We beschrijven een werkwijze voor de affiniteit-gemerkte zuivering van recombinante eiwitten met vloeistof handling robotica. Deze methode is algemeen toepasbaar op de kleinschalige zuivering van oplosbare His-gemerkte eiwitten in een high-throughput format.
Methodenartikel
High-throughput Zuivering van Affinity gemerkte recombinante eiwitten
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
X-ray kristallografie is de voorkeursmethode voor het verkrijgen van een gedetailleerde weergave van de structuur van eiwitten. Dergelijke studies dienen te worden aangevuld met verdere biochemische analyses om gedetailleerd inzicht te krijgen in de structuur / functie relaties. Advances in oligonucleotide en gensynthese technologie grootschalige mutagenese strategieën steeds mogelijk, zoals de vervanging van doelresiduen door alle 19 andere aminozuren. Winst-of verlies-van-functie fenotype laat dan systematisch conclusies, zoals de bijdrage van bepaalde residuen de katalytische activiteit, eiwitstabiliteit en / of eiwit-eiwit interactie specificiteit.
Om de verschillende fenotypes toeschrijven aan de aard van de mutatie - plaats van wisselende proefomstandigheden - het noodzakelijk is om de eiwitten te zuiveren en te analyseren in een gecontroleerde en reproduceerbare wijze. High-throughput strategieën en de automatisering van handmatige protocollen oprobot vloeistof-handling platforms hebben mogelijkheden om een dergelijke complexe moleculaire biologische procedures met weinig menselijke tussenkomst en minimale foutenpercentages 1 tot 5 uit te voeren.
Hier geven we een algemene methode voor de zuivering van His-gelabeld recombinant eiwitten in een high-throughput manier. In een recente studie werd deze methode toegepast op een gedetailleerde structuur-functie onderzoek TFIIB, een component van het basale transcriptiemechanisme. TFIIB is onmisbaar voor promoter-gerichte in vitro transcriptie en is essentieel voor de rekrutering van RNA polymerase in een preinitiation complex 6-8. TFIIB bevat een flexibele linker domein dat de actieve plaats kloof van RNA polymerase 9-11 doordringt. Deze linker domein geeft twee biochemisch kwantificeerbare activiteiten TFIIB, namelijk (i) het stimuleren van de katalytische activiteit tijdens de "mislukte" fase van transcript initiatie en (ii) een extra bijdrage aan despecifieke werving van RNA-polymerase in de preinitiation complex 4,5,12. We gebruik gemaakt van de high-throughput zuiveringswerkwijze om enkele, dubbele en drievoudige substitutie en deleties mutaties genereren in de TFIIB linker en vervolgens te analyseren in functionele assays voor hun stimulerende werking op de katalytische activiteit van RNA polymerase 4. In totaal hebben we gegenereerd, gezuiverd en geanalyseerd 381 mutanten - een taak die zijn tijdrovend en arbeidsintensief om handmatig. Wij produceerden en de eiwitten getest in multiplicates die ons toeliet om een experimentele variaties waarderen en gaf ons een duidelijk beeld van de reproduceerbaarheid van de resultaten.
Deze methode als een algemeen protocol voor het zuiveren van His-gemerkte eiwitten en is met succes gebruikt om andere recombinante eiwitten te zuiveren. Het is geoptimaliseerd voor de zuivering van 24 eiwitten, maar kan worden aangepast om te zuiveren tot 96 eiwitten.
Protocol
DEEL A: High-throughput groei van bacteriekweken.
1. Overnachting groeien bacteriën op in 2 ml Zelfinductie Medium Met behulp van 24-well platen
- Steriliseer de 24-well platen met magnetron.
