Real-time Digital Imaging van leukocyt-endotheliale Interactie in ischemie-reperfusie schade (IRI) van de Rat cremasterspier

Samenvatting

Digitale intravitale epifluorescentie microscopie van postcapillaire venulen in de cremasteric microcirculatie is een handige methode om inzicht te krijgen in leukocyten-endotheliale interactie In vivo In ischemie-reperfusie schade (IRI) van dwarsgestreept spierweefsel. Wij hier een gedetailleerd protocol om veilig uit te voeren de techniek en de toepassingen en beperkingen te bespreken.

Samenvatting

Ischemie-reperfusie schade (IRI) is betrokken bij een groot scala aan pathologische aandoeningen zoals cerebrale beroerte, hartinfarct, darmischemie en na de transplantatie en cardiovasculaire chirurgie. ^Een Reperfusie van eerder ischemisch weefsel, terwijl het van essentieel belang voor het voorkomen van onomkeerbare weefselbeschadiging, ontlokt veel ontsteking van het aangetaste weefsel. Naast de productie van zuurstofradicalen, activering van het complement systeem verhoogd microvasculaire permeabiliteit, de activering van leukocyten is een van de voornaamste actoren de pathologische cascade van inflammatoire weefselbeschadiging reperfusie. ^{2, 3} leukocytactivatiesyndroom een complex proces bestaat rollend, stevige hechting zielsverhuizing en wordt bemiddeld door een complex interactie tussen adhesiemoleculen reactie op chemoattractants zoals complementfactoren, chemokines, en bloedplaatjes-activerende factor ^4. <p class = "jove_content"> Terwijl rollen van leukocyten in postcapillaire venules voornamelijk gemedieerd wordt door de interactie van selectines ⁵ met hun liganden tegen, stevige hechting van leukocyten aan het endotheel is selectine gecontroleerde via binding aan intercellular adhesion molecules (ICAM) en vasculaire cellulaire adhesiemoleculen (VCAM). ^{6, 7}

Gouden standaard voor de in vivo waarnemingen van leukocyt-endotheliale interactie is de techniek van intravitaal microscopie eerst beschreven in 1968 ^8.

Hoewel de verschillende modellen van IRI (ischemie-reperfusie schade) zijn beschreven voor verschillende organen, ^9-12 slechts enkele zijn geschikt voor directe visualisatie van leukocyt rekrutering in de microvasculaire bed op een hoog niveau van beeldkwaliteit. ⁸

Wij hier bevorderen digitale intravitaal epifluorescente microscopie van de postcapillaire venule de cremasteric microcirculatievan de rat ¹³ als een handige methode om leukocyten werving kwalitatief en kwantitatief te analyseren voor de IRI-onderzoek in dwarsgestreept spierweefsel en een gedetailleerde handleiding voor het vervullen van de techniek. We illustreren verder voorkomende valkuilen en geven nuttige tips, die in staat moet stellen de lezer echt te waarderen, en veilig uit te voeren van de methode.

In een stap voor stap protocol waarin we beschrijven hoe te beginnen met de ademhaling gecontroleerd anesthesie in voldoende controle om het dier stevig onder narcose te houden voor een langere periode van tijd. Daarna beschrijven we de cremasteric preparaat als een dunne vlakke plaat voor een uitstekende optische resolutie en een protocol voor leukocyten beeldvorming in IRI, dat goed is vastgelegd in onze laboratoria.

Protocol

1. Anesthesie en Monitoring

1. Passende nationale en institutionele ethiek moet zijn voordat het uitvoeren van dierproeven. Na goedkeuring van de ethische commissie Anesthetize mannelijke Sprague Dawley ratten met een lichaamsgewicht van 120 tot 180 g. Lever 2 tot 3 vol% isofluraan een plexiglazen box via isofluraan vaporizer en plaats de rat naar binnen.
2. Zodra het juiste niveau van de anesthesie wordt bereikt (gebrek aan reactie op teen of staart knijpen) de rat wordt gewogen en geschoren aan de ventrale cervicale gebied.
3. Plaats de rat in dorsale decubitus op een verwarmingselement voor lichaamstemperatuur bij 37 ° C en toepassing isofluraan van 2 vol% met een silicone masker.

