Chronische Vernauwing van de nervus ischiadicus en Pijn Overgevoeligheid Testen bij ratten

Summary

Door de eenvoud van de ingreep en de robuuste gedrag dat eruit voortkomt, chronische vernauwing van de nervus ischiadicus is een van de vooraanstaande dierlijke modellen van neuropathische pijn. Binnen 24 uur na een operatie, wordt de pijn overgevoeligheid vastgesteld en kan kwantitatief gemeten worden met een von Frey aesthesiometer (mechanische test) en plantaire analgesie meter (thermische test).

Abstract

Chronische neuropathische pijn, als gevolg van beschadiging van het centrale of perifere zenuwstelsel, is een wijdverspreide en slopende aandoening, die 7-18% van de bevolking ^1,2. Symptomen zijn onder meer spontane (tintelingen, branderig gevoel, elektrische schok ed) pijn, dysesthesie, paresthesie, allodynie (pijn als gevolg van normaal niet-pijnlijke stimuli) en hyperalgesie (een verhoogde respons op pijnlijke stimuli). De sensorische symptomen zijn co-morbide met gedragsproblemen een handicap, zoals slapeloosheid en depressie. Om chronische neuropathische pijn te bestuderen verschillende diermodellen het nabootsen van perifere zenuwschade zijn ontwikkeld, een van de meest gebruikte is Bennett en Xie's (1988) eenzijdige heupzenuw chronische vernauwing letsel (CCI) ³ (figuur 1). Hier presenteren we een methode voor het uitvoeren van CCI en testen pijn overgevoeligheid.

CCI wordt uitgevoerd onder narcose, waarbij de heupzenuw aan de ene kant worden blootgesteld door het maken van dekin incisie, en dwars door het bindweefsel tussen de gluteus superficialis en biceps femoris spieren. Vier chroomzuur darm ligaturen zijn losjes gebonden rond de heupzenuw bij 1 mm intervallen, om er maar af te sluiten, maar niet arresteren epineural doorbloeding. De wond gesloten met hechtingen in de spier en nietjes in de huid. Het dier wordt dan mag van een operatie herstellen 24 uur voor pijn overgevoeligheid test gestart.

Voor gedrags-testen, worden ratten geplaatst in de testapparatuur en mogen wennen aan de testprocedure. Getest Het gebied is het midden van de voetzool van de achterpoot (figuur 2), die valt binnen de heupzenuw distributie. Mechanische terugtrekking drempel wordt berekend door het mechanisch het stimuleren van zowel gewonden en niet-gewonde hindpaws met behulp van een elektronische dynamische plantaire von Frey aesthesiometer of handmatige von Frey haren ^4. De mechanische onttrekkingsdrempel is de uitgeoefende maximale druk(In gram) die leidt tot poot terugtrekken. Voor het meten van thermische terugtrekking latentie eerst beschreven door Hargreaves et al. (1988), wordt de achterpoot blootgesteld aan een balk van stralingswarmte door een glazen oppervlak met een plantairflexie analgesie meter ^5,6. De intrekking latency aan de warmte stimulus wordt geregistreerd als de tijd voor poot terugtrekking in zowel gewonden en niet gewonde hindpaws. Naar aanleiding van CCI, mechanische onttrekkingsdrempel, evenals thermische terugtrekking latency in de geblesseerde poot zijn beide aanzienlijk verminderd, vergeleken met nulmetingen en de niet gewonde poot (figuur 3). De CCI-model van perifere zenuwschade in combinatie met pijn overgevoeligheid testen biedt een modelsysteem om de effectiviteit van potentiële therapeutische middelen te onderzoeken om chronische neuropathische pijn te wijzigen. In ons laboratorium, maken wij gebruik van CCI naast thermische en mechanische gevoeligheid van de hindpaws om de rol van neuro-immuun interacties te onderzoeken in de pathogeneseen de behandeling van neuropathische pijn.

