Directe detectie van de acetaat-vormende activiteit van het enzym acetaat Kinase

Samenvatting

Een methode voor de bepaling van acetaat kinase activiteit is beschreven. Deze test maakt gebruik van een directe reactie voor het bepalen van enzymactiviteit en de kinetiek van acetaat kinase in de acetaat-vormende richting met verschillende fosforyl acceptoren. Bovendien kan deze methode worden gebruikt voor het testen van andere acetyl fosfaat of acetyl-CoA gebruik te maken van enzymen.

Samenvatting

Acetaat kinase, een lid van de acetaat en suiker kinase-Hsp70-actine (ASKHA) enzym superfamilie ^1-5, is verantwoordelijk voor de reversibele fosforylering van acetaat tot acetyl fosfaat gebruik te maken van ATP als een substraat. Acetaat kinases zijn alomtegenwoordig in de bacteriën, gevonden in een genus van de Archaea, en zijn ook aanwezig in microben van de Eukarya ^6. De meest gekarakteriseerd acetaat kinase is dat vanaf het methaan-producerende archaeon Methanosarcina thermophila ^7-14. Een acetaat kinase die alleen gebruik kunnen maken van _PP-i, maar niet ATP in de acetyl fosfaat-vormende richting is geïsoleerd van Entamoeba histolytica, de verwekker van amoeben dysenterie, en heeft tot nu toe alleen gevonden in dit genus ^15,16.

In de richting van acetyl fosfaat formatie, is acetaat kinase-activiteit meestal gemeten met behulp van de hydroxamaat test, het eerst beschreven door Lipmann^17-20, een gekoppelde test waarin de omzetting van ATP naar ADP is gekoppeld aan oxidatie van NADH tot NAD ⁺ door de enzymen pyruvaatkinase en lactaat dehydrogenase ^21,22, of een test meet release van anorganisch fosfaat na reactie van de acetyl-fosfaat product met hydroxylamine ^23. Activiteit in het tegenovergestelde, is acetaat-vormende richting gemeten door de koppeling van ATP vorming van ADP tot de reductie van NADP ⁺ om NADPH door de enzymen hexokinase en glucose-6-fosfaat dehydrogenase ^24.

Hier beschrijven we een methode voor de detectie van acetaat kinase-activiteit in de richting van acetaat formatie die niet nodig koppeling enzymen, maar in plaats daarvan is gebaseerd op directe bepaling van de acetyl fosfaat consumptie. Na de enzymatische reactie neemt het resterende acetyl fosfaat omgezet in een ijzer hydroxamaat complex, dat spectrofotometrisch kan worden, gemeten als voor de hydroxamaat test. Dus, in tegenstelling tot de standard gekoppeld test voor deze richting, dat is afhankelijk van de productie van ATP uit ADP, kan dit direct assay worden gebruikt voor acetaat kinases die ATP of PP _i te produceren.

Protocol

De algemene opzet van dit protocol is geschetst in figuur 1.