De volgende bereidingsstappen zijn best bereikt met een chirurgische microscoop.

4. Voor de voorbereiding van de luchtpijp, de halsslagader en de halsader, het uitvoeren van een 2 cm horizontale incisie in de huid in het gebied of de suprasternal inkeping en lateraal te mobiliseren de speekselklieren.
5. Je hebt nu geconfronteerd met de ventrale nekspieren. Zorgvuldig scheiden ze in de middellijn en vind de luchtpijp. Expose 1 tot 2 cm van de luchtpijp en plaats een micro-pincet eronder om het op te richten.
6. Nu ongeveer halverwege snijden door de ventrale zijde van de luchtpijp. Zorg ervoor dat u helemaal doorgesneden, als je dat doet, het afgesneden uiteinde van de luchtpijp terug glijden in de borst en zeer moeilijk zijn om mee te werken.
7. Plaats een Abbocath buis (14G) als tracheatube in het onderste deel van de luchtpijp, die eerder is aangesloten op een ventilator dier. Tip: Stevig fixatie op magneet klemmen en hechten van de luchtpijp rondom de buis is essentieel voor de tracheale tube zijn plaats te houden. Over het algemeen hebben we textiel binnenwerk 5/0 hechting te gebruiken, kan echter vergelijkbaar hechtmateriaal gebruikt worden.
8. De ademhaling kan dan het volume gecontroleerd (frequentie, 35 tot 45 ademhalingen / minuut; ademvolume, 4,5 - 5 ml; FiO ₂ 0,35 tot 0,50,. Isofluraan 1.5-2 vol%) ¹⁴ Atelectase kan worden verhinderd door een positieve eindexpiratoire druk van 5 tot 10 mm _H2O ¹⁵
9. Voor de carotis canulation, wordt het recht sternohyoid spier gescheiden door stompe dissectie van de halsslagader te vinden.
10. Haal voorzichtig de nervus vagus van de halsslagader en monteer de slagader op een schuine micro-pincet om te stoppen met bloed stroomt uit het hart.
11. Langs twee stukken van gelijke lengte van hechtmateriaal onder de halsslagader. Met betrekking tot het hart, des te meer distale hechtdraad stevig gebonden aan bloed stroomt uit het hoofd regio terwijl de proximale hechting is losjes gebonden rond de halsslagader af te sluiten.
12. Met behulp van micro-schaar een kleine snede gemaakt in de halsslagader tussen de twee ligaturen.
13. Plaats een polyethyleen katheter (0,28 mm inwendige diameter) gevuld met fysiologische zoutoplossing die verbonden is met een druksensor.
14. Remove de micro-pincet en draai de katheter verder in de slagader. Draai vervolgens de proximale ligatuur rond de slagader en katheter. Tip: Toepassing van een tweede proximale hechting voorkomt bloedingen na het verwijderen van de micro-pincet.
15. Bind het distale ligatuur rond de halsslagader en de katheter voor extra verankering.
16. Voortdurend te controleren verdoving door de hartslag te bewaken en de arteriële druk. Voer intermitterende arteriële bloed gas analyse met behulp van een bloedgas analyser. ¹⁶ A hartslag van minder dan 300 slagen per minuut of meer dan 360 slagen per minuut en een gemiddelde arteriële druk daalt onder de 80 mmHg voor langer dan 5 minuten zijn de criteria voor uitsluiting. ^{17, 18} Onderhoud bloed pH-waarde binnen de fysiologische grenzen (7.35 tot 7.45). In het geval dat het experiment moet worden beëindigd als gevolg van abnormale controle op tarieven, gispen het dier bij de hals dislocatie of exanguation.

