Microglia zijn gevestigd macrofagen dat de eerste lijn van verdediging en het immuunsysteem de bewaking van het centrale zenuwstelsel te bieden. MicroRNA zijn moleculen die een belangrijke rol spelen in tal van fysiologische processen, zoals activatie en differentiatie van macrofagen. In dit artikel beschrijven we de methode voor het meten van microRNA's in de microglia.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Detectie van microRNA's in Microglia door Real-time PCR in Normal CNS en tijdens ontstekingsprocessen
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Microglia cellen van de myeloïde afstamming die zich in het centrale zenuwstelsel (CNS) 1. Deze cellen spelen een belangrijke rol in de pathologie van de vele ziekten die samenhangen met neuroinflammatie zoals multiple sclerose (MS) 2. Microglia in een normale CNS te uiten macrofaag marker CD11b en vertonen een rust-fenotype met het uitspreken van een laag niveau van activatie markers zoals CD45. Tijdens de pathologische gebeurtenissen in het CZS, microglia geactiveerd zoals bepaald worden door verhoogde expressie van CD45 en andere markers 3. De factoren die microglia fenotype en functies in het centraal zenuwstelsel aantasten zijn niet goed onderzocht. MicroRNA (miRNAs) zijn een groeiende familie van geconserveerde moleculen (~ 22 nucleotiden lang) die betrokken zijn bij veel normale fysiologische processen, zoals celgroei en-differentiatie 4 en aandoeningen zoals ontsteking 5. MiRNAs downregulate de expressie van bepaalde genen door binding complementaire sequenties van deir. mRNA's en spelen een belangrijke rol in de activering van aangeboren immuunsysteem cellen waaronder macrofagen 6 en microglia 7. Om te onderzoeken miRNA gemedieerde paden die de microgliale fenotype, biologische functie te definiëren, en om microglia te onderscheiden van andere vormen van macrofagen, is het belangrijk om kwantitatief beoordelen van de expressie van bepaalde microRNA's in verschillende subsets van CNS-ingezeten microglia. Gemeenschappelijke methoden voor het meten van de expressie van miRNAs in het centraal zenuwstelsel zijn onder andere kwantitatieve PCR uit hele neuronaal weefsel en in situ hybridisatie. Echter, kwantitatieve PCR van hele weefsel homogenaat niet wordt het mogelijk de expressie van miRNA in microglia die slechts 5-15% van de cellen van neuronale weefsel vormen. Hybridisatie in situ laat de evaluatie van de expressie van microRNA in specifieke celtypen in weefselcoupes, maar deze methode is niet geheel kwantitatief. In dit rapport beschrijven we een kwantitatieve en senstieve methode voor de detectie van miRNA door real-time PCR in microglia geïsoleerd van normale CNS of tijdens neuroinflammatie met behulp van experimentele auto-immune encephalomyelitis (EAE), een muismodel voor MS. De beschreven methode zal nuttig zijn om het niveau van expressie van microRNA's in microglia in normale CNS of tijdens neuroinflammatie in verband met diverse aandoeningen zoals MS, beroerte, traumatisch letsel, de ziekte van Alzheimer en hersentumoren te meten.
Protocol
1. Isolatie van Microglia van Normaal CNS
Isolatie van microglia uitgevoerd zoals eerder beschreven wijzigingen 3.
- Bereid instrumenten voor dissectie en perfusie: schaar, pincet, 10 ml spuit met 27g naald, 15 ml Dounce homogenisator (Teflon / glas), 40 micrometer nylon cel zeef, 40% en 70% Percoll oplossingen, 1X PBS.
- Euthanaseren muizen door middel van snelle stikken (ontheffing van zuurstof) de CO 2-camera en direct overbrengen naar laboratoriumtafel voor chirurgische manipulaties en perfusie.
