De Staart Suspension Test

Samenvatting

De staart-vering test is gevalideerd als een experimentele procedure om antidepressieve werking van het geneesmiddel behandelingen in muizen te beoordelen. Muizen worden geschorst door hun staart gedurende zes minuten en ontsnappen gerelateerd gedrag worden beoordeeld. We beschrijven procedures die worden gebruikt bij het uitvoeren van de staart ophanging te testen.

Samenvatting

De staart-vering test is een muis gedragstest nuttig in de screening van potentiële antidepressiva en het beoordelen van andere manipulaties waarvan wordt verwacht dat depressie gerelateerd gedrag beïnvloeden. Muizen worden geschorst door hun staarten met tape, in een dergelijke positie dat het niet kan ontsnappen of vast te houden in de buurt oppervlakken. Tijdens deze test, meestal zes minuten duurt, worden de resulterende ontsnappen georiënteerd gedrag gekwantificeerd. De staart-vering test is een waardevol instrument in drug discovery voor high-throughput screening van kandidaat antidepressivum verbindingen. We beschrijven hier de gegevens die nodig zijn voor de uitvoering van deze test met extra nadruk op de mogelijke problemen die zich kunnen voordoen en hoe ze te vermijden. Wij bieden ook een oplossing voor de staart klimmen gedrag, een gemeenschappelijk probleem dat maakt deze test nutteloos in sommige muizenstammen, zoals de veel gebruikte C57BL / 6. In het bijzonder, voorkomen we staart klimmen gedrag door het passeren van de muis staarten door een klein plasticcilinder vóór de schorsing. Ten slotte hebben we detail hoe u handmatig de score van de gedragingen die zich manifesteren in deze test.

Protocol

1. Materialen

1. Vering Box

De staart-ophanging test (TST) betreft opschorting van muizen boven de grond door hun staart. Op het meest basale niveau de procedure vereist slechts een schorsing bar of plank richel, en tape. Toch moet de onderzoeker overwegen het gebruik van een achtergrond die een optimaal contrast biedt. Bovendien, is het verstandig om maatregelen te nemen om muizen te voorkomen dat het observeren van andere dieren die worden getest. In ons laboratorium, gebruiken we speciaal vervaardigd staart schorsing dozen (vier uur per dag, Baltimore MD), gemaakt van kunststof met de afmetingen (55 hoogte x 60 breedte x 11,5 cm diepte). Om de dieren te voorkomen dat het observeren van of interactie met elkaar, is elke muis opgehangen in zijn eigen drie ommuurde rechthoekige compartimenten (55 hoogte x 15 breedte x 11,5 cm diepte). De muis is opgehangen in het midden van dit compartiment en de breedte en diepte zijn groot genoeg, zodat de muis niet naast elkaar kunnen makenntact met de muren. In deze instelling, bij benadering de afstand tussen de neus van de muis en het toestel vloer is 20-25 cm. Er zijn vier van dergelijke identieke compartimenten in het apparaat waardoor wij vier muizen te testen op een moment. Een aluminium ophanging bar (1 cm. Hoogte x 1 cm. Breed x 60 cm. Lengte), gebruikt om de staart van elke muis te schorten, is gepositioneerd aan de bovenkant van de doos. De afmetingen die wij gebruiken in ons laboratorium moet worden beschouwd als een algemene referentie. Zo kan bijvoorbeeld de grootte van de afzonderlijke compartimenten van de staart-ophanging box worden verhoogd wanneer een groot outbred muizenstam (bijv. CD-1) wordt gebruikt.

Aan de onderkant van elk compartiment plaatsen wij een afneembare aluminium lade die uitwerpselen of urine verzameld van de dieren. We maken gebruik van een donker grijs vak voor albino dieren en een crème kleurige box voor muizen van andere vachtkleuren. Deze regeling geeft ons een beter contrast en dus meer betrouwbare gedrag scoring van de test.

2. Band

Tape moet veilig houden aan zowel de muis de staart en de suspensie bar, en sterk genoeg zijn om het gewicht van de muis te testen (bv. TimeMed Labeling Systems, Inc, Burr Ridge IL, 1,9 cm breedte) te dragen. Toch moet de tape niet overdreven plakkerig, omdat aan het eind van de sessie zal worden verwijderd uit de staart. We snijden 17 cm fragmenten van tape en plaats een mark 2 cm van het ene uiteinde. Deze 2 cm gedeelte werd gebruikt voor het bevestigen van de tape op de staart, terwijl de overige 15 cm werd gebruikt voor opschorting van de muis.