Voor de intraveneuze toepassing van fluorescerende kleurstoffen of andere drugs of belang, het volgende doen:

17. Stel het gebied van de linker halsader de chirurgische microscoop.
18. Met een pincet in elke hand, scheur de dunne fascia aan de halsader zichtbaar te maken. Monteer de ader op een schuine micro-pincet. De doorbloeding zal dan stoppen.
19. Met behulp van een tang, zijn twee stukken van gelijke lengte van de hechtdraad doorgegeven onder de halsader concordant aan de halsslagader canulation. Bind de distale hechtdraad stevig en de proximale hechting losjes om de halsader.
20. Maak een kleine snede in de halsslagader en plaats een polyethyleen catheter (0,28 mm binnendiameter) die is gespoeld met een zoutoplossing. Geven dat ingesneden en canulation kan strenger en tijdrovend is dan die van de halsslagader.
21. Rijg de katheter naar het hart en draai de ligatuur die het dichtst bij het hart rond de ader en de katheter.
22. Na conforme doorgankelijkheid, binden distale ligatuur rond de katheter. Tip: Extra fixatie van boe katheters met tape kunnen voorkomen losraken.
23. Vaak afspoelen catheters voor intraluminale stolling te voorkomen.

2. Voorbereiding van de Cremaster Muscle

1. We maken gebruik van een aluminium trap van 1,5 - 2 cm dikte voor cremasteric beeldvorming. Het podium neemt snel de gewenste temperatuur van het verwarmingselement zodat gemakkelijker thermische controle van de cremasteric weefsel. Dit is cruciaal voor een ontsteking studies. Als alternatief kan een plexiglas-platform kan worden gebruikt al zijn normatieve maatregelen van cremasteric temperatuur is moeilijker. Plaats het scrotum in het midden van het podium.
2. De eerste incisie wordt gemaakt in de huid en de externe sperma fascia boven het scrotum in het distale uiteinde, gevolgd door voorzichtige verwijding van de onderhuidse ruimte met behulp van fijne schaar. Vermijd het aanraken van het onderliggende weefsel met de instrumenten.
3. Zodra het weefsel wordt blootgesteld wordt bevochtigd met voorverwarmd (37 ° C) fosfaat gebufferde zoutoplossing with calcium en magnesium. De oplossing regelmatig blootgestelde weefsel.
4. Bindweefsel tussen de externe sperma fascia en de cremaster spier wordt voorzichtig verwijderd om de cremaster spier te bevrijden van het omringende weefsel.
5. Het buitenoppervlak van de cremasterspier is dan voorzichtig verwijdering van bindweefsel. Continu superfusie tijdens dissectie hydrateert het bindweefsel, het vergemakkelijken van de zichtbaarheid en verwijdering.
6. Hecht het distale uiteinde van de zak cremaster ingedrukt houden en licht uit te breiden het einde van de zak.
7. Incisie het distale uiteinde van de zak aan de ventrale aspect en proximaal langgerekte de incisie met behulp van micro schaar. Zorgvuldig cauterize bloeden schepen langs de incisie lijnen met behulp van een thermische cauterisatie. Vermijd onnodig cauterisatie om extra inflammatoire stimuli te beperken. Tip:. Doorbloeding dynamiek nabij de omtrek van de voorbereiding worden veranderd door deze weefselbeschadiging ¹⁹ Daarom, om het te minimaliserense gevolgen voor gegevensverzameling moet bloedvaten nabij het midden van het preparaat worden gebruikt voor beeldvorming.
8. De open cremaster ligt plat op de aluminium sokkel hoewel nog steeds met elkaar verbonden door een dunne ligament aan de bijbal onder de testikel. Als gevolg van de testikel naar een kant belicht dit ligament inclusief een kleine slagader en ader die aansluiten op de bijbal. Gebruik de cauterisatie de schepen af ​​te dichten en de micro-schaar om de verbindende ligament tussen testikel en cremasteric weefsel te snijden in dienst.
9. Duw terug de geïsoleerde testikel in de lies kanaal. Andere auteurs resectie de teelbal na proximale ligatuur (orchidectomie) samen met de bijbehorende lies rage pad. ²⁰ In een gevoelige model als IRI geïnduceerde leukocytactivatiesyndroom we proberen om alle extra chirurgische prikkels te vermijden, daarom hebben we onthouden van resecting de testis, die meestal niet noodzakelijk is om voldoende blootstelling van de cremaster spier te krijgen.
10. Naast de eerstefixatie hechting vier randen van het weefsel (twee aan elke kant) en bevestig de draden om tapes te voorzichtig radiaal verspreiding van de cremasteric weefsel op de aluminium podium. Het verlaten van een kloof tussen de aluminium podium en de externe ingang van het lieskanaal vereenvoudigt de daaropvolgende cremasteric knippen voor ischemie.
11. Plaats twee uiteinden van polyethyleen catheter (0,28 mm binnendiameter) dicht bij de cremasteric weefsel voor de superfusie setup. Zorg ervoor dat het lumen vrij is van de lucht om luchtbellen in de uiteindelijke vloeistofkamer te voorkomen.
12. Teken een lijn van vaseline (vaseline) rond de cremaster spier met een injectiespuit. De lijn moeten het formaat van de dekglas die wordt gebruikt voor dekking.
13. Om een ​​vloeistof kamer te maken, plaatst u een vierkant dekglas (32 × 32 mm) op het cremasteric weefsel en de randen stevig hechten aan de vaseline lijn.
14. Indien de cremasteric weefsel niet superfused met een specifiek geneesmiddel continue vervanging van de omringende griepid is niet-essentiële. Een toepassing van fosfaat gebufferde zoutoplossing met calcium en magnesium in de gemaakte kamer kan dan worden volstaan. Lokale stimulatie met drugs mag echter continu worden uitgevoerd via micro-perfusie pomp met een snelheid van 3 ml per uur.
15. De cremasteric weefsel is nu klaar voor microscopische beeldvorming.