- Inoculeer 1,5 ml van auto-inductie medium (Overnight Express Medium) met vers gekweekte bacteriële kolonies of bevroren glycerol voorraden. We normaal enten drie putjes per mutant met drie individuele kolonies gekloneerd. Reserve zes putten voor positieve en negatieve controles. Voor de positieve controles we groeien drie wildtype klonen en de negatieve controles we opgroeien 2 klonen die zijn getransformeerd met niet-expressie plasmide. Controleer op voldoende sterilisatie van de plaat door het verlaten van een put leeg voor de middellange-only controle.
- Groeien de cellen gedurende 18 uur bij 37 ° C en schudden bij 250 rpm. Wij gebruiken lac-induceerbare BL21 (DE3) Rosetta 2 cellen. Auto-inductie medium bevat een mengsel van glucose en lactose. De bacteriën aanvankelijkvoeden glucose en dan beginnen lactose, die ook induceert de expressie van de recombinant eiwitten gebruikt.
- Verwijder het deksel en plaats de plaat op de robot-platform.
DEEL B: Robotic zuivering van recombinante eiwitten.
2. Bereid de Robotic Platform
Vul de wasbuffer bestaande uit 20 mM imidazool, 0,1% Triton X-100, 0,5 M NaCl, 20 mM Tris-acetaat, pH 7,9, 10 mM MgOAc 2, 0,7 mM ZnOAc 2, 10% glycerol en de elutiebuffer bestaande van 0,5 M imidazool, 0,1% Triton X-100, 0,5 M NaCl, 20 mM Tris-acetaat, pH 7,9, 10 mM MgOAc 2, 0,7 mM ZnOAc 2, 10% glycerol. Deze buffers worden gebruikt om de korrels wassen na het gemerkte eiwitten zijn gebonden aan hen of de eiwitten elueren van de bolletjes respectievelijk.
- Vul de bacteriële verdunningsmiddel (100 ml gedestilleerd water met 15 pi antischuim reagens). Deze oplossing wordt gebruiktverdunningen van de bacteriële culturen overnacht optische dichtheid (A600) metingen. De aanwezigheid van het verdunningsmiddel antischuim in de vorming van luchtbellen die zou interfereren met de plaatlezer metingen.
- Make-up de lysis oplossing bestaande uit 10x Fastbreak reagens, 2 pl lysonase per monster en 15 mM MgOAc 2. Fastbreak bevat een mix van detergentia en zouten die de celwand afbreken en vergemakkelijken de afgifte van intracellulaire eiwitten. Lysonase is een eigen mix van lysozym en een nuclease. Lysozym helpt bij het verstoren van de celwand en de nuclease verteert het model bacteriële nucleïnezuren.
- Optioneel: Maak een 6 M guanidine hydrochloride-oplossing. Sommige recombinante eiwitten hebben de neiging vast te houden aan de Teflon-coating pipetteren naalden. De guanidine hydrochloride-oplossing denatureert eiwitten en wast ze af effectiever dan water die routinematig wordt aan de wasbare robot pipetteren tips spoel gebruikt na iedere step.
- Bereid de BCA (bicinchoninic zuur) eiwit kwantificatie reagens door mengen bicinchoninic zuuroplossing (reagens A) en de kopersulfaatoplossing (reagens B): peptidebindingen Cu 2 + verminderen van de CuSO 4 component in de BCA reagens Cu 1 + waarbij de hoeveelheid Cu 1 + evenredig is met het aantal peptidebindingen in de oplossing. In een tweede stap twee moleculen bicinchoninic zure chelaat Cu 1 + resulteert in een verschuiving absorptie tot 562 nm, resulterend in een paarse kleur. De kleurreactie is tijdsafhankelijk en meestal moet een aantal uren als definitief. Daarna wordt de kleur is stabiel gedurende enkele uren.
- Vul troggen en platen van de juiste maat en plaats ze in hun pre-toegewezen posities op de robot-platform.
- Plaats een 24-well plaat voor de guanidine hydrochloride afval, twee duidelijke 96-well platen voor OD 600 en absorptiemetingen en een blauwe 96-well plaat voor the gezuiverde eiwitten op hun posities op het platform. Plaats een 96-deepwell plaat op de magnetische voet.