Protocol

1. Heupzenuw Chronische Vernauwing

Aseptisch worden gebruikt voor de chirurgische procedure. Ontsmet de chirurgische werkblad met 70% ethanol en voor te bereiden op voorhand steriele instrumenten (bv., fijn schaar, pincet, en oprolmechanisme), gaasjes, nietjes en swabs in de autoclaaf. Voor meerdere operaties, reinigen en opnieuw steriliseren instrumenten met 70% ethanol of een droge korrel sterilisator tussen de ratten. Een chirurgisch masker, haar motorkap en steriele handschoenen te worden gedragen.

Voor vernauwing van de zenuw, de voorbereiding van de chroom-darm hechtingen door te snijden in kleine stukjes van ongeveer 3 cm lang ondergedompeld in een steriele zoutoplossing, aan het drogen te voorkomen. Voor het sluiten van de wond, gebruik in de handel verkrijgbare steriele zijden hechtdraden.

1. Verdoven de rat in een inductie-kamer met 5% isofluraan in O _2, dan levert 2% isofluraan in O ₂ via een op maat gemaakt gezichtsmasker, en toezicht houden op de verdoofd dier tijdens de procedure. Vaak alternatief anesthetica worden ingeademd halothaan of intraperitoneale natriumpentobarbital. Ketamine, een N-methyl-D-aspartaat-(NMDA)-receptorantagonist, te worden vermeden aangezien deze receptoren belangrijk in de ontwikkeling van neuropathische pijn.
2. Scheer de linker achterpoot van de rat. Vervolgens het dier te plaatsen op een thermo-gereguleerde mat bij 37 ° C en toepassing smeerolie oogzalf voor de ogen.
3. Steriliseer het geschoren gebied met drie alternatieve toepassingen van 70% isopropyl alcohol en jodium oplossing.
4. Met de rat ligt op zijn borst / thorax, verheffen linker achterpoot en in positie te houden met de femor op 90 ° ten opzichte van de wervelkolom met behulp van plakband op de voet.
5. Maak een insnijding in de huid parallel, maar 3-4 mm onder de femor en gratis de huid van de spieren rond de incisie door te snijden door middel van het bindweefsel.
6. Met behulp van stompe schaar, dwars door het bindweefsel tussen de gluteus superficialis en de bicepsfemoris spieren.
7. Gebruik een oprolmechanisme om de kloof tussen de twee spieren te verruimen, zodat duidelijke visualisatie van de nervus ischiadicus.
8. Met behulp van gebogen stompe-tip tang en micro-schaar, zachtjes gratis ongeveer 10 mm van de nervus ischiadicus (proximaal van de nervus trifurcation) van het omringende bindweefsel.
9. Onder de microscoop en een goede lichtbron, bind vier ligaturen (chroomzuur darm 4.0, Ethicon, USA) met een dubbele knoop, 1 mm van elkaar, proximaal van de trifurcation van de nervus ischiadicus. Voor elke ligatuur, beginnen met een losse lus, dan pakt u de twee uiteinden in de buurt van de lus en draai totdat de lus is maar net strak en de ligatuur niet glijden langs de zenuw. De lus in de juiste positie te houden, plaatst de tweede lus bovenop de eerste naar de knoop te voltooien. Tot slot, knip de losse uiteinden van de ligatuur tot ongeveer 1 mm. Vernauwing van de zenuw moet minimaal zijn, en onmiddellijk gestopt als een korte twitch wordt waargenomen, om te voorkomen dat de arrestatie van the epineural doorbloeding. Over het aandraaien van de ligaturen leidt tot axotomy en autotomie (zelfverminking), zowel ongewenste bijwerkingen die succesvol pijn overgevoeligheid testen uit te sluiten.
10. Gebruik hechtingen (Mersilk 5.0, Ethicon) om de spierlaag en nietjes (Autoclip, 9 mm) dicht bij de huid vast te zetten. Vervolgens gebruik jodiumoplossing (Riodine) op de wond steriliseren.
11. Observeer de rat gedurende de anesthesie herstelperiode, en laat het te herstellen in een aparte kooi met platte papieren beddengoed (niet de standaard veehouderij beddengoed), om het onbewuste dier verstikking te voorkomen.
    Voor opgave van post-operatieve analgesie onderzoekers zou het feit dat dit kan interfereren met pijn overgevoeligheid van proeven. In feite zijn er aanwijzingen dat lokale toepassing van verdoving, lidocaïne, op het moment van schade kan de ontwikkeling van neuropathische pijn te veranderen, en de mate van de hyperalgesie in de voorafgaande weken ^7. Voor verdere discussie over dit mAtter zie beoordeling door Bennett et al. ^8.

