Efficiënte Afleiding van de Mens Neuronale voorouders en neuronen van pluripotente menselijke embryonale stamcellen met op kleine moleculen Inductie

Samenvatting

We hebben een protocol voor de inductie van neuroblasts rechtstreeks van pluripotente menselijke embryonale stamcellen gehouden onder bepaalde voorwaarden met kleine moleculen, die afleiding van een groot aanbod van menselijke neurale voorouders en neuronale celtypes in het ontwikkelen van CNS voor neurale reparatie mogelijk maakt.

Samenvatting

Er is een grote onvervulde behoefte aan een klinisch-geschikte menselijke neuronale cel bron voor reparatie of regeneratie van het beschadigde centrale zenuwstelsel (CZS) structuur en circuits in de gezondheidszorg industrie van vandaag. Cell-gebaseerde therapieën houden een grote belofte om de verloren zenuwweefsel en functie voor de CZS-stoornissen te herstellen. Hebben echter cellen therapieën op basis van CNS-afgeleide neurale stamcellen aangetroffen aanbod beperking en moeite om in de klinische setting te gebruiken vanwege hun beperkte uitbreiding mogelijkheden in de cultuur en bij gebreke van plasticiteit na uitgebreide passage ^1-3. Ondanks enkele positieve resultaten, de CNS-afgeleide menselijke neurale stamcellen (hNSCs) lijken hun therapeutische effecten uit te oefenen in de eerste plaats door hun niet-neuronale nakomelingen door middel van het produceren van trofische en neuroprotectieve moleculen te redden van de endogene cellen ^1-3. Als alternatief, pluripotente menselijke embryonale stamcellen (hESC 's) aanbieden behandelingen voor een breed scala van neurologische stoornissen door supplying de diversiteit van de menselijke neuronale celtypen in de ontwikkelingslanden CNS voor regeneratie ^1,4-7. Echter, hoe de grote differentiatie potentieel van pluripotente hESC 's kanaal efficiënt en voorspelbaar om een ​​gewenste fenotype is een grote uitdaging voor zowel de ontwikkeling en klinische studie vertaling. Conventionele benaderingen vertrouwen op multi-lijn helling van pluripotente cellen door spontane kiemlaag differentiatie, wat resulteert in inefficiënte en oncontroleerbare lineage-inzet die vaak wordt gevolgd door fenotypische heterogeniteit en instabiliteit, dus een hoog risico op tumorgeniciteit ^7-10. Daarbij mag undefined buitenlandse / dier biologische aanvullingen en / of feeders die typisch zijn gebruikt voor de isolatie, uitbreiding en differentiatie van hESC 's direct gebruik maken van een dergelijke cel-gespecialiseerde transplantaten in patiënten problematisch ^11-13. Om deze obstakels, hebben we besloten de elementen van een bepaalde cultuur-systeem noodzakelijk en voldoende voor de sustaining de epiblast pluripotence van hESC 's, die als een platform voor de novo afleiding van klinisch-geschikte hESC' s en effectief te regisseren die hESC 's uniform naar klinisch relevante stromingen door kleine moleculen ¹⁴ (zie een schema in Fig. 1). Retinoïnezuur (RA) niet leiden tot neuronale differentiatie van ongedifferentieerde hESC 's onderhouden op feeders ^{1, 14.} En in tegenstelling tot de muis SER, het behandelen van hESC-gesplitste embryoid instanties (EBS) slechts licht verhoogt de lage opbrengst van neuronen ^{1, 14, 15.} Echter, na het screenen van een groot aantal kleine moleculen en groeifactoren, vonden we dat een dergelijke omschreven voorwaarden gerenderd retinoïnezuur (RA) voldoende is om de specificatie van neuroectoderm direct veroorzaken van pluripotente hESC 's die verder gevorderd om te neuroblasts dat menselijke voorouders en neuronale neuronen in de gegenereerde het ontwikkelen van CNS met hoog rendement (fig. 2). Definieerden we de voorwaarden voor de inductie van neuroontploffing rechtstreeks van pluripotente hESC 's zonder tussenkomst van een multi-lijn embryoid body fase, waarin goed gecontroleerde efficiënte afleiding van een groot aanbod van menselijke neurale cellen over het gehele spectrum van de ontwikkelingsstadia van cel-gebaseerde therapieën.