- Verdun MagneHis Ni-deeltjes die eiwitten binden door het vormen van chelaten met de His-tags 5-voudig in gedestilleerd water en vul deze in de kraal-unit roeren. Zet de roerder op de kralen in suspensie te houden.
- Schakel de robot platform en spoel het pipetteren naalden gedurende enkele minuten om luchtbellen die anders zouden interfereren met de pipetteren nauwkeurigheid te verwijderen. De herbruikbare pipetteren naalden gespoeld tussen individuele pipetteerstappen. Alternatief zou wegwerptips worden gebruikt. Alle volgende stappen worden uitgevoerd robot. De robot protocol is op aanvraag beschikbaar.
3. Celgroei wordt gecontroleerd door het meten van de OD600
- 10 pi overnacht kweek wordt verdund in 90 pi verdunningsmiddel oplossing.
- Meet de OD 600 zodat de bacteriën gekweekt in vergelijkbare dichtheden(Figuur 1).
4. De cellen worden opengebroken om de eiwitten los en om Bead-bindende
- 100 pl van magnetische Ni-bead suspensie verdeeld in elk putje van een tweede plaat met 24 putjes.
- 900 pl van elke kleinschalige bacteriekweek wordt omgezet in een 24-wells plaat met de korrels. Voeg 100 ul van de 10x Fastbreak / lysonase mix.
- De plaat met 24 putjes overgebracht naar het schudplatform voor snelle schudden (800 rpm) gedurende 30 min bij kamertemperatuur. Celwand worden verstoord door een combinatie van mechanische krachten en chemische werking en het recombinant geproduceerde eiwitten vrij in oplossing. Met hun affiniteitsmerkers ze onmiddellijk binden de paramagnetische chelerende nikkel kralen.
5. De parels worden gewassen
- De cel-lysaten met de geresuspendeerde magnetische korrels worden overgebracht naar een 96-deepwell plaat die is geplaatst op een frame met magnetic staven die glijden tussen de putten. De 96-well platen hebben een vierkante kegelvormige bodem die gemakkelijker verwijdering van het supernatant maakt. De uitsparingen kunnen houden volumes tot 2,1 ml maar gevuld met veel kleinere volumes. Dit stelt ons in staat om krachtig schudden stappen zonder monster kruisbesmetting te voeren door spatten.
- De pipetpunten werden gewassen tussen individuele pipetteerstappen met 6 M guanidine-HCl. Deze stap is cruciaal voor de zuivering van TFIIB en andere "sticky" eiwitten om kruisbesmetting te voorkomen. Met andere eiwitten kan het voldoende uitvoerig spoelen met water naalden tussen de pipetteerstappen.
- De magnetische staven van het magnetische stand trekken paramagnetische deeltjes, trekken ze weg van het midden van de putten en laat het pipetteren naalden vrije toegang tot de supernatant. De supernatant wordt verwijderd.
- 500 ui wasbuffer eerst toegevoegd aan de 24-well plaat en vervolgens overgebracht naar de 96-well plaat eNSure de volledige overdracht van de korrels. De 24-well plaat uit de shaker.
- Een 500 ui wasbuffer wordt rechtstreeks toegevoegd aan de 96-well plaat, wordt de plaat naar de shaker en krachtig geschud gedurende 1 minuut. De plaat wordt verplaatst naar de magnetische standaard en de wasbuffer verwijderd.
- Deze stap wordt tweemaal herhaald en de wasprocedure is voltooid door eventuele buffer resten van de plaat.
6. Elueer het Eiwitten in Elution Buffer
- 100 ul elutiebuffer toegevoegd aan de korrels, wordt de plaat naar de shaker en krachtig geschud gedurende 30 min bij kamertemperatuur.
- De plaat wordt verplaatst naar de schudder en het eluaat met het gezuiverde recombinante eiwit wordt overgebracht naar een nieuwe plaat.
