Isolatie van HIV RNA en / of DNA

1. Verkrijgen viraal RNA en / of DNA van 1000 ui volbloed, serum of plasma, met de Magna Pure Compact nucleïnezuurisolatiemethoden I I kit en de Magna Pure Compact System.
2. Elueer het verkregen RNA of DNA in 50 pl TE buffer. Alternatief kunnen andere nucleïnezuren zuiveringsprocedures worden gebruikt.

3. Amplificatie van het env-gebied

Amplificeren het env-gebied (figuren 2 en 4) van zowel plasma RNA of proviraal DNA. Een 1245 bp lange product, waarbij de meerderheid van de Env proteïne (nt 6,556 tot 7,811 according tot HXB2) gegenereerd.

1. RNA-monsters: RT-PCR reactie
   1. Viral RNA presenteert een zeer complex secundaire structuur (Fig. 4) die de RT-reactie kunnen belemmeren. Om dit probleem te vermijden, incubeer 10 pi RNA bij 65 ° C gedurende 10 minuten (reeds in de PCR buis en in de PCR machine) en verlaag de temperatuur tot 50 ° C.
   2. Voeg 40 ul van de PCR Master Mix waaronder de primers Env-F en Env-R.
      
      Master Mix voor RT-PCR In-House-systeem:
      

      	volume / reactie (pl)	eindconcentratie
      RNase-free H 2 O	14,4
      5x Buffer (Qiagen OneStep RT-PCR Kit)	10	1x
      5x Q-Solution	10	1x
      dNTP Mix (10 mM elk)	2	400 uM van elk dNTP
      Enzym-Mix (Qiagen OneStep RT-PCR Kit)	2
      Primer Env-F (100 uM)	0,3	0,6 uM
      Primer Env-R (100 uM)	0,3	0,6 uM
      RNase Inhibitor (RNasin)	1	5 eenheden / reactie

      
      
      Env-F: 5'-CAAAGCCTAAAGCCATGTGTAAA 3 '(nt 6556 → 6586 volgens HXB2)
      
      Env-R: 5'-AGTGCTTCCTGCTGCTCCTAAGAACCC -3 '(nt 7785 ← 7811)
   3. Voer de RT reactie bij 50 ° C gedurende 30 minuten.
   4. Lopen de eerste PCR als volgt:
      
      

      95 ° C, 15min	1 x
      95 ° C, 30 sec 50 ° C, 30 sec 72 ° C, 2 min	1 x
      95 ° C, 30 sec 56 ° C, 30 sec 72 ° C, 2 min	38 x
      72 ° C, 10 min 4 ° C ∞

2. DNA monsters: PCR reactie
   
   Voor provirale DNA monsters initieel RT-reactie nodig en de PCR reactie kan direct.
   1. Voeg 40 ul PCR Master Mix tot 10 pl provial DNA.
      
      
      Master Mix voor PCR In-House-systeem:
      

      	volume / reactie (pl)	eindconcentratie
      RNase-free H 2 O	15,4
      5x Buffer (HotStarTaq DNA Polymerase)	10	1x
      5x Q-Solution	10	1x
      dNTP Mix (10 mM elk)	2	400 uM van elk dNTP
      Enzym-Mix (HotStarTaq DNA Polymerase)	2
      Primer Env-F (100 uM)	0,3	0,6 uM
      Primer Env-R (100 uM)	0,3	0,6 uM

      
      
      Env-F: 5'-CAAAGCCTAAAGCCATGTGTAAA -3 '(nt 6556 → 6586)
      
      Env-R: 5'-AGTGCTTCCTGCTGCTCCTAAGAACCC -3 '(nt 7785 ← 7811)
   2. Voer het PCR wijze als hiervoor beschreven voor RNA monsters (stap 3.1.4).

4. Amplificatie van het V3-gebied: geneste PCR

1. Voor de geneste PCR, met 5 ul van de eerste PCR reactie (zonder voorafgaande analyse agarose gel) als template en voeg 95 ul PCR Master Mix.
   
