Een methode voor de bepaling van acetaat kinase activiteit is beschreven. Deze test maakt gebruik van een directe reactie voor het bepalen van enzymactiviteit en de kinetiek van acetaat kinase in de acetaat-vormende richting met verschillende fosforyl acceptoren. Bovendien kan deze methode worden gebruikt voor het testen van andere acetyl fosfaat of acetyl-CoA gebruik te maken van enzymen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Directe detectie van de acetaat-vormende activiteit van het enzym acetaat Kinase
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Acetaat kinase, een lid van de acetaat en suiker kinase-Hsp70-actine (ASKHA) enzym superfamilie 1-5, is verantwoordelijk voor de reversibele fosforylering van acetaat tot acetyl fosfaat gebruik te maken van ATP als een substraat. Acetaat kinases zijn alomtegenwoordig in de bacteriën, gevonden in een genus van de Archaea, en zijn ook aanwezig in microben van de Eukarya 6. De meest gekarakteriseerd acetaat kinase is dat vanaf het methaan-producerende archaeon Methanosarcina thermophila 7-14. Een acetaat kinase die alleen gebruik kunnen maken van PP-i, maar niet ATP in de acetyl fosfaat-vormende richting is geïsoleerd van Entamoeba histolytica, de verwekker van amoeben dysenterie, en heeft tot nu toe alleen gevonden in dit genus 15,16.
In de richting van acetyl fosfaat formatie, is acetaat kinase-activiteit meestal gemeten met behulp van de hydroxamaat test, het eerst beschreven door Lipmann17-20, een gekoppelde test waarin de omzetting van ATP naar ADP is gekoppeld aan oxidatie van NADH tot NAD + door de enzymen pyruvaatkinase en lactaat dehydrogenase 21,22, of een test meet release van anorganisch fosfaat na reactie van de acetyl-fosfaat product met hydroxylamine 23. Activiteit in het tegenovergestelde, is acetaat-vormende richting gemeten door de koppeling van ATP vorming van ADP tot de reductie van NADP + om NADPH door de enzymen hexokinase en glucose-6-fosfaat dehydrogenase 24.
Hier beschrijven we een methode voor de detectie van acetaat kinase-activiteit in de richting van acetaat formatie die niet nodig koppeling enzymen, maar in plaats daarvan is gebaseerd op directe bepaling van de acetyl fosfaat consumptie. Na de enzymatische reactie neemt het resterende acetyl fosfaat omgezet in een ijzer hydroxamaat complex, dat spectrofotometrisch kan worden, gemeten als voor de hydroxamaat test. Dus, in tegenstelling tot de standard gekoppeld test voor deze richting, dat is afhankelijk van de productie van ATP uit ADP, kan dit direct assay worden gebruikt voor acetaat kinases die ATP of PP i te produceren.
Protocol
De algemene opzet van dit protocol is geschetst in figuur 1.
1. Bereiding van oplossingen voor Standard Curves en Assays
- Bereiding van 100 ml van een 2 mol / L oplossing van hydroxylamine-HCl. Weeg 13,9 g hydroxylamine-hydrochloride (MW 69,49 g / mol) en los op in ongeveer 50 ml gedestilleerd-gedeïoniseerd water (DDH 2 O). Breng de pH op 7,0 met behulp van kalium-hydroxide pellets of een geconcentreerde oplossing. Breng het uiteindelijke volume tot 100 ml. De oplossing kan worden bewaard bij kamertemperatuur maximaal 30 dagen of bij 4 ° C gedurende maximaal 90 dagen.
- Bereiding van 100 ml van een ijzerchlori....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De detectie van acetyl fosfaat in deze test is afhankelijk van een voldoende concentratie van hydroxylamine hydrochloride en de concentratie en zuurgraad van de ijzerchloride-oplossing. Wijziging van de test volume vereist heroverweging van beide componenten. De enzymatische reacties die hier beschreven werden uitgevoerd bij 37 ° C met de hydroxylamine beëindiging uitgevoerd bij 60 ° C gedurende 5 minuten. Deze hogere temperatuur is van cruciaal belang om voor een snelle conversie van de resterende acetyl fosfaat naar a.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Geen belangenconflicten verklaard.
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund door NSF award # 0920274 en South Carolina Experiment Station Project (SC-1700340) aan KSS. Dit papier is technische bijdrage No 5929 van de Clemson University Experiment Station.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam van het reagens | Vennootschap | Catalogus nummer | Reacties |
| Acetyl-fosfaat | Sigma Aldrich | 01409 | Lithium zout (97%) |
| Monobasisch (ontwateren) | ThermoFisher | S381 | |
| Dibasisch (watervrij) | ThermoFisher | S374 | |
| Magnesiumchloride (hexahydraat) | ThermoFisher | M33 | |
| Tris Base | ThermoFisher | B152 | |
| Ijzerchloride (hexahydraat) | ThermoFisher | I88 | |
| Trichloorazijnzuur | ThermoFisher | A324 | |
| Hydroxylamine hydrochloride | ThermoFisher | H330 | |
Adenosine 5'-difosfaat natriumzout | Sigma Aldrich | A2754 | |
| BIOMATE III Spectrofotometer | ThermoFisher | 142982082 | Standaard UV / Vis spectrofotometer |
Referenties
- Bork, P., Sander, C., Valencia, A. An ATPase domain common to prokaryotic cell cycle proteins, sugar kinases, actin, and hsp70 heat shock proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89, 7290-7294 (1992).
- Bork, P., Sander, C., Valencia, A.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