- Voer chirurgische manipulaties (scharen en pincetten en 70% ethanol als ontsmettingsmiddel):....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Onlangs grote belangstelling werd gegeven aan microglia en de betrokkenheid van deze cellen in een groot aantal pathologieën geassocieerd met neuroinflammatie en neurodegeneratie. Daarnaast is de rol van microRNA's in de differentiatie van immuun-en kankercellen sterk gegroeid de afgelopen jaren 5,10. We hebben recent de rol van miR-124 in het onderhoud van niet-geactiveerde of rust-fenotype van microglia in normale CNS 7, maar de rol van de andere soorten van microRNA's in de microglia fen.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Geen belangenconflicten verklaard.
Dankbetuigingen
Het werk werd ondersteund door de NIH R01 NS071039-01A1 onderzoek te verlenen.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Naam van het serum | Vennootschap | Catalogusnummer | Reacties |
| 1X PBS | GIBCO | 14190 | Kunnen worden bereid uit droge componenten in het laboratorium, pH: 7,2-7,4 |
| 10X PBS | Thermo Scientific | SH30258.02 | Kunnen worden bereid uit droge componenten in het laboratorium, pH: 7,2-7,4 |
| DMEM; FBS | GBCO | 11965; 10438 | |
| Mirvana kit | Invitrogen | AM1561 | |
| Percoll | Sigma | P4937-500 ml | 100 ml van 100% Percoll wordt bereid door 10 ml 10X PBS en 90 ml Percoll van Sigma. 50 ml 70% Percoll isbereid door 35 ml van 100% Percoll en 15 ml DMEM 50 ml 40% Percoll wordt bereid door 20 ml van 100% Percoll en 30 ml PBS 1X |
| MOG 35-55 peptide | AnaSpec Inc | 60130-5 | |
| CFA | Difco | 263810 | |
| Pertussistoxine | Sigma | P7208 | |
| FcR blokkerende antilichamen | BD Biosciences | 553142 | Clone 2.4G2 |
| Anti-CD11b - PE mAb | BD Biosciences | 553311 | Kan gebruikt worden met verschillende fluoroforen (bijv. AF488) |
| Anti-CD45-APC-Cy7 mAb's | Biolegend | 103116 | Kan gebruikt worden met verschillende fluoroforen (bv. APC) |
| Paraformaldehyde (16%) | EMS Inc | 15710 | Verdun 1:15 in PBS 1X |
| 15% TBE-Urea Gel | Life Technologies Inc | EC68855BOX | |
| TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit | Life Technologies Inc | 4366596 | |
| TaqMan Universal PCR Master Mix | Life Technologies Inc | 4304437 | |
| TaqMan MicroRNA Testen MMU-miR-124a | Life Technologies Inc | 4427975 ID 001182 | |
| TaqMan MicroRNA Testen snoRNA-55 | Life Technologies Inc | 4427975 ID 001228 | |
| Nuclease-vrij water | Life Technologies Inc | AM9937 | Nuclease-vrij water |
| 384-wells duidelijke optische reactieplaat | Life Technologies Inc | 4309849 | Kan worden gesubstitueerd met andere platen (bijv. 96 wei-plaat) in verschillende real-time PCR instrumenten |
| Dounce homogenisator (15 ml) | Wheaton Science Products. | 358044 | Teflon / glas |
| 40 μ nylon cel zeef | Valk | 352340 | |
| Big centrifuge | Sorval | RT 6000B | Rotor diameter 18,5 cm |
| Kleine centrifuge | Eppendorf | 5415 R | Rotor diameter 6,5 cm |
| Real-time PCR-instrument | Life Technologies Inc | AB 7900 HT | Kan worden gesubstitueerd met andere instrumenten |
| Flowcytometer | BD Biosciencess | LSR II | Kan worden gesubstitueerd met andere instrumenten |
| FACS | BD Biosciences | FACSAria | Kan worden gesubstitueerd met andere instrumenten |
| NanoDrop spectrofotometer | Thermo Scientific | NanoDrop 1000 |
Referenties
- Tremblay, M. E. The Role of Microglia in the Healthy Brain. J. Neurosci. 31, 16064-16069 (2011).
- Graeber, M. B., Li, W., Rodriguez, M. L. Role of microglia in CNS inflammation. FEBS Lett. , (2011).
- Ponomarev, E. D., Shriver, L. P., Maresz, K., Dittel, B. N.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
