Methodenartikel

Spatio-temporele Manipulatie van kleine GTPase activiteit bij subcellulaire niveau en op de tijdschaal van seconden in levende cellen

DOI:

10.3791/3794

⸱

9 maart 2012

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cell Biology, Center for Cell Dynamics, Johns Hopkins University, 2Graduate School of Pharmaceutical Sciences, University of Tokyo, 3Biomedical Engineering, Johns Hopkins University

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Werkwijze voor tijdruimtelijke controle kleine GTPase activiteit licht beschreven. Deze methode is gebaseerd op rapamycine-geïnduceerde FKBP-FRB heterodimerisatie en foto-kooien systemen. Optimalisatie van het licht-bestraling kan de ruimtelijk-tijdelijk bestuurd activering van kleine GTPases op het subcellulaire niveau.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dynamische regulatie van de Rho familie van kleine guanosine triphosphatases (GTPases) met veel ruimte en tijd precisie essentieel is voor de verschillende cellulaire functies en gebeurtenissen 1, 2. Hun spatiotemporeel dynamische karakter is geopenbaard door de visualisatie van hun activiteit en lokalisatie in real-time 3. Om dieper inzicht in hun rol in diverse cellulaire functies op moleculair niveau te krijgen, moet verstoring van eiwit de activiteiten van de volgende stap zijn op een precieze subcellulaire locatie en timing.

Om dit doel te bereiken, hebben we een methode ontwikkeld voor licht-geïnduceerde, spatio-temporeel gecontroleerde activatie van kleine GTPases door het combineren van twee technieken: (1) rapamycine-geïnduceerde FKBP-FRB heterodimerisatie en (2) een foto-kooien methode van rapamycine. Met het gebruik van rapamycine-gemedieerde FKBP-FRB heterodimerisatie, hebben we een methode ontwikkeld voor het snel induceerbaar activatie of inactivatie van kleine GTPases including Rac 4 Cdc42 4 RhoA 4 en Ras 5, waarbij rapamycine induceert translocatie van FKBP-gefuseerde GTPases of hun activatoren naar de plasmamembraan waar FRB verankerd. Voor de koppeling met deze heterodimerisatie systeem, hebben we ook een foto-kooien systeem van rapamycine analogen. Een foto-kooi verbinding is een klein molecuul waarvan de activiteit wordt onderdrukt met een photocleavable beschermende groep bekend als een kooi groep. Om heterodimerisatie activiteit volledig onderdrukken, hebben we een gekooide rapamycine dat gebonden is aan een macromolecuul dat de verkregen grote complex niet de plasmamembraan steken, waardoor vrijwel geen achtergrondactiviteit als chemisch dimerizer in cellen 6. Figuur 1 toont een schema van onze systeem. Met de combinatie van deze twee systemen, wij lokaal aangeworven a Rac activator aan de plasmamembraan op een tijdschaal van seconden en bereikt het licht-geïnduceerde Rac activatie aan de subcellulaire level 6.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Transfectie van plasmide DNA

  1. Voeg plasmide DNA's, 0,5 ug membraan-tethered FRB (hierna LDR) en 0,5 ug FKBP-Tiam1 (T-cel lymfoom invasie en metastase-inducerende eiwit 1: Rac activator) getagd met fluorescerend eiwit tot 37,5 ui dH 2 O. Voeg 1 pi FuGENE HD.
  2. Vortex en incuberen bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten. Ondertussen gaat u verder met de stappen 1.3-1.8.
  3. Was elk putje van een 8-well kamer met 50 pi poly-D-lysine.
  4. Was het midden van elke goed met dH 2 O.
  5. Trypsinize 80-85% confluent NIH-3T3 cellen en verdun tot 10 ml kweekmedium (DMEM met 10% FBS).
  6. Verwijder 375 ul van de opschorting en centrifugeer bij 1750 omwentelingen per minuut gedurende 3 minuten.
  7. Zuig de media, zorg dat u de pellet te verstoren.
  8. Voeg 750 ul DMEM w / 10% FBS en resuspendeer.
  9. Voeg celsuspensie aan dH 2 O / DNA / FuGENE HD-oplossing toe en meng voorzichtig.
  10. Voeg 250pi cellen / DNA suspensie aan elk putje (vult zich 3 putten).
  11. Incubeer de getransfecteerde cellen bij 37 ° C en 5% CO2 gedurende 15-18 uur.