3. Timer

4. Video-opname-apparaat

Een video-camera en een statief (of een andere ondersteunende structuur) nodig zijn. Omdat deze test meestal bestaat uit meerdere dieren wordt getest op hetzelfde moment, wordt live scoring moeilijk en wordt afgeraden. De video camera moet opnemen in high voldoende resolutie om een ​​beeld dat later gebruikt zal worden voor gedrag scoren maken. Altijd zeker van zijn dat er voldoende opname geheugen in de camera voordat u de test. We maken gebruik van een videocamera die digitaal registreert zonder het gebruik van fysieke media (bijvoorbeeld video-cassette), waardoor voor eenvoudige overdracht van video's.

5. Witte ruis generator

Het geluid generator moet maskeren met tussenpozen omgevingsgeluiden. Het gebruik van een ruisgenerator wordt met name aanbevolen in het laboratorium omgevingen waar plotselinge harde geluiden te horen die mogelijk zouden schrikken muizen. In onze experimentele de kamer van de omgevingsgeluid (zonder de witte geactiveerd noise generator) is ongeveer 60 dB. Het totale geluidsniveau met de witte ruis generator geactiveerd op de plaats waar de TST is uitgevoerd is 70-72 dB. Toch moet worden opgemerkt dat deze cijfers zijn bedoeld als voorbeeld, en elk laboratorium moet kiezen derechts het geluidsniveau op basis van hun unieke omgeving en omstandigheden.

6. Schoonmaakmiddelen

De schorsing box moet grondig worden afgeveegd na elke sessie met een sterilisatie oplossing (bijv. MB-10, Quip Laboratories Inc, Wilmington, DE, of iets dergelijks).

7. Climbstoppers (optioneel: afhankelijk van de stam gebruikt)

Muizen van sommige achtergronden, zoals C57BL / 6 gebruikt, kan klimmen met hun staart tijdens de test ^een. Clear holle cilinders (4 cm lengte, 1,6 cm buiten diameter, 1,3 cm in diameter, 1,5 gram) die zijn gesneden vier cm lengte (door FourHourDay Inc, Baltimore MD) uit polycarbonaat buis (# 8585K41, McMaster-Carr, Santa Fe Springs , CA) zijn geplaatst rondom de staarten van muizen om dergelijke staart klimmen gedrag ^2,3 voorkomen. Deze apparaten kunnen worden gemaakt in een laboratorium met gemeenschappelijke instrumenten en materialen.

2. Behavioral Procedures

De algemene opzet van het experiment moet een weerspiegeling zijn goed tegenwicht tussen variabelen die specifiek zijn voor uw experiment. Bijvoorbeeld, in onze experimenten proberen we elke groep te vertegenwoordigen eveneens in alle TST sessie (dat wil zeggen, als er vier behandelgroepen, elk zal worden vertegenwoordigd in elke sessie). Ook de posities van de muizen zijn gedraaid op een manier zodanig dat de muizen uit elke groep die behandeld worden in een andere positie in elke sessie.

