Hier beschreven is een techniek waarbij lipopolysaccharide wordt in de zogende muis uier geïnjecteerd via de tepel mastitis simuleren, een aandoening meestal veroorzaakt door bacteriële infectie. Lipopolysaccharide injectie tot verhoogde nucleaire factor kappa B (NF-kB) signalering, gevisualiseerd door bioluminescent afbeelding van een NF-KB luciferase reporter muis.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Intraductale Injectie van LPS als een muismodel van Mastitis: Signalering gevisualiseerd via een NF-KB Reporter Transgene
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Diermodellen van menselijke ziekte nodig zijn strikt bestuderen stadia van ziekteprogressie en geassocieerde mechanismen en uiteindelijk als pre-klinische modellen interventies te testen. In deze methoden beschrijven we een techniek waarbij lipopolysaccharide (LPS) wordt in de zogende muis uier geïnjecteerd via de tepel, effectief modelleren mastitis, of ontsteking van de klier. Deze gesimuleerde infectie resulteert in verhoogde nucleaire factor kappa B (NF-kB) signalering, zoals gevisualiseerd door bioluminescent afbeelding van een NF-KB luciferase reporter muis 1.
Ons uiteindelijke doel bij de ontwikkeling van deze methoden was om de ontsteking geassocieerd met mastitis bij de lacterende klier, die vaak ook roodheid, zwelling, en het immuunsysteem cel infiltratie 2,3 bestuderen. Daarom waren we ons ervan bewust dat incisie of elk type verwonding van de huid, de tepel of de klier om de LPS zou introducerenniet worden gebruikt in onze werkwijze, aangezien de benadering waarschijnlijk de uitgelezen verwarren van ontsteking. We hebben ook gewenst een straight-forward methode waarvoor geen speciaal gemaakt handgetekende pipetten of het gebruik van micromanipulators om deze gespecialiseerde tools zijn plaats te houden. Zo hebben we vastgesteld dat een commercieel verkrijgbare insulinespuit gebruiken en de agent injecteren in de borstklier kanaal van een intact tepel. Deze methode is succesvol en konden we de ontsteking die door LPS injectie bestuderen zonder enig extra effect bedekt door het proces van injectie. Daarnaast is deze methode ook gebruik gemaakt van een NF-KB luciferase reporter transgene muis en bioluminescente beeldtechnologie om visueel en kwantitatief tonen toegenomen NF-kB signalering in de LPS-geïnjecteerde klier 4.
Deze methoden zijn van belang voor onderzoekers van de vele disciplines die aan modelziekte wensen binnen de zogende borstklier, als uiteindelijk de techniekhier beschreven kan worden gebruikt voor injectie van een aantal stoffen, en is niet beperkt tot alleen LPS.
Protocol
Alle dierproeven werden goedgekeurd door de Vanderbilt University Institutional Animal Care en gebruik Comite.
1. Voorbereiden transgene muizen
- Vrouwelijke muizen positief voor het NGL (N F-kB-G FP-L uciferase) reporter transgen (hiervoor beschreven 1) worden gebruikt voor deze procedure. Wanneer vrouwtjes zijn ten minste 6 weken oud, paren ze met een FVB wild type man. Harem breeding kan worden gebruikt (tot 4 vrouwtjes in een kooi met 1 man). (Let op: FVB stam muizen werden voor deze studie Darker strain muizen zoals C57Bl6 kunnen ook worden gebruikt, maar deze muizen moet voorafgaand aan beeldvorming worden geschoren.).
- Vanaf 15 dagen na de paring, regelmatig de vrouwtjes op tekenen van zwangerschap (grote uitstekende omtrek). Elke vrouwelijke moeten worden gescheiden zodra zwanger en de man uit de broedkooi, zodra de laatste vrouwelijke zwanger wordt.
- Bekijk de gescheiden vrouwen eend let op de datum van de geboorte, wanneer een nestje verschijnt. Een nest van minstens 6 pups vereist voor adequate lactatie. Acht dagen na de geboorte van het nest, door te gaan met het protocol (zie figuur 1 voor een schematische tijdslijn).
2. Voorbereiding voor injectie
- Los het E. coli LPS in PBS tot een eindconcentratie van 0,1 ug / ul. 50 ui van deze oplossing, of een totaal van 5 ug, worden geïnjecteerd in de borstklier. Bereid een tweede buis van PBS alleen worden gebruikt voor controle injectie.