3. Intravitale Setup

De basis intravitale setup kan variëren. Voor epifluorescentie beeldvorming van de experimenten moeten worden uitgevoerd in een donkere kamer.

1. Het dier wordt overgebracht naar de fase van een intravitaal epifluorescentiemicroscoop met een 470 nm LED lichtbron voor epi-verlichting. Gebruik een water-immersie objectief (20 × / 1,0) tot vergroting van ongeveer 800 × bereiken. Record waarnemingen door middel van een hoge resolutie digitale camera en opslaan van gegevens op een personal computer voor offline evaluatie.
2. Voor leukocyten etikettering, injecteren rhodamine6G intraveneus via de keel catheter bij concentraties van 0,4 mg / kg lichaamsgewicht.
3. Kies een postcapillaire venule ter observatie. Grootte van het vaartuig moet liggen 20-60 micrometer en de doorbloeding zou voldoende moeten zijn. Om de invloed van voor activering van het weefsel te minimaliseren, kan alleen vaten waarin rollen van leukocyten <20 cells/30 seconden en het aantal hechtende cellen <10 cells/200μm van venular endotheel worden gebruikt voor verdere analyse.
4. Indien mogelijk, kan maximaal drie postcapillaire venulen worden gebruikt voor observatie, maar ze moeten zich in een corresponderende deel van de cremasteric weefsel om te voorkomen dat verwarring de schepen op verschillende tijdstippen.

4. Ischemie-reperfusie schade (IIR)

1. Laat weefsel te stabiliseren gedurende 30 minuten.
2. Voer een opname van 30 seconden tot basale waarden voor de rollen van leukocyten en naleving vast te stellen. In het ideale geval het genereren van in totaal drie basale opnames naar cel te controlerennummers en standaardafwijkingen verkrijgen.
3. Voorzichtig plaats een Biemer vaartuig klem om het proximale uiteinde van de blootgestelde cremasteric weefsel met toepassing tang. Stasis moet onmiddellijk optreden en kunnen worden gevisualiseerd door epifluorescentie microscopie in de waargenomen vat sectie.
4. Verschillende tijdsverloop kan worden gebruikt, afhankelijk van het vereiste schade. We passen 30 minuten ischemie tijd zoals beschreven door andere auteurs. ^21-23 daarna Verwijder het schip klem. Laat bloed te stabiliseren nog 15 minuten.
5. Latere opnamen van 30 seconden duur kan worden verricht in de reperfusie periode (bijvoorbeeld 30 seconden om de 15 minuten). Digitaal op te slaan opnames voor offline analyse.
6. Voor de beëindiging van het experiment wordt de rat door cervicale dislocatie gedood in voldoende verdoving door een stomp instrument zoals doffe rand van een schaar aan de basis van de schedel. Met de anderekant is de basis van de staart snel getrokken, waardoor scheiding van de nekwervels van de schedel.