   Master Mix voor Geneste-In-House PCR

   	volume / reactie (pl)	eindconcentratie
   H 2 O	61,9
   10x PCR Buffer	10	1x
   5x Q-Solution	20	1x
   dNTP Mix (10 mM elk)	2	200 uM van elk dNTP
   Primer Env-2F (100 uM)	0,3	0,6 uM
   Primer Env-2R (100 uM)	0,3	0,6 uM
   HotStarTaq DNA Polymerase	0,5	2,5 eenheden / reactie

   
   
   Env-2F: 5'-GTCCAAAGGTATCCTTTGAGCCAATTC -3 '(nt 6838 → 6864)
   
   Env-2R: 5'-CACCACTCTTCTCTTTGCCTTGGTGGGTGC -3 '(nt 7712 ← 7742)
2. Voer de PCR als volgt:

   93 ° C, 15min	1 x
   95 ° C, 30 sec 50 ° C, 30 sec 72 ° C, 90 sec	1 x
   95 ° C, 30 sec 56 ° C, 30 sec 72 ° C, 90 sec	43 x
   72 ° C, 10 min 4 ° C ∞

3. Analyseer het PCR product op een 1% agarose gel (Fig. 4). De verwachte product is 902 bp lang.
4. Zuivering van de sequentie monsters.
   1. Zuiver het PCR product met de Qiagen PCR zuivering kit, met het protocol, oplossingen en micro-kolommen van de leverancier. Elueer in 30 tot 100 ul PE buffer, afhankelijk van de band intensiteit.
   2. Als alternatief kunnen de monsters worden gezuiverd met ExonucleaseIk en Fast AP (Thermo alkalische fosfatase). Daartoe voeg 6 pl Exo-AP Mix tot 15 pl PCR product en incubeer 15 minuten bij 37 ° C.

      580 pi H 2 O

      66 ul snel AP

      13,4 ul Exo I

5. Sequentie reactie van de V3 amplicon

1. De sequentie reactie bestaat uit een PCR reactie met slechts een van de volgende primers:
   
   Env-2: 5'-GTACAATGYACACATGGAATTAGGC -3 (nt 6959 → 6980)
   Env-5: 5'-AAAATTCCCCTCCACAATTA - 3 '(nt 7352 ← 7371)
   Env-6: 5'-GGCCAGTAGTATCAACTCAAC - 3 '(nt 6979 → 7000)
   Env-7: 5'-TGTCCACTGATGGGAGGGGC - 3 '(nt 7530 ← 7549)
   Env-10: 5 '- GCAGAATAAAACAAATTATAAACATGTGGC - 3' (nt 7478 ← 7507)
   Env-11: 5 '- TACATTGCTTTTCCTACTTTCTGCCAC - 3' (nt 7638 ← 7664)
   Eerste keuze primers zijn: Env-2, Env-6 of Env-7, Env-11
2. Gebruik 1 ui van het gezuiverde V3 amplicon als sjabloon en voeg 9 pi PCR master-mix.
   
   Sequencing Master Mix:

   4 pl volgorde mix (HIV-Genotyping Kit)

   4 ui H 2 O

   Primer 1 pi (100 pmol / ul)

3. Voer het sequentie reactie als volgt:

   96 ° C, 10 sec
   50 ° C, 10 sec	36 x
   60 ° C, 45 sec
   4 ° C ∞

6. Zuivering van de sequentie samples

Zuiver sequenties using Sephadex G-50 superfine.

1. Vul het juiste aantal putjes in de "kolom loader" met Sephadex G-50 superfine. Breng de Sephadex de filterplaat MAHVN4510 door draaien.
2. Voeg 300 ul Milli-Q H ₂ O aan elk putje in de filterplaat en incubeer voor tenminste 3 uur bij 2-8 ° C.
3. Centrifugeer de platen gedurende 5 minuten bij 910Xg en 4-15 ° C. Gooi de doorstroom.
4. Voeg 10 ul H ₂ O product om de sequentie en de sequentie pipet op het opgezwollen Sephadex plaat.
5. Het gezuiverde product te krijgen, centrifugeer de plaat gedurende 5 minuten. 910Xg bij 4-15 ° C en verzamelen en de doorstroming.

7. Sequencing de gezuiverde monsters op de sequencer ABI Prism 3130 XL

1. Voor elke run, veranderen de buffer en controleer het volume van het polymeer (POP7). Indien nodig Vervang het polymeer kolf door een nieuwe.
2. De opgeslagen run omstandigheden, waaronder een injectietijd van 18 seconden.
3. In deze machine wordt de verzameling van de gegevens van een signaal run met 16 sequentie samples ongeveer 60 min (36 cm capillair) of 150 min (50 cm capillair).