1. Bereiding van oplossingen voor Standard Curves en Assays

1. Bereiding van 100 ml van een 2 mol / L oplossing van hydroxylamine-HCl. Weeg 13,9 g hydroxylamine-hydrochloride (MW 69,49 g / mol) en los op in ongeveer 50 ml gedestilleerd-gedeïoniseerd water (DDH ₂ O). Breng de pH op 7,0 met behulp van kalium-hydroxide pellets of een geconcentreerde oplossing. Breng het uiteindelijke volume tot 100 ml. De oplossing kan worden bewaard bij kamertemperatuur maximaal 30 dagen of bij 4 ° C gedurende maximaal 90 dagen.
2. Bereiding van 100 ml van een ijzerchloride / zoutzuur oplossing. Weeg 13,5 g ferrichloride (MW 270,32 g / mol) en los op in ongeveer 50 ml DDH ₂ O. Voeg 41,3 ml geconcentreerd zoutzuur (12,1 mol / L) en breng het aan een uiteindelijk volume van 100 ml. De uiteindelijke concentratie van ijzerchloride wordt 0,5 mol / L en de uiteindelijke concentratie van zoutzuur zal 5 mol te worden/ L. De oplossing is bij kamertemperatuur bewaard.
3. Bereiding van 100 ml van een 1,84 mol / L oplossing van trichoroacetic zuur. Weeg 30,0 g trichloorazijnzuur (MW 163,39 g / mol), los op in DDH ₂ O en breng het uiteindelijke volume tot 100 ml. De oplossing is bij kamertemperatuur bewaard.
4. Bereid 5 ml van een 0,1 mol / L acetyl fosfaat oplossing. Weeg 0,092 g acetyl-fosfaat (MW 184,06 g / mol), los op in DDH ₂ O en breng het uiteindelijke volume tot 5 ml. Aliquot de oplossing voor microcentrifugebuizen (0,25 ml per buis) en invriezen bij -20 ° C tot gebruik. Ontdooide oplossing moet worden gelegd op het ijs en kan gebruikt worden voor ongeveer 1 uur. Acetyl-fosfaat-oplossing die is ontdooid mag niet opnieuw worden ingevroren en opnieuw gebruikt.
5. Bereid 5 ml van een 0,1 mol / L oplossing van ADP. Weeg 0,24 g ADP (MW 472,5 g / mol), los op in DDH ₂ O, en breng het uiteindelijke volume tot 5 ml. Aliquot de oplossing in microcentrifugebuizen (0,5 ml per buis) en invriezen bij -20 ° C totgebruik. Houden ontdooide oplossing op ijs tot gebruik.
6. Bereid 50 ml van een 1 mol / L oplossing van Tris. Weeg 6,06 g Tris (MW 121,14 g / mol), en los op in 40 ml DDH ₂ O. Breng de pH van de oplossing tot 7,0 met behulp van zoutzuur en brengen uiteindelijke volume tot 50 ml. Bewaar oplossing bij kamertemperatuur.
7. Bereid 10 ml van een 1 mol / L magnesium chloride-oplossing. Weeg 2,03 g magnesiumchloride (MW 203,31 g / mol), los op in DDH ₂ O, en breng uiteindelijke volume tot 10 ml. Bewaar de oplossing bij kamertemperatuur.
8. Bereid 25 ml ontwikkeling oplossing door het mengen van gelijke volumes van de ijzerchloride / zoutzuur oplossing en het trichloorazijnzuur oplossing. Ontwikkeling oplossing moet vers worden bereid elke dag en bij kamertemperatuur bewaard.

2. De voorbereiding van een Acetyl fosfaat Standard Curve

1. Een acetyl fosfaat standaard curve wordt gegenereerd met behulp van bekende hoeveelheden van acetyl fosfaat. Een standaard curve van zes tot achttien maant punten is geschikt. De normen moeten variëren van 0,03 tot 0,9 μmoles μmoles per 300 ul, wat overeenkomt met uiteindelijke concentraties van 0,1 tot 3 mmol / L. Verdun de acetyl fosfaat voorraad oplossing voor de juiste concentraties in 100 mM Tris-oplossing in een eindvolume van 300 pi. Een controle monster zonder acetyl fosfaat moet ook worden voorbereid.
2. Incubeer elke norm en de controle bij 37 ° C in een warmte-blok voor 1 minuut.
3. Voeg 50 ul van de hydroxylamine hydrochloride oplossing voor elke norm en de controle en meng door schudden drie keer. Plaats de standaard in een 60 ° C hitte te blokkeren en incubeer gedurende vijf minuten.
4. Voeg 100 ul van ontwikkeling-oplossing aan de normen en de controle, meng door het te schudden drie keer, en laat kleuren gedurende ten minste een minuut te ontwikkelen bij kamertemperatuur.
5. Centrifuge alle normen en de controle in een microcentrifuge bij 18.000 xg gedurende 1 minuut.
6. Meet de monsters spectrofotometrisch eent 540 nm met behulp van 1 ml plastic cuvetten, met behulp van de controle-als de blanco kaart voor spectrofotometrie.
7. Het genereren van een standaard curve met geschikte data-analyse en grafische software (bv. Kaleidagraph, Synergy Software). R ^2-waarden van 0,99 of hoger zijn wenselijk. De gegevens worden weergegeven als absorptie bij 540 nm versus μmoles van acetyl fosfaat aanwezig is.