2. Metingen van Pijn Gedrag

1. Dagelijkse behandeling van ratten enkele dagen voordat het experiment wordt aanbevolen om de ratten wennen aan de geleider, stress te verminderen en het risico van bijten.
2. Voorafgaand aan de gedrags-testen, ratten moeten worden gewend aan de testprocedure en de dierenweide. De testomgeving moet worden gehouden rustig en goed onder controle, met een constante temperatuur en luchtvochtigheid, en uitgevoerd op een vergelijkbaar moment van de dag elke testsessie.
3. Pijn overgevoeligheid testen moeten worden uitgevoerd meerdere malen voor CCI (baseline) en op verschillende tijdstippen na CCI, zoals gewenst.

3. Mechanische onttrekkingsdrempel

1. Op de dag van testen, plaats ratten in de verhoogde vloer maas testen kooi 15-30 minuten vóór de meting terugtrekking drempels, waardoor kooi exploratie en GrooMing-activiteiten te staken en ratten te worden ontspannen en stilstaat.
2. Met behulp van een dynamische plantaire von Frey aesthesiometer (Ugo Basile, Italië), de positie van de touch-stimulator unit met de gloeidraad direct onder het midden van de voetzool van de achterpoot, het vermijden van de metalen gaas en druk op de startknop. Dit tilt de gloeidraad aan de voetzool van de achterpoot mechanisch te stimuleren met een toenemende kracht.

Manual von Frey haren een reeks van toenemende diameter filamenten die zijn afgestemd op een specifieke kracht op te wekken indien toegepast op de huid. Ze kunnen worden gebruikt als alternatief voor een elektronisch dynamische plantaire von Frey aesthesiometer voor het meten van poot onttrekkingsdrempel, zoals eerder beschreven ^4. Er zijn ook verschillende andere fabrikanten van elektronische von Frey aesthesiometers (bijv. IITC, Verenigde Staten en Somedic, Zweden).

3. Noteer de mechanische onttrekkingsdrempel van zowel gewonden en niet-gewonde hindpaws, in een wisselende volgorde. Dit apparaat is van toepassing druk om de poot en bij de uitslag de reactie van het systeem registreert automatisch en geeft de maximale kracht uitgeoefend (in gram). Als een dubbelzinnige reactie optreedt (in het geval van ambulantie of verzorging), herhaalt u de stimulus en opnieuw op te nemen van de drempel. Likken of schudden van de achterpoot volgende stimulatie is een teken van gedrag dat gepaard gaat met pijn.
4. Herhaal de mechanische stimulatie 3 keer met een interval van ongeveer 5 min tussen stimuli, nemen de drempels, en dan berekent het gemiddelde van poot terugtrekking drempels.

4. Thermische Intrekking Latency

De infrarood (IR) warmte-intensiteit van de plantaire testinstrument moet worden aangepast voordat het experiment. In ons laboratorium, passen we de IR-intensiteit op een gemiddelde poot terugtrekken latency van ongeveer 10 seconden in naïeve ratten geven, en we de cut-off latency op 20 seconden van het weefsel dam te voorkomenleeftijd in het geval van onvermogen om een ​​poot te verwijderen.

