Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Immunohistochemische kleuring van B7-H1 (PD-L1) op paraffine ingebedde Slides van Pancreatic Darmkanker Tissue

22.6K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/4059

⸱

3 januari 2013

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1The Sidney Kimmel Comprehensive Cancer Center, The Johns Hopkins University School of Medicine, 2Department of Oncology, The Johns Hopkins University School of Medicine, 3Department of Dermatology, The Johns Hopkins University School of Medicine, 4Department of Surgery, Johns Hopkins University School of Medicine, 5The Sol Goldman Pancreatic Cancer Center, The Johns Hopkins University School of Medicine, 6Yale Cancer Center, Yale School of Medicine, 7The Skip Viragh Center for Pancreatic Cancer, The Johns Hopkins University School of Medicine, 8Department of Pathology, The Johns Hopkins University School of Medicine

In dit artikel

Samenvatting

B7-H1 (PD-L1) en de binding aan PD-1 een grote tumor geïnduceerde immunosuppressieve signaal in de tumor micro-omgeving. Een immunohistochemische kleuring techniek om de expressie en lokalisatie van B7-H1 in pancreas adenocarcinoom karakteriseren wordt hier beschreven.

Samenvatting

B7-H1/PD-L1, een lid van de B7 familie van immuun-regulerende celoppervlakte-eiwitten, speelt een belangrijke rol in de negatieve regulatie van cel-gemedieerde immuunresponsen door de interactie met de receptor, geprogrammeerde dood 1 (PD -1) 1,2. Overexpressie van B7-H1 door tumorcellen is opgemerkt in een aantal menselijke kankers, waaronder melanoom, glioblastoma en carcinomen van de long, borst, colon, eierstok en niercellen en is aangetoond dat anti-tumor T-aantasting celimmuniteit 3-8.

Onlangs heeft B7-H1 expressie door pancreatische adenocarcinoom weefsels geïdentificeerd als potentiële prognostische marker 9,10. Daarnaast is blokkade van B7-H1 in een muismodel van alvleesklierkanker blijkt een anti-tumor respons 11 produceren. Deze gegevens suggereren het belang van B7-H1 als potentieel therapeutisch doel. Anti-B7-H1 blokkade antilichamen worden dan ook getest in klinische studies voor muldere humane vaste tumoren zoals melanoom en kanker van long, colon, nier, maag en pancreas 12.

Om uiteindelijk kunnen de patiënten die baat hebben bij B7-H1 gerichte therapieën identificeren, is het essentieel om de correlatie tussen expressie en lokalisatie van B7-H1 en patiënt respons op behandeling met B7-H1 blokkade antilichamen te onderzoeken. Onderzoeken van de expressie van B7-H1 in menselijke pancreas adenocarcinoom weefsels door immunohistochemie zal een beter begrip van deze co-remmende signaalmolecuul bijdraagt ​​tot de onderdrukking van antitumor immuniteit in de tumor micro-omgeving. De anti-B7-H1 monoklonale antilichaam (kloon 5H1) ontwikkeld door Chen en medewerkers is aangetoond dat betrouwbare resultaten kleuring in cryosecties van meerdere soorten menselijke neoplastische weefsels 4,8, maar verkleuring van paraffine slides was een uitdaging tot onlangs 13-18. We hebben devweggelopen van de B7-H1 kleuringsprotocol voor paraffine ingebedde dia's van pancreas adenocarcinoom weefsels. De B7-H1 kleuringsprotocol hier beschreven produceert consistente membraneuze en cytoplasmatische kleuring van B7-H1 met weinig achtergrond.

Protocol

B7-H1/PD-L1, een lid van de B7 familie van immuun-regulerende celoppervlakte-eiwitten, speelt een belangrijke rol in de negatieve regulatie van cel-gemedieerde immuunresponsen door de interactie met de receptor, geprogrammeerde dood 1 (PD -1) 1,2. Overexpressie van B7-H1 door tumorcellen is opgemerkt in een aantal menselijke kankers, waaronder melanoom, glioblastoma en carcinomen van de long, borst, colon, eierstok en niercellen en is aangetoond dat anti-tumor T-aantasting celimmuniteit 3-8.