2. Voorbereiding van de CRB-Een oplossing

  1. Synthetiseren gekooide rapamycine-biotine adduct (CRB). Zie "Synthetische schema van crb" voor details. In het kort worden kooien en biotine groepen afzonderlijk bereid. De kooien groep is dan geconjugeerd aan rapamycine (LC lab), het product vervolgens gekoppeld aan de biotine vrijmaken door middel van klik reactie 7 tot en met crb veroorloven.
  2. Bereid een 1 uM stockoplossing van crb in DMSO.
  3. Los 1mg avidine in 250 ul PBS in een 0,5 ml eppendorfbuisje.
  4. Voeg 1 ul van crb voorraad oplossing opgelost avidine. Meng door deze meermaals te keren.
  5. Incuberen bij kamertemperatuur gedurende 15 min om CRB-avidine-conjugaat (CRB-A opleveren) Oplossing.
  6. Uitsluiten niet-gebonden kleine moleculen en te zuiveren CRB-A met een grootte-uitsluiting kolom.

3. Microscopie en licht verlichting op subcellulaire niveau

  1. Serum verhongeren getransfecteerde cellen in DMEM zonder FBS gedurende 12 uur.
  2. Zuig het medium uit de cellen en voeg 250 ul van de bereide 400 nM CRB-A (uit stap 2.6).
  3. Om eiwitdynamica visualiseren in levende cellen op subcellulaire resolutie voor en na de lichtbehandeling, draaide disk microscopie gebruikt (Figuur 2a). UV-belichting werd bereikt door het koppelen van optiek voor UV-LED-licht (365 nm) met een epi-fluorescentie licht (Figuur 2b).
  4. Metamorph software werd gebruikt om fluorescentie beelden van getransfecteerde cellen om de 15 seconden vast te leggen.
  5. Bepaal de coördinaten en de grootte van een verlichting ter plaatse door middel van een glazen plaat bedekt met fluorescerende kleurstoffen opgewonden door UV-licht. De grootte kanworden gevarieerd door toepassing objectief met verschillende vergrotingen te selecteren en optische vezels met verschillende afmetingen kern.
  6. Na het bepalen achtergrondniveaus membraan plooien, het bestralen UV licht aan de rand van cellen. De volgende twee stappen zijn om tegenover voorgaande lokale effecten.
  7. Wereldwijd bestralen cellen met 365 nm licht dat door een kwiklamp.
  8. Los Uncaged, dus originele rapamycine in DMSO en daarna in PBS (400 nM definitief), en voeg de oplossing voor de beeldvorming kamer aan de mondiale effecten te veroorzaken.

4. Representatieve resultaten

Een voorbeeld van representatieve resultaten is weergegeven in figuur 3. UV-licht bestraling in een kleine regio in de buurt van een mobiele rand snel geïnduceerde vorming van gelokaliseerde ruches alleen in en nabij het bestraalde gebied. Om te bevestigen dat dit inderdaad lokale activiteit, we dan de hele wereld cellen bestraald met UV-of toegevoegd rapamycine het grootste deel media, zowel van de whilel veroorzaakt wereldwijde ruche vorming in het membraan. Voor een kwantitatieve analyse, we target cellen verdeeld in vier kwadranten, en telde de frequentie van ruches vorming in elk kwadrant op zowel lokaal als mondiaal na stimulatie onder verschillende omstandigheden met inbegrip van controles (figuur 4). Het is alleen deze combinatie van UV-straling, CRB-A, en passende FKBP-FRB constructies die de lokale plooien veroorzaakt.

figure-protocol-1
Figuur 1. Schematische voorstelling van ruimtelijk beperkt eiwit dimerisatie met behulp van gekooide rapamycine-avidine conjugaat (CRB-A) en UV-licht. UV-bestraling splitst de linker tussen rapamycine en biotine, waardoor het vrijkomen van chemische dimerizer (HE-Rapa, C40-O-(2-hydroxyethyl) rapamycine) en de bijproduct. De vrijgekomen dimerizer verspreidt dan in cellen en induceert dimerisatie tussen FKBP-POI (eiwit van belang) en plasma-membrane verankerd FRB slechts in de nabijheid van het bestraalde gebied (blauwe cirkel). Zonder de UV-straling, FKBP en FRB geen deelgenoten (Rode Kruis), vandaar de productie geen effect. (Copyright @ ACS2011) 6

figure-protocol-2
Figuur 2. Afbeelding van de aangepaste confocale fluorescentiemicroscoop. (A) vooraanzicht van de confocale microscoop (omgekeerde Axiovert 200 Zeiss). (B) Detail, bovenaanzicht van een koppelingselement voor EPI fluorescentie en UV licht.