- Set-up een dissectie omvang en isofluraananesthesie apparatuur. Een neuskegel apparatuur moet worden bevestigd aan de fase van de ontleden scope waar de muis wordt geplaatst. Een goede lichtbron, of zou het toepassingsgebied zelf of van extra spots ook worden bereid.
- Zodra de set-up is voltooid, start u de isofluraan machine en luchtstroom.
3. Intraductale Injectie van LPS
- Plaats de korte naald van de injectiespuit met 50 ul van de oplossing LPS. Opzij te zetten dit.
- Verdoof de muis om te worden geïnjecteerd door eerst de vrouwelijke in een isofluraan gevulde doos en dan een keer de ademhaling vertraagd is, zet haar op het podium en zet haar neus in de neus-kegel. Gebruik een teen knijpen om te bevestigen de muis is volledig verdoofd. Toezicht houden op de muis de ademhaling tijdens de gehele procedure en pas de isofluraan niveau. De kooi met het nest van pups die de vrouwelijke is overgenomen uit moeten zorgvuldig worden gereserveerd tot de dam kan worden teruggegeven na de procedure.
- Gebruik een kleine daling van 70% ethanol om de vacht plat en te helpen visualiseren de tepel aan de rechter # 4 inguinale borstklier op de lagere van de muis buik.
- Stel scherp op het ontleden ruimte voor een optimaal zicht op de tepel. Zorgvuldig gebruik maken van een reeks van fijne tang om verder te trekken uit de tepel weg van de huid, maar niet doorboren of letsel van de tepel in any way. Deforceps nooit stevig worden samengeklemd voor het manipuleren van het weefsel, maar gebruikt een licht houding die de minimale hoeveelheid spanning vereist op de tepel.
- Gebruik de tang in de linkerhand om voorzichtig te houden de tepel op zijn plaats. Langzaam breng de voorgevulde spuit in het gezichtsveld met behulp van de rechterhand. De injectiespuit moet worden gehouden zodat geen herpositionering moet gebeuren om de inhoud injecteren.
- Zodra de spuit in beeld is, zorgvuldig gericht op de kleine ductale opening in het centrum van de tepel en steek de spuit.
- Zonder het herpositioneren van de hand, injecteer de inhoud van de spuit en verwijder de naald uit de tepel.
- Plaats een tweede spuit met 50 ul van PBS voor de controle injectie. Plaats de muis op het podium en voor de beste weergave van de linker # 4 inguinale borstklier tepel aan de andere kant van de lagere van de muis buik. Herhaal stap 3,4 tot 3,7 met de PBS-gevulde spuit.
- Zodra beide injecties zijn complete, stop anesthesie en beweeg de muis om een herstel kooi. Toezicht houden op de vrouwelijke om te verzekeren dat ze mobiel wordt binnen 5 minuten. Laat de muis in de kooi recovery blijven gedurende 1 uur. Na 1 uur van herstel, plaats de vrouwelijke terug in de kooi met haar nestje pups. Muizen moeten periodiek worden gecontroleerd gedurende 6 uur na de injectie alvorens tot beeldvorming. In onze ervaring zijn geen nadelige gevolgen opgemerkt in de vrouwelijke of de pups in de periode tussen injectie en beeldvorming. Echter, als tekenen van nood worden waargenomen bij de vrouwelijke (bijv. gebogen houding, bijten of bewaking van de plaats van injectie, algemene lethargie) of de pups (geen beweging, blauwige kleur van de huid) het experiment moet worden stopgezet.
4. Bioluminescent Imaging naar NF-kB activiteit Visualiseer
- Zodra muizen zijn vervoerd naar de beeldvorming faciliteit, beginnen de beeldvorming procedure door het openen van de software en het initialiseren van de machine. Zet de isoflurane machine en luchtstroom, zodat de verdoving stroomt zowel de doos en het beeldkamer.
- Plaats de muis onder isofluraan anesthesie in het heldere anesthesie box. Zodra de ademhaling is vertraagd, gebruik dan een teen knijpen om te bevestigen de muis is volledig verdoofd. Vervolgens Injecteer 100 ui van luciferine substraat in de muis door retro-orbitale injectie 5 met een steriele injectiespuit.
- Onmiddellijk overdracht van de muis om de beeldvorming kamer en leg haar neus onder de isofluraan neuskegel er gevestigd. De muis moet rug. Zet elke voet op het podium met tape.