1. Plaats de camera in positie. De camera moet zo dicht mogelijk zijn om de hoogst mogelijke resolutie van de dieren te verkrijgen.
2. Tape fragmenten die gebruikt zullen worden tijdens de sessie moet worden gesneden, gemarkeerd, en klaargemaakt voor de sessie.
3. Start de witte ruis generator, zo wordt gebruikt, voordat de muizen worden geïntroduceerd om de test kamer. Het niveau van witte ruis moet alleen genoeg zijn om externe geluiden te maskeren. Voorkomen dat een hoog volume en zorg ervoor dat het hetzelfde niveau van witte ruis wordt gebruikt voor alle dieren.
4. Breng de eenimals in de testkamer. Als de kamer waar de dieren verblijven en het testen kamer zijn naast elkaar met dezelfde omgevingscondities, mag geen acclimatiseringsperiode nodig zijn. Anders, plaats de dieren in de testkamer voor een periode van acclimatisatie (over het algemeen ten minste een uur). Wees ervan bewust dat de andere dieren die in dezelfde ruimte kunnen olfactorische en ultrasone signalen zin.
5. Als een stam waarvan bekend is dat hun staarten, zoals C57Bl6 / J klimmen, wordt gebruikt plaats Climbstoppers rond de staart voorafgaand aan het aanbrengen van de tape.
6. Houd u de tape om de staarten van de muizen. Gebruik maken van de gemarkeerde einde van de band en zorg ervoor dat de tape kleeft aan de staart en terug op zichzelf. De tape moet worden toegepast op het einde van de staart met 2-3 millimeter van de staart blijven buiten de tape.
7. Eenmaal per stuk tape is bevestigd aan een muis staart stok het middelste deel van de tape aan de binnenwanden van de kooi. Dit zal helpen bij het voorkomen van klitten band stukken aan elkaar. Merk op dat confinement op deze manier kan leiden tot stress en dat het belangrijk is om het proces van de toepassing van de tape elk dier zo snel mogelijk.
8. Zodra alle tape wordt toegepast, start de opname en identificeren van de zitting vóór de muizen zijn opgeschort.
9. Hang de dieren door het plaatsen van het vrije uiteinde van de tape op de schorsing bar of plank in een volgorde die wordt gecompenseerd tussen de behandelingsgroepen. Te schorten muizen in een manier die belemmert niet de camera te bekijken, omdat de hele TST sessie zal worden gescoord en het belemmeren van de camera zal leiden tot het onvermogen om gedrag te beoordelen in die tijd. Controleer of alle tape uiteinden parallel opknoping om de schorsing bar of plank met een vergelijkbare lengte van speling voor elke muis.
10. Aan het eind van de sessie (die typisch is zes minuten), terug de dieren naar de homecage en voorzichtig de tape te verwijderen uit elke staart door het voorzichtig uit. Niet rippen de tape van de staart, omdat dit kan pijn veroorzaken aan de mice.
11. Na zijn terugkeer de muizen naar hun kolonie kamer gooi de fecale boli en de urine uit de collectie laden en veeg het apparaat met een sterilisatie-oplossing.

3. Gedrag Analyse

1. Over het algemeen is de TST is van begin tot zes minuten af ​​in lengte. In tegenstelling tot andere veel gebruikte antidepressieve werking procedure, de gedwongen zwemmen test, is de hele sessie gescoord. Dit is te wijten aan de algemene bevinding dat muizen hebben de neiging om zich te manifesteren immobiliteit eerder in de TST.
2. In ons laboratorium hebben we direct uploaden van de video bestanden van de camera naar een PC waar de analyse wordt uitgevoerd.
3. Tijdens de gedragsanalyse de tijd dat elke muis besteedt als mobiele wordt gemeten. Hoewel het mogelijk is om de immobiliteit tijd direct te meten, hebben we vonden het makkelijker op te sporen en actieve bewegingen te meten in plaats van het ontbreken van een dergelijke bewegingen.
4. Het belangrijkste aspect van de TST gedrags-analyse is de consequente identificatie van de bewegings die zijn opgenomen als bona fide mobiliteit. Muizen, vooral in het begin van de sessie, manifeste gedragingen die openlijk zijn ontkomen verbonden. Deze omvatten proberen om de muren van de apparatuur en de vering bar, sterke bewegingen van de body, en de beweging van de ledematen verwant aan lopen te bereiken. Deze bewegingen vormen duidelijk mobiliteit. Deze gedragingen dan verdwijnen en worden subtieler. In ons laboratorium kleine bewegingen die beperkt tot de voorste poten, maar zonder de betrokkenheid van de achterpoten zijn niet meegeteld als mobiliteit. Bovendien, trillingen en slinger, zoals schommels die te wijten zijn aan het momentum opgedaan tijdens de eerdere mobiliteit aanvallen zijn ook niet meegeteld als mobiliteit.
5. In ons laboratorium hebben we gebruik van een on-screen stopwatch software voor tijd metingen (XNote Stopwatch, dnSoft Research Group). Twee afzonderlijke stopwatches worden gebruikt op het scherm. De eerste stopwatch telt af van 360 seconden en waarschuwt de waarnemer als de gedragsanalyse periode eindigt. De tweede stopwatch-gecontroleerd door de waarnemer-meet de tijd die mobiel. Bepaalde stopwatch software heeft de mogelijkheid om toetsen toe te wijzen aan het starten en stoppen functies, zodat op het scherm het toetsenbord kan de stopwatch controleren. In plaats van een regulier toetsenbord, gebruiken we een invoerapparaat algemeen bekend als een 'gamepad' om de chronometers te controleren.
6. Als er meer dan een muis getest en presenteren op het scherm is het een goed idee om de andere dieren te dekken, zodat hun bewegingen niet zal de waarnemer af te leiden. Dit kan worden bereikt door met een ander programma-venster of door fysiek met betrekking tot de andere muizen op het scherm met papier.
7. Er kan enige vertekening optreedt indien het totale bedrag van de mobiliteit tijd die is verstreken voor een bepaalde muis zichtbaar is voorafgaand aan de voltooiing van de analyses sessie. Als een on-screen stopwatch wordt gebruikt, raden wij u aan alle, maar de milliseconde decimalen van de stopwatch te dekken. Door het bedekken van de stopwatch de waarnemer kent alleen de vraag of de stopwatch isaan of op elk punt, maar weet niet de totale verstreken tijd en kan dus niet worden beïnvloed door vooringenomenheid. Met behulp van deze aanpak van de waarnemer, terwijl blind voor de groepsopdrachten van de dieren, zal niet een algemeen idee van het niveau van de mobiliteit in elk dier.
8. Een interobserver betrouwbaarheid test moet worden uitgevoerd voor elke nieuwe waarnemer alvorens te beginnen met de gegevens van proefdieren te verzamelen. In ons laboratorium elke nieuwe waarnemer horloges eerst een ervaren waarnemer, waar hij of zij is scoren. Nadat de nieuwe waarnemers krijgen voldoende vertrouwen om de mobiliteit te onderscheiden van immobiliteit, ze vervolgens score in real time met de ervaren waarnemer te kijken en te wijzen op eventuele fouten. Zodra deze fase is voltooid, zal de nieuwe waarnemers analyseren van een specifieke set van TST video's die we in ons laboratorium te behouden voor trainingsdoeleinden. Pas na een hoge mate van interobserver correlatie wordt verkregen met de ervaren waarnemer heeft een onderzoeker analyseert TST video's van de reëleexperimenten. We archief van de gegevens van deze training analyses tot een interne standaard voor het laboratorium vormen. We hebben waargenomen verschillen tussen stammen in de manier waarop ze express mobiliteit (en immobiliteit) gedrag, en de gemiddelde tijd tussen de geslachten immobiliteit. Wanneer er een nieuwe stam, geslacht of genetisch gemodificeerde muis model is getest in het laboratorium is het noodzakelijk om opnieuw te ondernemen dit soort betrouwbaarheidsanalyse.