8. Sequence bewerken

1. Gebruik het programma Lasergene (DNA-ster) tot uitlijnen en bewerken van de sequenties (Fig. 5). Andere sequentie bewerkingsprogramma's worden gebruikt. Een "V3-consensus B" en env consensus sequentie als referentie.
2. Lasergene creëert een consensus sequentie van het geanalyseerde monster met alle ruwe gegevens en opslaan als FASTA file. Het FASTA bestand is een tekstbestand dat een header met de naam van het monster en de nucleotide sequentie omvat.

9. Sequencing data-interpretatie en tropisme voorspelling

1. Sequencing interpretatie van gegevens wordt uitgevoerd door de web-based interpretatie systeem geno2pheno _[coreceptor] ( http://coreceptor.bioinf.mpi-inf.mpg.de/index.php). Voor het tropisme voorspelling kunnen verschillende instellingen worden geselecteerd FPR. De standaardinstelling is afhankelijk van de Duits-Oostenrijkse therapie richtlijnen. Voor FPR ≥ 20%, wordt het virus geclassificeerd als R5 als FPR ≥ 20% en X4 voor FPR <12,5%.
2. Upload het FASTA bestand in de server. Deze server vertaalt de nucleotidesequentie in aminozuren, uitgelijnd met de V3-consensus sequentie B en vormt een subtype classificatie. Bovendien genereert een voorspelling van de coreceptor gebruik (Fig. 4) uitgedrukt als valse meldingen (FPR).

10. Representatieve resultaten

De geno2pheno _[coreceptor] uitgang toont een gegradeerde interpretatie van de tropisme. Afhankelijk van de waarschijnlijkheid van het coreceptor gebruik, de interpretatie van tekst en achtergrond kleur varieert van groen (<20% FPR), hetgeen duidt op een veilige toediening voor MVC, naar geel, wijst op een mogelijke, laag risico en uiteindelijk in rood. Rood is de kleur suggererenING niet aan MVC voorschrijven. Bovendien genereert de server een pdf rapport dat kan worden afgedrukt, gevuld met patiënt en voorbeeldgegevens en naar de arts. Voorbeelden van geno2pheno _[coreceptor] uitgang afgebeeld in Fig. 6.

Figuur. 1. Schematische replicatie van HIV. Het virion moet binden aan de cellulaire receptor CD4 als en de CCR5 of CXCR4 coreceptor als bedoeld. De co-receptor CCR5 kan worden geblokkeerd met CCR5-antagonisten zoals Maraviroc (MVC, Celsentri, Selzentry). Na fusie van de virale en cellulaire membranen wordt het virale nucleocapside model in het cytoplasma. De nucleocapside demonteert en het virale RNA complex wordt vrijgemaakt in het cytoplasma. Het virale reverse transcriptase (RT) transcribeert het genoom RNA in provirale DNA, dat vervolgens wordt getransporteerd naar de nucleus en geïntegreerd in het gastheergenoom door HIV integrase. Cellulair RNA polymerasen transcribe virale genoom en messenger RNA uit het provirale genoom. De virale eiwitten in het cytoplasma en naar het celoppervlak. De virusdeeltjes knop als onrijpe, niet-infectueuze virionen uit de cellen. De HIV-protease splitst de eiwitten produceren aan besmettelijke deeltjes. Remming van een van de stappen leidt tot een onderbreking van de replicatiecyclus.

De anti-retrovirale geneesmiddelen en de replicatie stap die ze remmen zijn rood gemarkeerd.

Het virale RNA en proviraal DNA (materiaal dat wordt gebruikt voor het tropisme of weerstand analyse) zijn gemarkeerd in het groen.

Figuur 2. HIV provirale genoom. Het HIV deeltje gebouwd met verschillende structurele eiwitten huizen en diverse enzymen en eiwitten zowel tegen virale en cellulaire oorsprong. Het cijfer tonens de locatie van de genen in het virale genoom. De oppervlakte-eiwitten gp120 en gp41 vormen spikes op het oppervlak van het virion en contact de menselijke cel om de membraanfusie te voeren. In het onderste deel van de figuur zijn de PCR amplificatieproducten en de primers die in ons protocol getoond.

Figuur 3. Percentage van de patiënten met een lage virale belasting (VL) metingen geanalyseerd voor drug-weerstand of tropisme bepaling bij het ​​Instituut voor Virologie, Universiteit van Keulen (Duitsland).

Figuur 4. Algemeen schema van de experiment .. Gelieve Klik hier voor een grotere versie van deze figuur te zien.