- Voer de juiste instellingen om de IVIS software om zowel een wit licht fotografisch beeld en een beeld van de bioluminescente activiteit te nemen. De belichtingstijd moet 10 sec. Scan de afbeelding.
- Zodra de foto's zijn verkregen, laat de muis om te herstellen en dan haar terug te plaatsen in de kooi met haar pups en bewaken periodiek.
- De fotografische en lichtgevendeafbeeldingen automatisch gelegd en op het scherm, zoals in figuur 2. Analyseer de verkregen beelden door het plaatsen van belang zijnde of "ROI" cirkels van gelijke grootte op elke zijde van de onderste muis buik (een over de PBS-geïnjecteerde klier en een over de LPS-geïnjecteerde klier). Zet de uitlezing om fotonen. Een aantal worden getoond die de fluorescentie gedetecteerd in elk ROI (zie figuur 2B). Gebruik dit nummer in statistische analyses.
- Voor een optimale beeld weer te geven, verder aan te passen de drempel van de weergegeven signaal. Dit verandert niets aan de totale luminescentie uitlezen, maar zal u toelaten om achtergrondsignaal te verwijderen en te visualiseren de verschillen tussen de controle-en LPS-behandelde klier. Verminder de hoeveelheid van luminescentie weergegeven nadat u de PBS-geïnjecteerde klier is vrij van achtergrondsignaal. Dit moet verlaten verhoogde signaal in de LPS-behandelde klier nog zichtbaar in het beeld, zoals weergegeven in figuur 2.
- Additional-analyse, met inbegrip van eiwit-en RNA-testen, kan worden aangevuld met borstweefsel verzameld uit de vrouwelijke post-mortem 6.
5. Representatieve resultaten
Om interpreteerbare resultaten van deze methoden te verkrijgen moet LPS (of PBS) toegediend worden alleen in de borst kanalen, waardoor het omliggende weefsel ongestoord. Injectie in het subcutane weefsel rond de tepel zal leiden tot ontsteking als gevolg van letsel dan de gesimuleerde infectie. Injectie van trypan blauwe kleurstof verdund in PBS is nuttig bij het leren van de techniek. Figuur 3A toont een succesvol geïnjecteerd klier doordrenkt met 100 pl trypan blauw in PBS. Zoals getoond, alleen het ductale boom gevuld worden met de geïnjecteerde oplossing en er geen bolus zijn op de injectieplaats. A "bolus" in deze context is een opbouw van de geïnjecteerde vloeistof op de tepel of in het weefsel rondom de nippel zonder infusie in de ductale boom. Dit is sheigen in Figuur 3B. Houd er rekening mee dat de praktijk injecties weergegeven in figuur 3 werden in een vrouw op dag 21 van de lactatie. Tijdens de hoogte van lactatie (dag 8-10, de fase waarin LPS geïnjecteerd met de huidige protocol), melk is overvloedig en het is moeilijk om de kanalen visualiseren en indien de injectie correct voltooid bepalen. Daarom latere tijdstippen in lactatie zijn beter voor de praktijk injecties.
Succesvolle injectie van LPS in de borstklier kanalen resulteert in een verhoogde NF-KB-activiteit in de klier. Dit moet blijken in de reporter muis op IVIS imaging en de LPS-geïnjecteerde gland moet aanzienlijk hoger luciferase activiteit (gemeten foton telling) dan de PBS-geïnjecteerde klier, zoals wordt geïllustreerd in figuur 2 (gemiddeld de LPS klier leest 200% van het stuursignaal PBS). Een statistisch significante toename in fluorescentie in de LPS-behandelde klieren hetARED met de contralaterale controle werd bereikt via de voltooiing van een groep van 4 muizen 4. Een extra studie ook gebruikt intraductal mammary injectie van hetzij E. coli of LPS in NF-kB reporter transgenen. Soortgelijke eigen werk Deze auteurs hebben een aanzienlijke toename van reporter-activiteit 6 uur na E. coli injectie 2.
Let door constitutieve NF-KB-activiteit in de hersenen en andere abdominale organen, het hoofd en buik van onze reporter muizen consequent een signaal wanneer afgebeeld, zelfs bij aanvang voor elke manipulatie. Daarom moet dit signaal worden genegeerd met betrekking tot dit experiment. Een duidelijk signaal moet binnen de LPS-geïnjecteerde borstklier na de beeld lees-out wordt aangepast om achtergrond fluorescentie minimaliseren in de PBS klier. Figuur 2 toont beelden met achtergrond verminderd.