figure-protocol-3
Figuur 3. Plaatsgebonden ruches vorming in een getransfecteerde NIH3T3 cel geïnduceerd door lokale UV-straling. Confocale fluorescentie beelden van een NIH3T3 fibroblast cel die is getransfecteerd met YFP-gelabeld FKBP-Tiam1 (Rac activator) en LDR (membraan-verankerd FRB) ondergingen bestraling in een afgesloten ruimte in de buurt van de rand met LED licht bij 365 nm 15 sec 210 sec vanaf in aanwezigheid van CRB-A-conjugaat in de bulk media. Deze behandeling werd gevolgd door de wereldwijde verlichting met kwik lamp gedurende 1 sec bij 1063 sec en wereldwijde toevoeging van rapamycine laatste 400 Nm bij 1.560 sec. De cel liet bijna geen plooien activiteit aan het begin (a) maar toonde ruimtelijk beperkt plooien na gelokaliseerde verlichting (gele cirkel) (b). De cel bleek wereldwijde ruche vorming na globale verlichting en de toevoeging van rapamycine (cd), wat aangeeft dat de plaatselijke ruches formatie werd veroorzaakt door ruimtelijk beperkt activatie van Rac. Schaal bar: 10 micrometer. (Copyright @ ACS2011) 6

figure-protocol-4
Figuur 4. Frequentie van plooien ontstaan ​​in kwadranten van getransfecteerde cellen NIH3T3. Lokale UV-bestraling met CRB-A en volgende globale UV-straling werden uitgevoerd op 13 cellen. CRB-A toevoeging (geen UV bestraling) werden lokale UV bestraling met of zonder avidine uitgevoerd op 13 5 en 6 cellen. Geen van de waargenomen cellen toonde ruche formatie met CRB-A zonder UV-straling, of lokale UV-bestraling met of zonder avidine in bulk media. We verzamelden gegevens van de cellen met lage achtergrond ruche vorming maar had de capaciteit van rapamycine geïnduceerde vorming ruche welke wij na elke proef gecontroleerd door te controleren globale ruche vorming ten gevolge van de toevoeging van rapamycine (uiteindelijke 400 nM). Deze resultaten laten zien dat CRB-A en UV bestraling plaatselijk nodig voor lokale plooien vorming in de cellen. (Copyright @ ACS2011) 6

Afkortingen:

FKBP: FK506-bindend eiwit
FRB: FKBP-rapamycine-bindend eiwit
Tiam1: T-cel lymfoom invasie en metastase-inducerende eiwit 1 (Rac GEF)
LDR: Lyn-DSAG linker-FRB (Lyn: N-terminale 11 aminozuren van Lyn kinase)
HE-Rapa: C40-O - (2-hydroxyethyl) rapamycine
crb: gekooide rapamycine met biotine-groep
CRB-A: crb geconjugeerd met avidine

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We beschreven een techniek die een nieuwe kooi samengestelde werken samen met de FKBP-FRB heterodimerisatie systeem om Rho GTPase activiteit te manipuleren op een precieze subcellulaire locatie op een tijdschaal van seconden.

Er zijn drie beperkingen van deze aanpak. Ten eerste omdat de methode berust op het voorkomen of het laten diffunderen van dimerizer in de plasmamembraan het doel cellulaire locatie moet plasmamembraan of zijn omgeving. Verdere optimalisatie van de chemische structuur v...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Geen belangenconflicten verklaard.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze studie werd ondersteund door NIH financiering van onderzoek (DK090868 en GM092930 aan TI). Er is een octrooi op een gekooide rapamycine analoog.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Naam van het reagens / apparatuur Vennootschap Catalogusnummer
Rapamycine Tecoland RAPA99
FuGENE HD Roche 04709691001
Avidine Sigma A9275-10MG
DMSO Sigma D2650-5X5ML
Grootte-uitsluiting kolom GE Healthcare Spin Trap G-25
Met glazen bodem 8-kamer goed Thermo Scientific 12-565-47
Omgekeerde fluorescentiemicroscoop Zeiss Axiovert200M
UV-LED lichtbron Rapp Opto Electronics UVILED
Confocale draaiende schijf Yokogawa Electric Corp CSU10
CCD camera Hamamatsu Photonics ORCA-ER
100x objectief lens Zeiss Plan Apochromat