Onlangs heeft B7-H1 expressie door pancreatische adenocarcinoom weefsels geïdentificeerd als potentiële prognostische marker 9,10. Daarnaast is blokkade van B7-H1 in een muismodel van alvleesklierkanker blijkt een anti-tumor respons 11 produceren. Deze gegevens suggereren het belang van B7-H1 als potentieel therapeutisch doel. Anti-B7-H1 blokkade antilichamen Daarom worden getest in klinische studies voor meerdere menselijkevaste tumoren zoals melanoom en kanker van long, colon, nier, maag en pancreas 12.

Om uiteindelijk kunnen de patiënten die baat hebben bij B7-H1 gerichte therapieën identificeren, is het essentieel om de correlatie tussen expressie en lokalisatie van B7-H1 en patiënt respons op behandeling met B7-H1 blokkade antilichamen te onderzoeken. Onderzoeken van de expressie van B7-H1 in menselijke pancreas adenocarcinoom weefsels door immunohistochemie zal een beter begrip van deze co-remmende signaalmolecuul bijdraagt ​​tot de onderdrukking van antitumor immuniteit in de tumor micro-omgeving. De anti-B7-H1 monoklonale antilichaam (kloon 5H1) ontwikkeld door Chen en medewerkers is aangetoond dat betrouwbare resultaten kleuring in cryosecties van meerdere soorten menselijke neoplastische weefsels 4,8, maar verkleuring van paraffine slides was een uitdaging tot onlangs 13-18. Wij hebben de B7-H1 staining protocol voor paraffine ingebedde dia's van pancreas adenocarcinoom weefsels. De B7-H1 kleuringsprotocol hier beschreven produceert consistente membraneuze en cytoplasmatische kleuring van B7-H1 met weinig achtergrond.

1. De-parafinization

  1. Bak schuift bij 55 ° C gedurende 20 minuten.
  2. In een chemische afzuigkap, dompel slides in xyleen gedurende 10 minuten.
  3. Dompel de objectglaasjes in verse xyleen gedurende 10 minuten.
  4. Dompel de objectglaasjes in 100% ethanol gedurende 5 minuten.
  5. Dompel de objectglaasjes in vers 100% ethanol gedurende 5 minuten.
  6. Dompel de objectglaasjes in 95% ethanol gedurende 5 minuten.
  7. Dompel de objectglaasjes in 80% ethanol gedurende 5 minuten.
  8. Dompel de objectglaasjes in gedeïoniseerd water gedurende 5 minuten.

2. Antigen Retrieval

  1. Dompel de objectglaasjes in Tris-EDTA buffer (pH 9,0) en warmte in een snelkookpan 125 ° C gedurende 30 seconden, daarna 90 ° C gedurende 10 sec.
  2. Laat dia's afkoelen gedurende 60 minuten.
  3. Dompel de objectglaasjes in TBST gedurende 5 minuten; repetweemaal.