Mislukte injectie van de klier zalwaarschijnlijk resulteren in schade aan de tepel. Dit zal leiden tot spits, huid-level ontsteking die zal blijken bij de beeldvorming. Dit type van verwonding signaal zeer sterk en beperkt tot de tepel waar de schade zich niet afkomstig gehele klier, gezien na een succesvolle LPS injectie in de kanalen.
Figuur 1. Schematische voor de procesvoering.
Figuur 2. Representatieve resultaten van IVIS bioluminescent imaging. (A) verkregen beeld met achtergrond verminderd, waaruit verhoogde luciferaseactiviteit in LPS-geïnjecteerde klier. (B) Afbeelding van A met regio van belang kwantificaties toegevoegd. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
Figuur 3 Practice injectie:.. Borstklier geïnjecteerd met kleurstof via intraductal injectie Om de nauwkeurigheid van levering via de tepel testen, een muis op dag 21 van de lactatieperiode werd geïnjecteerd met 100 pl trypan blauwe kleurstof verdund in PBS. Na offer, werd de klier blootgesteld voor visualisatie. (A) succesvolle injectie en (B) bolus van kleurstof op de tepel.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Hier hebben we een transgene NF-kB reporter muis en een geoptimaliseerde injectie techniek om model mastitis gebruiken, ontsteking van het borstweefsel meestal veroorzaakt door een bacteriële infectie. De belangrijkste stap in deze procedure is de intraductal injectie zelf.
In de praktijk is het meestal duidelijk of de intraductal injectie geslaagd is. De injectie van de middelen (LPS of PBS) moeten voelen vloeistof en er moeten weinig tot geen weerstand de spuit leeg is. De meest voorkomend...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Geen belangenconflicten verklaard.
Dankbetuigingen
Dit werk werd gefinancierd door NIH subsidie CA113734 toegekend aan F Yull en het Department of Veterans Affairs (TS Blackwell).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Naam van het reagens | Vennootschap | Catalogusnummer | Reacties |
| Lipopolysaccharide van Escherichia coli (LPS) | Sigma | L 2880 | serotype 055: B5 |
| PBS | Mediatech, Inc | 46-013 CM- | |
| 31 Gauge insulinespuit | Becton Dickinson | 328438 | Korte naald |
| Tang | Wereld Precisie-instrumenten | 15908 | |
| Ontleden scope | Leica | M3Z | |
| Terrell Isofluraan, USP | MINRAD INC voor Rx Elite | NDC 66794-011-25 | |
| IVIS 200 imaging systeem | Caliper (voorheen Xenogen) | N / A | |
| Spuit voor luciferine injectie | Becton Dickinson | 309597 | 1cc; 26G5 / 8 |
| D-Luciferin Firefly, natriumzout monohydraat (Luciferin substraat) | Biosynth Scheikunde en Biologie | L-8240 | Verdun tot 10 mg / ml |
Referenties
- Everhart, M. B., Han, W., Sherrill, T. P., Arutiunov, M., Polosukhin, V. V., Burke, J. R., Sadikot, R. T., Christman, J. W., Yull, F. E., Blackwell, T. S. Duration and intensity of NF-κB activity determine the severity of endotoxin-induced acute lung injury. The Journal of Immunology. 176, 4995-5005 (2006).
- Notebaert, S., Carlsen, H., Janssen, D., Vandenabeele, P., Blomhoff, R., Meyer, E. In vivo imaging of NF-κB activity during Escherichia coli-induced mammary gland infection. Cellular Microbiology. 10, 1249-1258 (2008).
- Elazar, S., Gonen, E., Livneh-Kol, A., Rosenshine, I., Shpigel, N. Y. Neutrophil recruitment in endotoxin-induced murine mastitis is strictly dependent on mammary alveolar macrophages. Veterinary Research. 41, 10(2010).
- Connelly, L., Barham, W., Pigg, R., Sait-Jean, L., Sherrill, T., Cheng, D. S., Chodosh, L. A., Blackwell, T. S., Yull, F. E. Activation of nuclear factor kappaB in mammary epithelium promotes milk loss during mammary development and infection. J. Cell. Physiol. 222, 73-81 (2010).
- Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. Retro-orbital injections in mice. Lab Animal. 40, 155-160 (2011).
- Plante, I., Stewart, M. K., Laird, D. W. Evaluation of mammary gland development and function in mouse models. J. Vis. Exp. (21), e2828(2011).