3. Test op acetaat kinase-activiteit

1. Met behulp van de beschreven oplossingen, bereiden een reactie mix met een uiteindelijke concentratie van 0,1 mol / L Tris-buffer, 10 mmol / L magnesium chloride, 5 mmol / L ADP, en de 2 mmol / L acetyl fosfaat. Een 10 ml reactiemengsel vergt 8,2 mL DDH ₂ O, 1,0 ml Tris-oplossing, 0,1 ml magnesiumchloride-oplossing, 0,5 ml ADP-oplossing en 0,2 ml acetyl-fosfaat-oplossing. Verdeel het reactiemengsel in 300 ul aliquots aan microcentrifugebuizen. Voor de bepaling van de kinetische parameters en de optimalisatie van substraat concentraties, kan een substraat wordengevarieerd en de andere gehouden op een constante concentratie in de reacties.
2. De reacties voor 1 minuut Pre-incubeer bij 37 ° C in een warmte-blok.
3. Voeg een gewenste hoeveelheid enzym om de reactie en onmiddellijk de buis terug te keren naar de 37 ° C verwarmen blokkeren. Ook een controle reactie waarin geen enzym wordt toegevoegd. Als er meerdere reacties worden uitgevoerd, voegt enzym om de buizen op specifieke tijdsintervallen. Wees er zeker bij te houden van de tijd. (NB: de hoeveelheid enzym te gebruiken zal moeten worden geoptimaliseerd om ervoor te zorgen dat alle van de acetyl fosfaat of ADP substraat niet zal worden uitgeput - zie Discussie sectie)
4. Na 5 minuten, voeg 50μl van de hydroxylamine hydrochloride oplossing voor elke reactie en de controle, mix, en plaats de buizen in een 60 ° C verwarmen blokkeren. Als er meerdere reacties worden uitgevoerd, moet dit worden gedaan op hetzelfde tijdsinterval als het enzym werd toegevoegd.
5. Incubeer de reacties en de controle gedurende 5 minuten bij 60 ° C.
6. Voeg 100 &mu, L van de ontwikkeling oplossing om elke reactie en de controle, mix, en plaats in een buis rek op het lab bank. Laat de kleur ontwikkelen gedurende minstens 1 minuut.
7. Centrifuge alle buizen in een microcentrifuge bij 18.000 xg gedurende 1 minuut.
8. Meet monsters spectrofotometrisch bij 540 nm met behulp van 1 ml plastic cuvetten en de hoeveelheid acetyl fosfaat aanwezig in vergelijking met de acetyl fosfaat standaard curve te bepalen.
9. De hoeveelheid acetyl uitgeput fosfaat substraat kan worden bepaald door het aftrekken van de hoeveelheid acetyl fosfaat die overblijven na de enzymatische reactie van het bedrag van acetyl fosfaat aanwezig in de controle ontbreekt enzym. Uit te voeren data analyse met behulp van de nodige gegevens en grafische software (bv. Kaleidagraph, Synergy Software). R ² waarden groter dan 0,97 zijn wenselijk.