5. Offline Video afspelen Analyse

1. Voor offline afspelen van video-analyse is het nuttig om te gebruiken software die selectie van verschillende foto's en observatie van de video sequentie in slow motion laat. Stel de juiste contrast en de helderheid. We maken gebruik van software die door de fabrikant van de microscoop die lengte metingen en digitaal zoomen mogelijk maakt.
2. Voor de kwantificering van leukocyten rollen, definieert u een virtuele lijn die het schip snijdt verticaal die consistent is in alle records. Tel het aantal rollende leukocyten, dat de lijn passeren binnen 30 seconden handmatig.
3. Voor de kwantificering van hechtende leukocyten definiëren 200 pm vaartuig sectie die overeenkomt in alle records ²³ het aantal leukocyten die duidelijk zichtbaar blijven stilstaan ​​Tel gedurende 30 seconden. - Dus defined als aanhanger. ²⁴

6. Representatieve resultaten

IRI van de cremaster spier heeft geen effect op de gemiddelde arteriële bloeddruk (MAP), de hartslag en pH van het bloed

Met behulp van de bovengenoemde setup (figuur 1), onderzochten we de microcirculatie in IRI meer dan twee uur protocol, maar een veel langere observatietijd tot 6 uur is mogelijk. Zoals getoond in figuur 2 IRI van de cremasterspier geen significante invloed op de macrohemodynamic rat omloop gemiddelde arteriële druk en hartslag stabiel gedurende de onderzoekperiode. Verder hebben we gecontroleerd homeostase door frequente metingen van de arteriële bloed pH-waarde die varieerden binnen de fysiologische grenzen en toonde geen significante verschillen binnen een groep.

IRI induceert rollen van leukocyten in de cremasteric circulatie

Leukocyt endotheliale interactie is een belangrijkeIndien in de acute ontsteking. Door opklaren we een tijdsafhankelijke toename van het aantal rollen leukocyten in IRI van de cremasterspier (figuur 3A) overeenstemmende eerdere gegevens ^{21, 25.} Rolling gemonteerd over de twee uur observatietijd tot een maximum van 137,63 ± 22,55% van de uitgangswaarde na 120 minuten reperfusie tijd en dan bereikten statistische significantie in vergelijking met sham geopereerde dieren (137,63 ± 22,55 vs 99,43 ± 14,04% van de uitgangswaarde).

IRI induceert leukocyt adhesie in de cremasteric circulatie

Voor verdere evaluatie van leukocyt-endotheliale interactie die we geanalyseerd leukocyt adhesie in een 200 micrometer schip sectie. IRI veroorzaakte een toename van het aantal hechtende leukocyten die aanzienlijk boven waarden sham gebruikt dieren na 60 minuten (118,33 ± 6,83 vs 96,27 ± 5,78% van basislijn) en verder ASCEnded door 120 minuten reperfusie (Figuur 3B).

Kort samengevat is de beschreven in vivo model levert consistente gegevens van acute leukocyten activering in IRI, terwijl dieren overleven en de circulatie stabiliteit wordt gegarandeerd.

Figuur 1. A. Stroomdiagram voor intravitale epifluorescentie microscopie prestaties in ischemie-reperfusie schade van de rat cremaster spier. Volgende vereiste voorbereidingen voor de anesthesie en controle, wordt de rat cremaster spier blootgesteld voor de beeldvorming. Records van leukocyt activering worden genomen voor en na weefsel ischemie. Na video-analyse wordt het best uitgevoerd offline. B. Schematische afbeelding van de voorgestelde intravitale setup. Klik hier voor een grotere afbeelding te bekijken .

Figuur 2. IRI van de cremaster spier heeft geen effect op de gemiddelde arteriële bloeddruk (MAP), de hartslag en pH van het bloed. De gemiddelde arteriële druk (A) en hartslag (B) werden gevolgd om de 30 minuten gedurende het experiment via een druksensor na canulation van het recht halsslagader. Meting van de arteriële-pH (C) werd uitgevoerd na 0, 60 en 120 minuten. Waarden zijn gemiddelden ± SEM van 6 verschillende ratten en varieerde op fysiologische niveaus, zonder significante verschillen binnen een groep. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .

Figuur 3. IRI verhoogt leukocyten-Endotheliale interactie in de cremasteric omloop zijn. Na de etikettering van leukocyten met rhodamine 6G (0,4 mg / kg lichaamsgewicht) intravitale epifluorescentie microscopie werd gebruikt voor het leukocyten-endotheliale interactie in reperfusie schade te bepalen over een 120 minuten-protocol na 30 minuten van het weefsel ischemie. Records werden bij vergroting van ongeveer x 800. A. IRI aanzienlijk aantal rollen leukocyten in postcapillaire venules de cremasterspier toe met 120 minuten reperfusie dat leukocyt rollen blijft stabiel gedurende het experiment in cremasteric weefsel die niet ondergaan ischemie. Waarden zijn gemiddelden ± SEM van 6 waargenomen ratten. # P <0,05 met behulp van de ongepaarde t-toets. B. Het aantal adherente leukocyten wordt aanzienlijk verhoogd in een willekeurig gekozen 200 pm postcapillaire schip sectie na 30 minuten van cremasteric ischemie en de daarop volgende 60 minuten van weefsel reperfusie. Resultaten te krijgen, zelfs mobent uitgesproken na twee uur reperfusie periode. Waarden zijn gemiddelden ± SEM van 6 waargenomen ratten. # P <0,05 met behulp van de ongepaarde t-toets. C. vertegenwoordiger foto's van een postcapillaire venule voorafgaand aan ischemie (links) en 120 minuten na de IRI (rechts). hier om een grotere afbeelding te bekijken Klik .

Discussie

Leukocyten-endotheliale interactie, de productie van reactieve zuurstof soorten en activering van het complementsysteem zijn de belangrijkste kenmerken van de IRI-geïnduceerde weefsel disfunctie. ²⁶ De microcirculatie van het aangetaste weefsel wordt beschouwd als de integrale site voor de ontstekingsreactie ontstaan. Naast de ex vivo experimenten zoals stroomkamer assays ^{27, 28} is het verplicht om gevestigde modellen van intravitale beeldvorming te verstrekken aan verdere beoordeling van ...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Naam van de apparatuur:	Bedrijf:	Artikelnummer:	Opmerkingen:
Forene 100% (V / V)	Abt	B506	API isofluraan
Textiel binnenwerk Suture	Serag Weissner	OC108000
Portex Fine Boring Polythene Tubing	Smiths Medical	800/100/100	0,28 mm binnendiameter
0,9% zoutoplossing	Fresinus Kabi	808771
Change-A-tip luxe cauterisatie kit	Bovie Medical	DEL1
Abbocath-T-14G	Venisystems	G713- A01	als optische buis
Servo Ventilator 900C	Maquet		als dier ventialtor
Logische drukomvormer	Smiths Medical	MX1960
Sirecust 404 Monitor	Siemens
ABL 700 Benchtop Analyzer	Radiometer		voor bloed gasmeting
Verwarming pad	Effenberger	8319
Aluminium fase	Alfun	AW7022
Chirurgische microscoop OPMI 6-SDFC	Carl Zeiss
Microchirurgische instrumenten lab set	S & T	767
Biemer schip clip	Diener	64.562
Het toepassen tang	Diener	64.568	voor Biemer schip clip
Rhodamine 6G	Sigma-Aldrich	R4127
Vaseline witte DAB	Winthrop	2726853
Cover bril			32x32 mm
			Intravitale setup
Zeiss Axio Scope A-1 MAT	Carl Zeiss	490036	epifluorescentiemicroscoop
470 nm LED	Carl Zeiss	423052	fluorescentie lichtbron
Colibri 2-systeem	Carl Zeiss	423052
W Plan-Apochromat 20x / 1,0 DIC	Carl Zeiss	421452	onderdompeling in water doel
Axiocam MRM Rev 3 FireWire	Carl Zeiss	426509	hoge resolutie digitale camera
Axio visie LE-software	Carl Zeiss	410130	te gebruiken voor offline analyse