Protocol

1. Solution en Media Voorbereiding

1. Gelatine coating oplossing: 0,1% (w / v) gelatine in DDH ₂ O, geautoclaveerd en bewaar bij 4 ° C.
2. Matrigel coating oplossingen. Stock oplossing: slow dooi Matrigel (10 ml) bij 4 ° C gedurende de nacht, 10 ml ijskoude DMEM of DMEM/F12 toe te voegen, goed mengen en aliquot 1 ml / tube onder gesteriliseerd weefselkweek kap, bewaren bij -20 ° C. Werkende oplossing: slow ontdooien 1 ml Matrigel aliquot bij 4 ° C gedurende 1-2 uur, transfer naar 14 ml gekoelde DMEM of DMEM/F12 en goed onder gesteriliseerd weefselkweek kap onmiddellijk mix voor het coaten.
3. Human laminine coating oplossing: verdun 1 ml menselijke laminine-oplossing (0,5 mg / ml in Tris gebufferd NaCl, bewaren bij -80 ° C, langzame dooi bij 4 ° C gedurende 1-2 uur) met ijskoude DMEM of DMEM/F12 aan 12,5 ml werkoplossing (40 ug / ml) onder gesteriliseerde weefselkweek kap direct voor coating.
4. Groeifactor voorraad oplossingen (500-1000X): los groeifactor bij 10 ug/ Ml in gesteriliseerde buffer (0,5% BSA, 1,0 mM DTT, 10% glycerol, 1XPBS) en op te slaan als 50 tot 100 ul / tube aliquots bij -80 ° C.
5. All-trans-retinoïnezuur werkoplossing (1000X): 10 mM in DMSO, op te slaan in gelijke fracties bij -80 ° C.
6. MES-media: DMEM/F12 of KO-DMEM (80%), KO serum vervanging (20%), L-alanyl-L-GLN of L-GLN (2 mM), MEM niet-essentiële aminozuren (MNAA, 1X), en β-mercapto-ethanol (100 uM), gefilterd en opgeslagen bij 4 ° C, aangevuld met 20 ng / ml bFGF voor gebruik. Of vervanging van "knock-out (KO) serum vervanging" met gedefinieerde componenten: DMEM/F12 of KO-DMEM (100%), L-alanyl-L-GLN of L-GLN (2 mM), MNAA (1x), MEM essentieel aminozuren (MEAA, 1X), en de β-mercapto-ethanol (100 uM), gefiltreerd en bewaar bij 4 ° C, aangevuld met bFGF (20 ng / ml), humane insuline (20 ug / ml), ascorbinezuur (50 ug / ml), menselijke activine A (50 ng / ml), humaan albumine / Albumax (10 mg / ml), en de menselijke transferrine (8 ug / ml) voor gebruik.
7. NSC media: DMEM/F12 (100%), N-2 supplement (1x), heparine (8 ug / ml).

2. Plaat Coating

1. Coat platen met gelatine: voeg 2,5 ml / putje van gelatine oplossing voor de 6 goed platen en overnacht in een 37 ° C bevochtigde incubator uitbroeden.
2. Coat platen met laminin: chill gelatine-gecoate platen en verwijderen gelatine, voeg 2,5 ml / putje Matrigel of menselijke laminine coating werkende oplossing voor pre-gekoelde 6-well platen en incubeer ontsloten bij 4 ° C gedurende de nacht.