1. Op de dag van testen, om plaats ratten in de glazen vloer testen kooi 15-30 minuten voor het meten van latency, waardoor kooi exploratie en verzorgen activiteiten te staken en ratten worden ontspannen en stilstaat.
2. Met behulp van een thermische plantaire analgesie instrument (Ugo Basile, Italië), de positie van de infrarood-bron direct onder het midden van de voetzool van de achterpoot, en druk op de startknop. Dit onthult de plantaire oppervlak van de achterpoot van een straal van stralingswarmte door middel van een transparante glazen oppervlak. Er zijn ook alternatieve fabrikanten van thermische plantaire analgesie instrumenten (bv. IITC, Verenigde Staten en Stoelting, USA).
3. Noteer de terugtrekking latency van beide gewonden en onbeschadigd hindpaws, in een wisselende volgorde. Dit apparaat registreert automatisch de tijd die nodig is (in seconden) vanaf het begin van de thermische stimulus tot intrekking van de poot van de warmtebron. Als een dubbelzinnige reactie optreedt (in het geval van ambulaTIE of verzorging), herhaalt u de stimulus en opnieuw op te nemen van de latentie. Likken of schudden van de achterpoot volgende stimulatie is een teken van gedrag dat gepaard gaat met pijn.
4. Herhaal de warmte stimulatie ten minste 3 keer met een interval van ongeveer 5 min tussen stimuli, nemen de latencies, en dan berekent het gemiddelde van poot terugtrekking latency.

4. Representatieve resultaten

Een voorbeeld van mechanische en thermische onttrekkingsdrempel terugtrekking vertraging in het ipsilaterale (gewonden) en contralaterale (ongeschonden) poten van Wistar ratten weergegeven voordat (baseline) en 2-12 dagen na CCI in figuur 3A en fig. 3B. Uit deze figuren blijkt dat CCI een aanzienlijke vermindering van de mechanische en thermische onttrekkingsdrempel terugtrekking latentie van het ipsilaterale achterpoot veroorzaakt, waarbij de aanwezigheid van mechanische en thermische pijn overgevoeligheid beide kenmerken van chronische neuropathische pijn .

Figuur 1. Een schematische illustratie van de positionering van de ligaturen de CCI model. Dit diermodel van neuropathische pijn gaat om plaatsing van vier losse chroom-gut ligaturen op de heupzenuw, halverwege de dij niveau. Dit resulteert in verwonden slechts een deel van de afferentia naar de voet en de daaropvolgende pijn hypersensitiviteit van de achterpoot.

Figuur 2. Schema van de achterpoot areaal voor pijn testen. De mid-voetzool juist achter de voetensteun, zoals aangegeven door de gestippelde cirkel rode, wordt gebruikt voor pijn testen. Dit gebied wordt vooral gestimuleerd door terminal takken van de nervus ischiadicus. De hiel en voetkussens moeten als gevolg van verschil in gevoeligheid van de huid worden vermeden.

3.jpg "/>
Figuur 3. Pijn overgevoeligheid na chronische vernauwing van de nervus ischiadicus bij de rat. Na CCI is er een aanzienlijke vermindering poot onttrekkingsdrempel mechanische stimuli (A) en poot terugtrekking latentie thermische stimuli (B) in de gewonde (ipsilaterale) achterpoot opzichte van de onbeschadigde (contralaterale) achterpoot (P <0,01 herhaalde metingen 2 -way ANOVA). Uit de gegevens blijkt gemiddelde ± sem, n = 7 Wistar ratten.

Discussion

CCI is een veel gebruikte perifere zenuwschade model van chronische neuropathische pijn. Het is relatief eenvoudig uit te voeren, en produceert robuuste en stabiele pijn overgevoeligheid ten minste een maand na verwonding. Naar aanleiding van CCI, ratten vertonen abnormale houding van de gewonde achterpoot (tenen bij elkaar gehouden en plantaire-gebogen en poot eversie), maar ook herhaaldelijk schudden, bewaking en likken van de gewonde achterpoot suggereert de aanwezigheid van spontane pijn ^9. Naast de senso...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Naam van het reagens / apparatuur	Vennootschap	Catalogusnummer	Reacties
Chroomzuur darm	Ethicon	G-211	4-0 dikte
Isofluraan	Delvet Pty Ltd, Seven Hills, Zuid-Holland	n / a
Mersilk	Ethicon	W-580	5-0 dikte
Autoclip	Becton Dickinson	427631	9 mm roestvrij staal
Riodine	Orion	R1000802F	1% w / v jodium
Thermische plantaire analgesie instrument	Ugo Basile	37370
Dynamische plantaire aesthesiometer	Ugo Basile	37400