- Behbod, F., Kittrell, F. S., LaMarca, H., Edwards, D., Kerbawy, S., Heestand, J. C., Young, E., Mukhopadhyay, P., Yeh, H., Allred, D. C., Hu, M., Polyak, K., Rosen, J. M., Medina, D. An intraductal human-in-mouse transplantation model mimics the subtypes of ductal carcinoma in situ. Breast Cancer Research. 11, R66(2009).
- Zheng, J., Watson, A. D., Kerr, D. E. Genome-wide expression analysis of lipopolysaccharide-induced mastitis in a mouse model. Infection and Immunity. 74, 1907-1915 (2006).
- Nguyen, D., Beeman, N., Lewis, M., Schaack, J., Neville, M. C. Intraductal Injection into the Mouse Mammary Gland. Methods in Mammary Gland Biology and Breast Cancer Research. Ip, M. M., Asch, B. B. , Kluwer Academic/Plenum Publishers. 259-270 (2000).
- Lee, J. W., Paape, M. J., Zhao, X. Recombinant bovine soluble CD14 reduces severity of experimental Escherichia coli mastitis in mice. Veterinary Research. 34, 307-316 (2003).
- Elazar, S., Gonen, E., Livneh-Kol, A., Rosenshine, I., Shpigel, N. Y. Essential role of neutrophils but not mammary alveolar macrophages in a murine model of acute Escherichia coli mastitis. Veterinary Research. 41, 53(2010).
- Bannerman, D. D., Paape, M. J., Hare, W. R., Sohn, E. J. Increased levels of LPS-binding protein in bovine blood and milk following bacterial lipopolysaccharide challenge. Journal of Dairy Science. 86, 3128-3137 (2003).
- Gonen, E., Vallon-Eberhard, A., Elazar, S., Harmelin, A., Brenner, O., Rosenshine, I., Jung, S., Shpigel, N. Y. Toll-like receptor 4 is needed to restrict the invasion of Escherichia coli P4 into mammary gland epithelial cells in a murine model of acute mastitis. Cellular Microbiology. 9, 2826-2838 (2007).
- Notebaert, S., Demon, D., Vanden Berghe,, Vandenabeele, T., P,, Meyer, E. Inflammatory mediators in Escherichia coli-induced mastitis in mice. Comparative Immunology, Microbiology, and Infectious Diseases. 31, 551-565 (2008).
- Osterman, K. L., Rahm, V. A. Lactation mastitis: bacterial cultivation of breast milk symptoms, treatment, and outcome. Journal of Human Lactation. 16, 297-302 (2000).
- Sordillo, L. M., Streicher, K. L. Mammary Gland Immunity and Mastitis Susceptibility. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 7, 135-146 (2002).
- Blackwell, T. S., Yull, F. E., Chen, C. L., Venkatakrishnan, A., Blackwell, T. R., Hicks, D. J., Lancaster, L. H., Christman, J. W., Kerr, L. D. Use of genetically altered mice to investigate the role of nuclear factor-kappa B activation and cytokine gene expression in sepsis-induced ARDS. Chest. 116, 73S-74S (1999).
- Stathopoulos, G. T., Sherrill, T. P., Cheng, D. S., Scoggins, R. M., Han, W., Polosukhin, V. V., Connelly, L., Yull, F. E., Fingleton, B., Blackwell, T. S. Epithelial NF-kappaB activation promotes urethane-induced lung carcinogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104, 18514-18519 (2007).
- Blackwell, T. S., Hipps, A. N., Yamamoto, Y., Han, W., Barham, W. J., Ostrowski, M. C., Yull, F. E., Prince, L. P. NF-κB signaling in fetal lung macrophages disrupts airway morphogenesis. The Journal of Immunology. 187, 2740-2747 (2011).
- Chiang, S. H., Bazuine, M., Lumeng, C. N., Geletka, L. M., Mowers, J., White, N. M., Ma, J. T., Zhou, J., Qi, N., Westscott, D. The protein kinase IKKepsilon regulates energy balance in obese mice. Cell. 138, 961-975 (2009).
- Singh, M. V., Kapoun, A., Higgins, L., Kutschke, W., Thurman, J. M., Zhang, R., Singh, M., Yang, J., Guan, X., Lowe, J. S. Ca2+/calmodulin-dependent kinase II triggers cell membrane injury by inducing complement factor B gene expression in the mouse heart. The Journal of Clinical Investigation. 119, 986-996 (2009).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