3. Passage en Seeding Ongedifferentieerde hESC 's onder bepaalde omstandigheden

1. Laat hESC kolonies groeien tot 5-7 dagen oud, en neem hESC cultuur plaat te ontleden microscoop (pre-warm ontleden etappe naar 37 ° C) onder ontleden gesteriliseerd kap.
2. Selecteer hESC kolonies te worden gesplitst. Morfologisch, moeten deze kolonies hebben> 75% ongedifferentieerd hESC 's (kleine, compacte cellen), meestal enigszins ondoorzichtige (geen witte-opgestapelde cellen, niet duidelijk-gedifferentieerde cellen) met gedefinieerde rand underneath het ontleden microscoop. Zorgvuldig een overzicht van de geselecteerde kolonies en verwijder gedifferentieerde fibroblasten laag rond de kolonie en alle gedifferentieerde onderdelen (indien aanwezig) van de kolonie met de rand van P2 steriele pipet tip of getrokken glas capillair. (Let op, pluripotent hESC 's zijn op een voorbijgaande fase, ondergaan spontane differentiatie, zelfs onder optimale omstandigheden, hoewel de voorkeur, is het moeilijk om na te gaan scripties cellen zijn 100% ongedifferentieerd onder dissectiemicroscoop,> 75% ongedifferentieerd worden meestal beschouwd als de pas punt. De gedifferentieerde cellen meestal niet zaad en blijven groeien, geëlimineerd in de passage proces)
3. Verwijder de oude media die drijvende vrijstaande gedifferentieerde cellen door aspireren. Wassen met hESC media (zonder bFGF) een keer. Voeg 3 ml / putje verse hESC media met 20 ng / ml bFGF.
4. Snijd de ongedifferentieerde hESC kolonies in kleine stukjes, en maak met een steriele pipet tip of getrokken glas capillair.
5. Het zwembad van het medium met vrijstaande kolonie stukken samen in een 50 ml conische buis. Ze wast de plaat met 1 ml / putje hESC media die 20 ng / ml bFGF en het zwembad bij elkaar.
6. Zuig het Matrigel of de menselijke laminine-oplossing uit de gecoate verse platen. Aliquot 4 ml / putje hESC media die kolonie stukken tot een 6-wells plaat. Voorzichtig dragen de plaat incubator zonder schudden en laat kolonie stukken zaad 's nachts, zonder te storen in een vochtige 37 ° C incubator met een atmosfeer van 5% CO _2.

4. Neurale Inductie van hESC 's onder gedefinieerde Culture systeem met retinoïnezuur

1. Op dag 3 na het uitzaaien, verwijder dan de meeste van de oude media uit elk putje van de plaat en laat genoeg media om hESC kolonies te worden ondergedompeld (nooit toestaan ​​dat hESC 's uit te drogen). Te vervangen met 4 ml / putje verse hESC media met 20 ng / ml bFGF en 10 uM retinoïnezuur.
2. Vervang de oude media met verse hESC media met 20 ng / ml en bFGF10 uM retinoïnezuur om de andere dag, en laat neurale-geïnduceerde hESC kolonies groeien tot dag 7 of 8. Alle cellen in de kolonie zal ondergaan morfologie van wijzigingen in de grote gedifferentieerde cellen die zal zich blijven vermenigvuldigen. De kolonies zullen in omvang toenemen om de plaat te dekken op dag 7 of 8, en cellen zal beginnen op te stapelen in sommige gebieden van de kolonies.

5. Voortzetting van neuronale differentiatie in suspensie Cultuur

1. Neem hESC cultuur plaat te ontleden microscoop (pre-warm ontleden etappe naar 37 ° C) onder ontleden gesteriliseerd kap. Voorzichtig een overzicht van de koloniën en verwijder fibroblast laag rond de kolonie (gedifferentieerde cellen migreerden uit de kolonie) met de rand van de P2 steriele pipet tip of getrokken glas capillair.
2. Verwijder de oude media die drijvende vrijstaande fibroblast cellen door aspireren. Wassen met hESC media (zonder bFGF) een keer. Voeg 3 ml / putje verse hESC media (zonder bFGF).
3. Snijd de neurale-induced hESC kolonies in kleine stukjes, en maak met een steriele pipet tip of getrokken glas capillair.
4. Het zwembad van het medium met vrijstaande kolonie stukken samen in een 50 ml conische buis. Ze wast de plaat met 1 ml / putje hESC media (zonder bFGF) en het zwembad bij elkaar.
5. Aliquot 4 ml / putje serumvrij hESC media die kolonie stukken tot een 6-well Ultra-bevestigingsplaat en incuberen in een 37 ° C bevochtigde incubator te laten zweven cellulaire clusters (neuroblasts) te vormen voor de 4-5 dagen.