4. Representatieve resultaten:

Het doel van deze test is om acetaat kinase-activiteit te meten in de directeion van acetaat formatie. Dit wordt gedaan door het meten van het verbruik van de acetyl fosfaat substraat, want er is geen makkelijke, directe meting voor acetaat productie. Acetyl fosfaat die overblijven na een bepaalde tijd tijdens de enzymatische reactie wordt omgezet in acetyl hydroxamaat en vervolgens naar ijzer hydroxamaat complex, dat een roodachtige kleur (Figuur 2) dat kan worden gemeten bij 540 nm heeft. De standaard curve het plotten van absorptie versus μmoles acetyl-fosfaat aanwezig is in de normen wordt gebruikt om de hoeveelheid van acetyl fosfaat nog in elke reactie te bepalen. De standaard curve moet lineair zijn door het nulpunt. Een vertegenwoordiger standaard curve getoond in figuur 3 heeft een helling van 1.2332 absorptie-eenheden per μmole acetyl fosfaat aanwezig en een R ^2-waarde van 0,99, met vermelding van de data past bij de lineaire vergelijking goed. De vergelijking voor de lineaire fit van de standaard curve data worden gebruikt voor de berekening van de hoeveelheid acetyl fosfaat nog in de reactie. De μmolesvan de verbruikte acetyl fosfaat wordt bepaald als het verschil tussen de μmoles van acetyl fosfaat aanwezig is in de controle reactie ontbreken enzym en de μmoles van acetyl fosfaat die overblijven na de enzymatische reactie.

Gezuiverd, recombinant M. thermophila acetaat kinase werd getest met behulp van de beschreven protocol. Voor het experiment weergegeven in figuur 4, is de concentratie van ADP constant gehouden op 5 mmol / L en de concentratie van acetyl fosfaat in de reactie werd gevarieerd op de K _m te bepalen voor acetyl fosfaat. Zoals verwacht, dit experiment toont aan dat het enzym standaard Michaelis-Menten-achtige kinetiek volgt over de ondergrond en produceerde een hyperbolische curve verzadiging bij het plotten van activiteit ten opzichte van acetyl-fosfaat concentratie. De schijnbare K _m waarde voor acetyl fosfaat was 0,27 ± 0,01 mmol / L, dat gunstig afsteekt bij de gepubliceerde K _m waarde van 0,47 ± 0,01 mmol / L met behulp van de gekoppelde alszeggen ^13.

De directe test kan ook worden gebruikt om de activiteit van acetaat kinasen die andere ondergronden dan ATP, wat niet mogelijk is met behulp van de standaard gekoppeld test te gebruiken te meten. Gezuiverde recombinante E. histolytica acetaat kinase ^16, die PP _i in plaats van ATP produceert in de acetaat-vormende richting, werd onderworpen aan deze test gebruik van natriumfosfaat in plaats van ADP. De concentratie van natrium fosfaat in de reactie werd constant gehouden op 0,2 mol / L en de acetyl fosfaatconcentratie was gevarieerd. Wat betreft de M. thermophila acetaat kinase, de E. histolytica acetaat kinase gevolgd Michaelis-Menten-achtige kinetiek voor acetyl fosfaat en een hyperbolische verzadiging curve werd waargenomen (figuur 5). De schijnbare K _m waarde voor acetyl fosfaat was 0,50 ± 0,006 mmol / L. Reeves en Guthrie ¹⁵ bepaald een K _m waarde van 0,06 mmol / L voor acetyl fosfaat voor de inheemse enzym, hoe ooit, was hun enzym slechts gedeeltelijk gezuiverd en hun analyse betrokken vier koppeling enzymen die ook werden slechts gedeeltelijk gezuiverd. Zo is het moeilijk om direct te vergelijken deze waarden.