3. Kleuring

  1. Veeg oplossingen rond het weefsel op de dia's. Markeer een cirkel rond het weefsel met een hydrofobe pen.
  2. Plaats de objectglaasjes in een vochtige kamer en voorkomen het drogen van het weefsel op de dia het gehele beitsen. Plaats een druppel (ongeveer 200 ul of meer van de weefselgebied volledig bedekken) van peroxidase blok binnen het hydrofobe cirkel op de dia en incubeer slides in peroxidase blok gedurende 5 minuten.
  3. Spoel de objectglaasjes met TBST, dan plaats in TBST gedurende 5 minuten.
  4. Plaats een druppel BLOCK ACE-blokkerende buffer op elke dia en incubeer gedurende 15 minuten.
  5. Spoel de objectglaasjes met TBST, dan plaats in TBST gedurende 5 minuten.
  6. Plaats een druppel Avidin oplossing op elke dia en incubeer gedurende 15 minuten.
  7. Spoel de objectglaasjes met TBST, dan plaats in TBST gedurende 5 minuten.
  8. Plaats een druppel biotine oplossing op elke dia en incubeer gedurende 15 minuten.
  9. Spoel slides met TBST en vervolgens in TBST gedurende 5 minuten.
  10. Incubeer slides met 1:1000 verdunning van muis-anti-B7-H1 monoklonale antilichaam (kloon 5H1) of een muis IgG1 κ isotype control in 200 ul TBST bij 4 ° C overnacht gedurende 22 uur + / - 1 uur. De uiteindelijke antilichaamconcentratie in TBST is 2,57 ug / ml.
  11. Spoel de objectglaasjes met TBST, dan plaats in TBST gedurende 5 minuten. Tweemaal herhalen.
  12. Incubeer slides met biotine geconjugeerd rat anti-muis secundair IgG1 antilichaam bij een concentratie 1:500 (in 200 pi 2% geitenserum oplossing) gedurende 30 minuten.
  13. Spoel de objectglaasjes met TBST, dan plaats in TBST gedurende 5 minuten. Tweemaal herhalen.
  14. Plaats een druppel streptavidine-biotine complex (moeten ten minste 30 minuten vóór gebruik) voor elke dia en incubeer gedurende 15 minuten.
  15. Spoel de objectglaasjes met TBST, dan plaats in TBST gedurende 5 minuten. Tweemaal herhalen.
  16. Plaats een druppel Amplification Reagent (verdund 2:1 met TBST) op elke dia en incubeer gedurende 4 min.
  17. Spoel de objectglaasjes met TBST vervolgens in TBST gedurende 5 minuten. Tweemaal herhalen.
  18. Plaats een druppel streptavidine-HRP op elke dia en incubeer gedurende 15 minuten.
  19. Spoel de objectglaasjes met TBST, dan plaats in TBST gedurende 5 minuten. Tweemaal herhalen.
  20. Plaats een druppel van 3,3-diaminobenzidine (DAB) chromogeen substraat en voor elke dia en de kleurreactie gedurende 2 minuten.
  21. Onmiddellijk na de kleurontwikkeling, wassen dia's met ddH 2 O voor 1-2 minuten.
  22. Incubeer dia's met een druppel hematoxyline gedurende 90 sec.
  23. Wassen met ddH 2 O voor 1-2 minuten.
  24. Wassen met zeep kraanwater voor 1-2 minuten.
  25. Wassen met ddH 2 O voor 1-2 minuten.

4. Uitdroging en montage

  1. Dompel de slides in 80% ethanol gedurende 3 minuten.
  2. Dompel de slides in 95% ethanol gedurende 3 minuten.
  3. Dompel de glaasjes in 100% ethanol gedurende 5 minuten. Herhalen.
  4. Dompel de objectglaasjes in xyleen gedurende 5 minuten. Herhalen.
  5. Een druppelCytoseal 60 tot de dia en plaats het dekglaasje.

Tabel 1 vermeldt de reagentia gebruikt in de hierboven beschreven procedures.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Een succesvolle immunohistochemische kleuring van B7-H1 demonstreren de heterogene expressie van B7-H1 (bruin signalen DAB kleurontwikkeling) in de pancreas adenocarcinoom. Sommige pancreas adenocarcinoom cellen voornamelijk membraneuze expressie van B7-H1 (Figuur 1A) terwijl anderen ofwel overwegend cytoplasmatische expressie van B7-H1 of weinig expressie van B7-H1 (figuren 2 en 3). Normale alvleesklierductuscellen epithelium expressie weinig B7-H1 (figuur 4). Kleuren ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Immunohistochemische kleuring van B7-H1 op cryocoupes gerapporteerd in eerdere studies voor verschillende kankers 3,4. Echter, klinische tumormonsters meestal zijn alleen beschikbaar in de vorm van in paraffine ingebedde blokken. Het monoklonale antilichaam 5H1 is onlangs succesvol toegepast bij de kleuring van paraffine ingebed tumorweefsel zoals niercelcarcinoom, baarmoederhalskanker, blaaskanker en melanoom 13-18. B7-H1 kleuring op paraffine ingebedde 9,19 of 20 cryostat se...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

Geen belangenconflicten verklaard.