6. Neuronale Fenotype Rijping in Adhesive Cultuur

1. Het zwembad van het media die drijvende neuroblasts samen in een 50 ml conische buis. Centrifugeer bij 1400 rpm gedurende 5 minuten. Aspireren van de oude media zo veel als je kunt en toevoegen gelijke hoeveelheid verse NSC media met VEGF (20 ng / ml), NT-3 (10 ng / ml), en BDNF (10 ng / ml).
2. Pipet op en neer aan drijvende neuroblasts en aliquot mix 4 ml / goed op 6-well platen. De neuroblasts kan ook seeded in een laminine / collageen (Matrigel) of de menselijke laminine gepolymeriseerd 3-dimensionale matrix in serum-vrij NSC media met VEGF (20 ng / ml), NT-3 (10 ng / ml), en BDNF (10 ng / ml) . Overdracht van de platen om een ​​37 ° C bevochtigde incubator om neuroblasts te hechten 's nachts.
3. Vervang de NSC media met VEGF (20 ng / ml), NT-3 (10 ng / ml), en BDNF (10 ng / ml) om de andere dag. Uitgebreide netwerken van neurieten-dragende neuronale cellen en gepigmenteerde cellen beginnen te verschijnen binnen twee weken van continue teelt en de toename van het aantal met de tijd, en kon worden volgehouden meer dan 3 maanden.

7. Representatieve resultaten:

Retinoïnezuur (RA) is weergegeven voldoende is om hESC 's gehandhaafd in de gedefinieerde cultuur-systeem om de overgang van pluripotentie uitsluitend aan een neuro-ectodermale fenotype (Fig. 2A) veroorzaken. Bij blootstelling van ongedifferentieerde hESC 's tot RA, zullen alle cellen binnen de kolonie ondergaan morfologie van wijzigingen in degrote gedifferentieerde cellen die niet langer tot expressie pluripotentie-geassocieerde merkers, zoals aangegeven door okt-4, en beginnen uitdrukken diverse neuroectoderm-gerelateerde markers, zoals HNK1, AP2, en TrkC (Fig. 2B). Deze grote gedifferentieerde cellen zal blijven vermenigvuldigen en de kolonies zullen in omvang toenemen, uitgaande spontaan aan het begin van de neuronale marker β-III-tubuline (Fig. 2B) te drukken. De meer volwassen neuronale marker Kaart-2 zal beginnen te verschijnen in gebieden van de kolonies waar de cellen hebben opgestapeld (Fig. 2B). Samenvallend met het uiterlijk van de neuro-ectodermale cellen en neuronale differentiatie, zal de neuronale specifieke transcriptie factor Nurr1, betrokken bij dopaminerge neuronale differentiatie en activering van de tyrosine hydroxylase (TH)-gen ^16, verplaatsen naar de kern (Fig. 2B). Na vrijstaand, zal de RA-behandelde hESC 's vorm drijvende cellulaire clusters (neuroblasts), in een suspensie culture naar de neurale differentiatie-proces voort te zetten. Na het verwijderen van bFGF en na het toelaat de neuroblasts te hechten aan een weefselkweek plaat of gezaaid in een laminine / collageen gepolymeriseerde 3-dimensionale matrix in een serum-vrij gedefinieerde medium, β-III-tubuline-en Kaart-2-expressie en neurieten -dragende cellen en gepigmenteerde cellen zullen beginnen te verschijnen met een drastische verhoging van de efficiency ten opzichte van spontane multi-lijn differentiatie van hESC 's zonder behandeling, over dezelfde periode, en kan worden volgehouden voor meer dan 3 maanden (Fig. 2C).

Figuur 1 Een schema van goed gecontroleerde efficiënte inductie van menselijke pluripotente stamcellen uitsluitend aan een bepaald klinisch relevante lijn door een eenvoudige bepaling van kleine moleculen.