Synthetische schema van CRB (Copyright ACS2011) 6

figure-materials-1
Synthetische voorwaarden: (a) BnBr, K 2 CO 3 DMF (b) f.HNO 3, AcOH (c) TFA (d) propargyl-Br, K 2 CO 3, DMF, (e) glycerol, cat. PTSA, tolueen (f) NaBH 3 CN, TiCl4, MeCN (g) 2 O Tf, Pyridine (h) methanol HCl (i) LiAlH4, THF (j) TsCl, pyridine, CH2 Cl 2 (k) NaN 3 DMF (l) 8, 2,6-di-t-butylpyridine, CH2 Cl 2 (m) 13 CUSO4, ascorbaat, 2-propanol, H2O, CH2 Cl 2.

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Etienne-Manneville, S., Hall, A. Rho GTPases in cell biology. Nature. 420, 629-635 (2002).
  2. Takai, Y., Sasaki, T., Matozaki, T. Small GTP-binding proteins. Physiol. Rev. 81, 153-208 (2001).
  3. Kiyokawa, E., Aoki, K., Nakamura, T., Matsuda, M. Spatiotemporal regulation of small GTPases as revealed by probes based on the principle of Forster Resonance Energy Transfer (FRET): Implications for signaling and pharmacology. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 51, 337-358 (2011).
  4. Inoue, T., Heo, W. D., Grimley, J. S., Wandless, T. J., Meyer, T. An inducible translocation strategy to rapidly activate and inhibit small GTPase signaling pathways. Nat. Methods. 2, 415-418 (2005).
  5. Komatsu, T. Organelle-specific, rapid induction of molecular activities and membrane tethering. Nat. Methods. 7, 206-208 (2010).
  6. Umeda, N., Ueno, T., Pohlmeyer, C., Nagano, T., Inoue, T. A photocleavable rapamycin conjugate for spatiotemporal control of small GTPase activity. J. Am .Chem. Soc. 133, 12-14 (2011).
  7. Kolb, H. C., Finn, M. G., Sharpless, K. B. Click Chemistry: Diverse Chemical Function from a Few Good Reactions. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 40, 2004-2021 (2001).
  8. Kennedy, M. J. Rapid blue-light-mediated induction of protein interactions in living cells. Nat. Methods. 7, 973-975 (2010).
  9. Levskaya, A., Weiner, O. D., Lim, W. A., Voigt, C. A. Spatiotemporal control of cell signalling using a light-switchable protein interaction. Nature. 461, 997-1001 (2009).
  10. Wu, Y. I. A genetically encoded photoactivatable Rac controls the motility of living cells. Nature. 461, 104-108 (2009).
  11. Yazawa, M., Sadaghiani, A. M., Hsueh, B., Dolmetsch, R. E. Induction of protein-protein interactions in live cells using light. Nat. Biotechnol. 27, 941-945 (2009).
  12. Fegan, A., White, B., Carlson, J. C., Wagner, C. R. Chemically controlled protein assembly: techniques and applications. Chem. Rev. 110, 3315-3336 (2010).
  13. Suh, B. C., Inoue, T., Meyer, T., Hille, B. Rapid chemically induced changes of PtdIns(4,5)P2 gate KCNQ ion channels. Science. 314, 1454-1457 (2006).
  14. Varnai, P., Thyagarajan, B., Rohacs, T., Balla, T. Rapidly inducible changes in phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate levels influence multiple regulatory functions of the lipid in intact living cells. J. Cell. Biol. 175, 377-382 (2006).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Lichtge nduceerde activatieRapamycine heterodimerisatieFoto gecageerd rapamycineSubcellulaire lokalisatieUV lichtmanipulatieMembraanruffling analyseSpinning disc confocale microscopieFKBP FRB systeemRAC activator rekrutering

Gerelateerde artikelen