4. Representatieve resultaten

We hebben de TST om antidepressivum-achtige reacties op lithium behandeling in verschillende muizenstammen (figuur 1) ³ te beoordelen. Experimentele details van dit experiment zijn gepubliceerd in Can et al.., 2011 ^3.

Figuur 1. Immobiliteit keer in de staart schorsing test na chronische toediening bij lithium vijf inteelt muizenstammen. Muizen werden groepswoningd, vier muizen per kooi. Muizen in de lithium-behandelde groep kreeg lithium chow met 4 g / kg LiCl voor drie weken. Controle dieren kregen hetzelfde voedsel zonder de lithium chloride. **: P <0,01, ***: p <0,001 duiden op een belangrijke, ongepaarde t-test. De gegevens worden uitgedrukt als gemiddelde ± SEM. n :10-12 dieren per groep voor elke stam. (Figuur overgenomen uit ^3).

In dit voorbeeld wordt een significant effect van de behandeling van chronische lithium geleverd in voedsel alleen waargenomen in C57BL/6J en DBA/2J stammen. In de andere drie stammen, was geen statistisch significante daling in de onbeweeglijkheid tijd waargenomen. Deze gegevens geven aan dat een antidepressivum-achtige reactie op de chronische lithium behandeling is afhankelijk stam is ook waargenomen met andere antidepressieve medicijnen ^4-8.

Discussie

Ontwikkeling van de TST door Steru et al.. ⁹ werd beïnvloed door de eerder ontwikkelde geforceerde zwemtest ^10-12. Net als bij de gedwongen zwemmen test, in de TST muizen zijn geplaatst in een onontkoombare, maar matig stressvolle situatie. Gebrek aan ontsnappen gedrag wordt beschouwd immobiliteit. Net als de geforceerde zwemtest, de TST is een test best gevalideerd voor de evaluatie van de antidepressieve werking van drugs, maar ook gebruikt om de effecten van milieu-, neurobiologische en...

Materialen