Figuur 2 Retinoïnezuur veroorzaakt neurale afkomst specificatie en neuronale progressie direct van pluripotentie onder gedefinieerde omstandigheden. (A) Schematische voorstelling van het protocol de tijd lijn van gerichte neuronale differentiatie van hESC 's. (B) Bij blootstelling van ongedifferentieerde hESC 's aan retinoïnezuur (RA) onder de gedefinieerde cultuur, grote gedifferentieerde okt-4 (rood) negatieve cellen binnen de kolonie begon te ontstaan, in vergelijking met de mock-behandeld (DMSO) hESC' s als de controle- . RA-geïnduceerde gedifferentieerde Oct-4-negatieve cellen begonnen te uiten HNK-1 (rood), AP2 (rood), TrkC (groen), en dan β-III-tubuline (rood), consistent met vroege neuro-ectodermale differentiatie. Deze cellen bleven rijpen uiteindelijk de uiting van de neuronale marker Kaart-2 (groen), meestal in gebieden waar de cellen begonnen op te stapelen. Samenvallend met het uiterlijk van de neuro-ectodermale cellen en neuronale differentiatie, de neuronale specifieke transcriptie factor Nurr1 (groen), betrokken bijdopaminerge neuronale differentiatie en activering van de tyrosine hydroxylase (TH)-gen, translocatie naar de kern. Alle cellen worden getoond door DAPI kleuring van hun kernen (blauw). (C) behandeling van RA induceert de differentiatie naar een neuronale lijn met een hoge efficiëntie zoals beoordeeld door de uitgebreide netwerken van neurieten-dragende cellen die β-III-tubuline (rood) en Kaart-2 (groen, weergegeven in een drie-dimensionale matrix). Pijlen geven gepigmenteerde cellen typisch van die in het CZS. Alle cellen worden getoond door DAPI kleuring van hun kernen (blauw) in het inlegwerk. Schaal bars: 0,1 mm.

Discussie

Een van de belangrijkste uitdagingen voor zowel de ontwikkeling en klinische studie vertaling is hoe het brede differentiatie mogelijkheden van pluripotente menselijke stamcellen kanaal om een ​​gewenst fenotype efficiënt en voorspelbaar. Hoewel dergelijke cellen kunnen spontaan differentiëren in vitro in de cellen van alle kiembladen door te gaan door middel van een multi-lijn aggregaat podium, slechts een klein deel van de cellen na te streven een bepaalde lijn ^1,4. In die hESC-afgeleide aggregaten, een simultane verschijning van een aanzienlijke hoeveelheid zeer uiteenlopende ongewenste celtypen die kunnen verblijven in drie embryonale kiembladen maakt vaak de opkomst van de gewenste fenotypes niet alleen inefficiënt, maar onbeheersbaar en onbetrouwbaar ook. Hoewel de hart-en neurale lijnen zijn afgeleid in eerdere rapporten, maar de inefficiëntie bij het genereren van gespecialiseerde cellen door kiem-layer-inductie van pluripotente cellen en het hoge risico van tumorgeniciteit volgende transplantation hebben gehinderd verdere klinische vertaling.