Dankbetuigingen

EB, KMB, en HX dragen in gelijke mate. Dit onderzoek werd ondersteund door de NCI SPORE in Gastro Intestinale Tumoren P50 CA062924, NIH K23 CA148964, Lustgarten Foundation, Viragh Foundation, ASCO Young Investigator Award, NIH 5T32 CA0090701-28 Training Grant, Sol Goldman Pancreatic Cancer Center en National Pancreas Foundation.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Naam van het reagens Vennootschap Catalogusnummer Reacties
CSA-systeem Dako K1500 Inclusief de volgende reagentia die in het protocol: peroxidase block, streptavidine-biotine complex, sterkingsreagens, streptavidine-HRP, en DAB substraat en chromogeen
Avidine / biotine Blocking Kit Vector SP-2001
Blokkeren ACE Serotec BUF029
Biotine anti-muis IgG1 BD 553441
Muis IgG1 K isotypecontrole eBioscience 14-4714-85
TBS (Tris-gebufferde zoutoplossing), 10X Cellgro 46-012 CM- 10xTBS bevat 80 g / L NaCl en 24,2 g / L Tirs;
Verdund tot 1X met ddH2O voor wasbeurten;
Tween 20 Sigma-Aldrich P1379 1 ml toegevoegd aan 1 L 1X TBS te maken TBST
Target Retrieval, 20x Celerus Wave 014-3000-000 Verdund tot 1x met ddH 2 O
190 Proof Ethyl Alcohol Pharmco-Aaper 111000190
200 Proof Ethyl Alcohol PHARMO-Aaper 111000200
Xyleen VWR 95057-827
Hematoxylin Richard-Allan Wetenschappelijke 72804
Cytoseal 60 Richard-Allan Wetenschappelijke 8,310-4
Dekglaasjes Corning 2940-245
Bevochtigingskamer Sigma H6644
Tabel 1. Reagentia en apparatuur.