Protocol Scheme

1. Het genereren van een acetyl-fosfaat standaardcurve
2. Verdunnen enzym om gewenste concentratie
3. Bereid het reactiemengsel en de hoeveelheid 300 ul tot microcentrifugebuizen
4. Preincubate reacties bij 37 ° C gedurende 1 minuut
5. Start reacties door het toevoegen van enzymen op specifieke tijdsintervallen
6. Voeg hydroxylamine op dezelfde tijdstippen om de reacties te stoppen en op 60 incubeer ° C gedurende 5 minuten
7. Voeg ijzerchloride / trichloorazijnzuur, oplossing voor kleur ontwikkeling
8. Centrifugebuis bij 18.000 xg gedurende 1 minuut
9. Meet de absorptie bij 540 nm
10. Bepaal verbruikte hoeveelheid acetyl fosfaat in vergelijking met de standaard curve

tp_upload/3474/3474fig1.jpg "/>
Figuur 1. Protocol Scheme

Figuur 2. Acetyl fosfaat normen. Toenemende concentraties van acetyl fosfaat werden gereageerd met hydroxylamine en kleur werd ontwikkeld zoals beschreven. De controle ontbreekt acetyl-fosfaat is helder geel, en reacties met toenemende hoeveelheid acetyl-fosfaat worden achtereenvolgens donkerder van kleur. Deze kleurverandering wordt gemeten bij 540 nm.

Figuur 3. Sample acetyl fosfaat standaard curve. Verschillende hoeveelheden van acetyl fosfaat werden gereageerd met hydroxylamine en de kleur ontwikkeling oplossing en absorptie werd gemeten bij 540 nm. De absorptie bij 540 nm ten opzichte van μmoles acetyl fosfaat was uitgezet en een lineaire fit aan de gegevens werd toegepast.

Figuur 4. Gebruik van acetyl fosfaat door de ATP-productie van M. thermophila acetaat kinase. Enzymatische activiteit werd bepaald in de richting van acetaat vorming in de aanwezigheid van 5 mmol / L ADP met verschillende concentraties van acetyl fosfaat. De hoeveelheid acetyl fosfaat verbruikt werd bepaald als het verschil tussen het basisbedrag van acetyl fosfaat in de reactie en de hoeveelheid acetyl fosfaat die overblijven na de enzymatische reactie. Testen werden uitgevoerd in drievoud met de getoonde foutbalken.

Figuur 5. Gebruik van acetyl fosfaat door de PP _{i-producerende} E. histolytica acetaat kinase. Enzymatische activiteit in de richting van acetaat formatie werd bepaald in de aanwezigheid van 0.2 mol / L natrium fosfaat met verschillende concentraties van acetyl fosfaat. De hoeveelheid acetyl fosfaat verbruikt werd bepaald als het verschil tussen het basisbedrag van acetyl fosfaat in de reactie en de hoeveelheid acetyl fosfaat die overblijven na de enzymatische reactie. Testen werden uitgevoerd in drievoud met de getoonde foutbalken.

Discussie

De detectie van acetyl fosfaat in deze test is afhankelijk van een voldoende concentratie van hydroxylamine hydrochloride en de concentratie en zuurgraad van de ijzerchloride-oplossing. Wijziging van de test volume vereist heroverweging van beide componenten. De enzymatische reacties die hier beschreven werden uitgevoerd bij 37 ° C met de hydroxylamine beëindiging uitgevoerd bij 60 ° C gedurende 5 minuten. Deze hogere temperatuur is van cruciaal belang om voor een snelle conversie van de resterende acetyl fosfaat naar a...

Materialen

Naam van het reagens	Vennootschap	Catalogus nummer	Reacties
Acetyl-fosfaat	Sigma Aldrich	01409	Lithium zout (97%)
Monobasisch (ontwateren)	ThermoFisher	S381
Dibasisch (watervrij)	ThermoFisher	S374
Magnesiumchloride (hexahydraat)	ThermoFisher	M33
Tris Base	ThermoFisher	B152
Ijzerchloride (hexahydraat)	ThermoFisher	I88
Trichloorazijnzuur	ThermoFisher	A324
Hydroxylamine hydrochloride	ThermoFisher	H330
Adenosine 5'-difosfaat natriumzout	Sigma Aldrich	A2754
BIOMATE III Spectrofotometer	ThermoFisher	142982082	Standaard UV / Vis spectrofotometer