De hESC lijnen oorspronkelijk afgeleid en onderhouden in co-cultuur met groei gearresteerd muis embryonale fibroblasten (MEF) ^4. Hoewel verscheidene menselijke feeder, feeder-vrij, en chemisch geformuleerde cultuur systemen zijn ontwikkeld voor hESC 's ^11-13, de elementen die nodig en voldoende voor het behoud van de zelf-vernieuwing van menselijke pluripotente cellen onopgelost blijven. Deze exogene feeder-cellen en biologische reagentia bijdragen tot het behoud op de lange termijn een stabiele groei van de ongedifferentieerde hESC 's terwijl het masker het vermogen van pluripotente cellen om te reageren op ontwikkelings-signalen. Behoud van ongedifferentieerde hESC 's in een bepaalde Biologics-vrije cultuur systeem dat trouwe uitbreiding en controleerbaar direct onderscheid maakt is een van de sleutels van hun therapeutisch nut en potentieel. RA was niet voldoende om neuronale differentiatie van ongedifferentieerde hESC 's onderhouden onder eerder gerapporteerde Condit inducerenionen met exogene feeder-cellen. Hoewel neurale geslachten lijken op een relatief vroeg stadium van hESC differentiatie, het behandelen van hESC-gesplitste multi-stam aggregaten (embryoid lichamen) met RA slechts licht verhoogde de lage opbrengst van neuronen ^{1, 14, 15.} Met het oog op een uniforme omzetting van menselijke pluripotente stamcellen om een ​​bepaalde lijn te bereiken, hebben we gebruik van een bepaalde cultuur systeem dat in staat het verzekeren van de verspreiding van ongedifferentieerde hESC 's uitsluitend te identificeren voorwaarden voor een goed gecontroleerde efficiënte inductie van pluripotente hESC' s om een ​​bepaald klinisch relevante lijn door eenvoudige verstrekking van kleine moleculen (fig. 1, Fig. 2). Toekomstige studies zullen onthullen genetische en epigenetische controle moleculen in het menselijk CNS ontwikkeling als alternatieven, die de weg voor kleine molecule-gemedieerde directe controle en modulatie van hESC pluripotente lot vrij te maken bij het afleiden van klinisch relevante lineages voor regeneratieve therapieën. Zonder behandeling van RA, 1-5% HESC 's ondergaan spontane differentiatie in neuronen ^{1, 14, 15.} Met de behandeling van RA, zijn we in staat geweest om> 95% embryonale neuronale voorlopercellen en neuronen van hESC 's gehandhaafd onder een te definiëren cultuur in een proces dat menselijke embryonale ontwikkeling ¹⁴ zou kunnen emuleren genereren. Onlangs hebben geweten neurale-lot bepalen van genen is gebruikt om muizen fibroblasten transdifferentiate in volwassen neurale voorlopers en neuronen met een laag rendement varieert 0,5-8% ^{17, 18.} Echter, opnieuw geprogrammeerd somatische cellen historisch werd geassocieerd met een abnormale genexpressie en versnelde veroudering met een verminderde therapeutische nut ^19-21. Ten slotte is het protocol waarin we gevestigd hier is beperkt tot pluripotente hESC 's afgeleid van de binnenste celmassa (ICM) of epiblast van de menselijke blastocyst ^4, mag niet van toepassing op andere pluripotente cellen, met inbegrip van dieren afkomstige SER, SER afgeleid van eerdere morula (acht -cel)-stadium embryo's ^22, en artificially geherprogrammeerd cellen ^23.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Naam van het reagens	Vennootschap	Catalogus nummer	Commentaar (optioneel)
Gelatine	Sigma	G1890
Matrigel	BD bioscience	356231	Groeifactor verminderd
Human laminine	Sigma	L6274
all-trans-retinoïnezuur	Sigma	R2625
DMEM/F12	Invitrogen	10565018
DMEM	Invitrogen	31053036
DMEM-KO	Invitrogen	10829018
Knock-out serum vervanging	Invitrogen	10828028
MEM niet-essentiële aminozuren oplossing (MNAA, 100X)	Invitrogen	11140050
MEM eenmino zuren oplossing (MEAA, 100X)	Invitrogen	11130050
β-mercapto-ethanol	Invitrogen	21985023
Albumax	Invitrogen	11020021
Ascorbinezuur	Sigma	A4403
Menselijke transferrine	Sigma	T8158
Human bFGF	PeproTech	AF-100-18B
Menselijke insuline	Invitrogen	12585014
Menselijke activine A	PeproTech	120-14E
Human BDNF	PeproTech	AF-450-02
Human VEGF	PeproTech	AF-100-20
Human NT-3	PeproTech	450-03
Heparine	Sigma	H5284
N-2 supplement (100X)	Invitrogen	17502048
6-well Ultra-bevestigingsplaat	Corning	3471
6-well plaat	Corning	3516