Referenties

  1. Flies, D. B., Chen, L. The new B7s: playing a pivotal role in tumor immunity. J. Immunother. 30, 251-260 (2007).
  2. Dong, H., Zhu, G., Tamada, K., Chen, L. B7-H1, a third member of the B7 family, co-stimulates T-cell proliferation and interleukin-10 secretion. Nat. Med. 5, 1365-1369 (1999).
  3. Curiel, T. J., Wei, S., Dong, H., Alvarez, X., Cheng, P., Mottram, P., Krzysiek, R., Knutson, K. L., et al. Blockade of B7-H1 improves myeloid dendritic cell-mediated antitumor immunity. Nat. Med. 9, 562-567 (2003).
  4. Dong, H., Strome, S. E., Salomao, D. R., Tamura, H., Hirano, F., Flies, D. B., Roche, P. C., Lu, J., Zhu, G. Tumor-associated B7-H1 promotes T-cell apoptosis: a potential mechanism of immune evasion. Nat. Med. 8, 793-800 (2002).
  5. Dong, H., Chen, L. B7-H1 pathway and its role in the evasion of tumor immunity. J. Mol. Med. (Berl). 81, 281-287 (2003).
  6. Strome, S. E., Dong, H., Tamura, H., Voss, S. G., Flies, D. B., Tamada, K., Salomao, D., Cheville, J., Hirano, F., Lin, W., Kasperbauer, J. L., Ballman, K. V., Chen, L. B7-H1 blockade augments adoptive T-cell immunotherapy for squamous cell carcinoma. Cancer Res. 63, 6501-6505 (2003).
  7. Hirano, F., Kaneko, K., Tamura, H., Dong, H., Wang, S., Ichikawa, M., Rietz, C., Flies, D. B., Lau, J. S., Zhu, G., Tamada, K., Chen, L. Blockade of B7-H1 and PD-1 by monoclonal antibodies potentiates cancer therapeutic immunity. Cancer Res. 65, 1089-1096 (2005).
  8. Thompson, R. H., Gillett, M. D., Cheville, J. C., Lohse, C. M., Dong, H., Webster, W. S., Krejci, K. G., Lobo, J. R., Sengupta, S., Chen, L., Zincke, H., Blute, M. L., Strome, S. E., Leibovich, B. C., Kwon, E. D. Costimulatory B7-H1 in renal cell carcinoma patients: Indicator of tumor aggressiveness and potential therapeutic target. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 17174-17179 (2004).
  9. Geng, L., Huang, D., Liu, J., Qian, Y., Deng, J., Li, D., Hu, Z., Zhang, J., Jiang, G., Zheng, S. B7-H1 up-regulated expression in human pancreatic carcinoma tissue associates with tumor progression. J. Cancer Res. Clin. Oncol. 134, 1021-1027 (2008).
  10. Loos, M., Giese, N. A., Kleeff, J., Giese, T., Gaida, M. M., Bergmann, F., Laschinger, M., WB, M., Friess, H. Clinical significance and regulation of the costimulatory molecule B7-H1 in pancreatic cancer. Cancer Lett. 268, 98-109 (2008).
  11. Okudaira, K., Hokari, R., Tsuzuki, Y., Okada, Y., Komoto, S., Watanabe, C., Kurihara, C., Kawaguchi, A., Nagao, S., Azuma, M., Yagita, H., Miura, S. Blockade of B7-H1 or B7-DC induces an anti-tumor effect in a mouse pancreatic cancer model. Int. J. Oncol. 35, 741-749 (2009).
  12. Wang, S., Chen, L. Immunobiology of cancer therapies targeting CD137 and B7-H1/PD-1 cosignal pathways. Curr. Top Microbiol. Immunol. 344, 245-267 (2011).
  13. Thompson, R. H., Webster, W. S., Cheville, J. C., Lohse, C. M., Dong, H., Leibovich, B. C., Kuntz, S. M., Sengupta, S., Kwon, E. D., Blute, M. L. B7-H1 glycoprotein blockade: a novel strategy to enhance immunotherapy in patients with renal cell carcinoma. Urology. 66, 10-14 (2005).
  14. Thompson, R. H., Kuntz, S. M., Leibovich, B. C., Dong, H., Lohse, C. M., Webster, W. S., Sengupta, S., Frank, I., Parker, A. S., Zincke, H., Blute, M. L., Sebo, T. J., Cheville, J. C., Kwon, E. D. Tumor B7-H1 is associated with poor prognosis in renal cell carcinoma patients with long-term follow-up. Cancer Res. 66, 3381-3385 (2006).
  15. Thompson, R. H., Dong, H., Kwon, E. D. Implications of B7-H1 expression in clear cell carcinoma of the kidney for prognostication and therapy. Clin. Cancer Res. 13, 709s-715s (2007).
  16. Karim, R., Jordanova, E. S., Piersma, S. J., Kenter, G. G., Chen, L., Boer, J. M., Melief, C. J., vander Burg, S. H. Tumor-expressed B7-H1 and B7-DC in relation to PD-1+ T-cell infiltration and survival of patients with cervical carcinoma. Clin. Cancer Res. 15, 6341-6347 (2009).
  17. Inman, B. A., Sebo, T. J., Frigola, X., Dong, H., Bergstralh, E. J., Frank, I., Fradet, Y., Lacombe, L., Kwon, E. D. PD-L1 (B7-H1) expression by urothelial carcinoma of the bladder and BCG-induced granulomata: associations with localized stage progression. Cancer. 109, 1499-1505 (2007).
  18. Brahmer, J. R., Drake, C. G., Wollner, I., Powderly, J. D., Picus, J., Sharfman, W. H., Stankevich, E., Pons, A., Salay, T. M., McMiller, T. L., Gilson, M. M., Wang, C., Selby, M., Taube, J. M., Anders, R., Chen, L., Korman, A. J., Pardoll, D. M., Lowy, I., Topalian, S. L. Phase I study of single-agent anti-programmed death-1 (MDX-1106) in refractory solid tumors: safety, clinical activity, pharmacodynamics, and immunologic correlates. J. Clin. Oncol. 28, 3167-3175 (2010).
  19. Wang, L., Ma, Q., Chen, X., Guo, K., Li, J., Zhang, M. Clinical significance of B7-H1 and B7-1 expressions in pancreatic carcinoma. World J. Surg. 34, 1059-1065 (2010).
  20. Nomi, T., Sho, M., Akahori, T., Hamada, K., Kubo, A., Kanehiro, H., Nakamura, S., Enomoto, K., Yagita, H., Azuma, M., Nakajima, Y. Clinical significance and therapeutic potential of the programmed death-1 ligand/programmed death-1 pathway in human pancreatic cancer. Clin. Cancer Res. 13, 2151-2157 (2007).
  21. Taube, J. M., Anders, R. A., Young, G. D., Xu, H., Sharma, R., McMiller, T. L., Chen, S., Klein, A. P., Pardoll, D. M., Topalian, S. L., Chen, L. Colocalization of inflammatory response with B7-h1 expression in human melanocytic lesions supports an adaptive resistance mechanism of immune escape. Sci. Transl. Med. 4, 127ra37(2012).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Antigeen retrievalDAB kleurontwikkelingantilichaamskleuringweefseldehydratatiemicroscopie analysesignaalversterking
Immunohistochemische kleuring van B7-H1 (PD-L1) op paraffine ingebedde Slides van Pancreatic Darmkanker Tissue
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.