Figuur 5. Sequence bewerken met Lasergene. V3 Het amplicon gesequentieerd met ten minste een voorwaartse en een achterwaartse primer. Lasergene alignes de ". Abi" bestanden verkregen uit de sequencer met de referentie sequenties "V3-Consensus B" en env. Lasergene wordt een consensussequentie met alle rijen gegevens. De referentie sequenties worden gemarkeerd (en dan grijs getoond) zodat deze niet bijdragen aan het monster consensussequentie.

Figuur 6. Tropisme voorspelling rapporten die door het geno2pheno _[coreceptor] tool.The rapporten worden gegenereerd als pdf-bestanden die kunnen worden opgeslagen en voltooid in de computer. Aanvullende gegevens zoals ons patiënt naam, datum van bloed extractie, enz., kan handmatig worden opgenomen met behulp van een pdf writer programma. Specifieke opmerkingen kunnen ook worden toegevoegd. These gegevens zijn exclusief op de computer van de gebruiker en niet op de geno2pheno _[coreceptor] server. Gelieve Klik hier voor een grotere versie van deze figuur te zien.

Discussion

De V3-sequentie maakt een betrouwbare voorspelling virale tropisme, zoals getoond in klinische studies ^3-9. In feite is genotypische bepaling overwogen in de huidige Europese en Duitse-Oostenrijkse richtlijnen ^10.

Vergeleken met fenotypische testen niet alleen de omzet korter (gelijk aan resistentietest), maar ook zijn de kosten. Daarnaast is een groot voordeel van genotypische testen is dat de resultaten worden als FPR en kan dus worden aangepast aan de behoeften van de patiënt. Trofile resultaten, daarentegen, zijn gewoon R5 of X4 rapporten en toegang tot de ruwe data niet gegeven.

Op dit moment, de Europese richtlijnen suggereren een FPR cut-off van 20% ^10, terwijl de Oostenrijks-Duitse richtlijnen laten de aanpassing van het FPR cut-off specifiek aan de behoeften van elke patiënt ^11. In deze lijn, voor patiënten met een breed scala van antiretrovirale geneesmiddelen opties, hogere FPR cut-offs (> 20%) zijn aanbevelingbeëindigd. Daarentegen voor zwaar voorbehandelde patiënten met een beperkte therapeutische opties, lagere FPR cut-offs (> 5%) worden gebruikt. Deze vorm van therapie begeleiding is momenteel aan de gang door de weerstand testen om NRTI's, NNRTI's, PI's, en Inis, waar een deel-actieve geneesmiddelen kunnen worden opgenomen in de behandeling van patiënten met een verminderde therapeutische opties. Bovendien, met een groeiend aantal genotypisch-begeleide therapie veranderingen, de klinisch relevante FPR cut-offs worden voortdurend bijgesteld door een panel van bio-informatici, virologen en clinici.

Een ander belangrijk voordeel van de genotypische tropisme testen is de mogelijkheid te analyseren klinische monsters met zeer lage of niet detecteerbare viral load (VL). In deze gevallen, wanneer plasma RNA niet amplificeerbaar is, kan het provirale DNA gesequeneerd worden en gebruikt voor betrouwbare voorspellingen ^9,12. Van de nota, is het aantal patiënten met een lage of niet detecteerbare viral load sterk toegenomen in de laatste jaren. Tot dusverre heeft de Trofiel test laat alleen de analyse van monsters van patiënten met VL <1000 kopieën / ml. Echter hebben voorlopige studies aangetoond dat proviraal DNA kan ook worden adecuate worden getest door Trofile ^13.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Naam van het reagens	Vennootschap	Catalogusnummer	Reacties
Magna Pure Compact Nucleic Acid Isolation Kit I	Roche Diagnostics	04 802 993 001
Magna Pure Compact System	Roche Diagnostics	03731146001
T3000 Thermocycler	Biometra	050 tot 723
One Step RT-PCR Kit	Qiagen	210215
HotStarTaq Master Mix Kit	Qiagen	203445
QIAquick PCR Purification Kit	Qiagen	28106
Exonuclease I (Exo I)	Fermentas	EN0582
FastAP Thermosensitive alkalische fosfatase	Fermentas	EF0651
BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit	Applied Biosystems	4337457
Sephadex G-50 superfijne	GE Healthcare	17-0041-01
ABI Prism 3130 XL capillaire sequencer	Applied Biosystems	3130XL