7. De concentraties van de gezuiverde eiwitten
- 190 pi van BCA reagens mengsel overgebracht naar een duidelijke 96-well plaat en 10 ul van het proeiwit-oplossing toegevoegd.
- Na enkele uren incubatie (gewoonlijk 5-6 of overnacht), meet de absorptie en vergelijken met BSA standaarden de concentraties van elk van de gezuiverde eiwitpreparaten (figuur 2) bepalen.
- De gezuiverde eiwitten kunnen nu worden gebruikt voor verdere toepassingen de geschikte concentraties (Figuur 3).
8. Representatieve resultaten
De zuivering protocol biedt twee kwaliteitscontrole fasen, waarvan voorbeelden worden getoond. We kunnen identificeren en mogelijke problemen op het bacteriële document groeistadium (figuur 1) en later bij het beoordelen van de opbrengsten van de gezuiverde eiwitten (Figuur 2). We meestal zuiveren eiwitten en test ze in drievoud. Dit, in combinatie met de twee stappen van kwaliteitscontrole, geeft ons vertrouwen dat alle variaties we waargenomen in onze functionele assays zijn het gevolg van de mutant phenotype (figuur 3) en niet veroorzaakt door experimentele variaties of mislukte zuivering. De opbrengsten bedraagt gewoonlijk 50 tot 200 pg en meer dan voldoende voor verschillende functionele bepalingen.
Figuur 1. Histogram van de OD metingen van een plaat met 24 putjes met Overnachtkweken. Drie klonen zes TFIIB mutante varianten alsmede het wildtype TFIIB zijn geteeld. Twee klonen die niet tot expressie plasmide en een goed met medium alleen als negatieve controles. De OD metingen tonen aan dat er kleine variaties in de groei tussen de afzonderlijke culturen.
Figuur 2. Eiwitopbrengsten verkregen uit deze culturen zoals bepaald door een BCA assay en bevestigd door SDS PAGE. Een van de varianten niet tot expressie op een hoog niveau. In comcombinatie met figuur 1, kunnen we concluderen dat dit niet te wijten aan differentiële celgroei, maar als gevolg van eiwitexpressie niet goed geïnduceerd.
Figuur 3. Representatief resultaat van een transcriptie assay. We hebben de stimulering activiteit van TFIIB varianten op de productie van kleine mislukte transcripten door RNAP. Hier worden de stimulatie-effecten van een volledige bibliotheek van enkelvoudige aminozuursubstituties van TFIIB residu K87 getoond. De hoge mate van reproduceerbaarheid wordt bevestigd door kleine fouten. Een monster gel die de resultaten van drie mutanten vergeleken met wildtype (wt), negatieve controles (NC) en elutiebuffer betreft alleen afgebeeld eronder.
Discussie
De geautomatiseerde recombinant eiwit zuiveringswerkwijze hier beschreven maakt de productie en zuivering van een groot aantal mutante eiwitten in een kleinschalig format onder zeer reproduceerbare omstandigheden met minimale menselijke tussenkomst. Figuren 1 en 2 tonen de resultaten van systematische kwaliteit controles en voorbeelden van de gezuiverde eiwitten. Figuur 3 toont dat de gezuiverde transcriptiefactoren in dit voorbeeld uitvoeren in een zeer reproduceerbare wijze in functionele testen.
Hoewel de procedure ontwikkeld voor de zuivering van archaeale TFIIB is breed toepasbaar voor de zuivering van affiniteit-gemerkte eiwitten. Het gebruik van dergelijke geautomatiseerde protocollen zuivering zal dus aanzienlijk vergemakkelijken biochemische analyse van recombinante eiwitten en aldus verder ons begrip van eiwit-eiwit interacties op een schaal die moeilijk handmatig bereiken.
Openbaarmakingen
Geen belangenconflicten verklaard.
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund door een Wellcome Project Grant (078043/Z/05/Z) naar ROJW
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Naam van het reagens | Vennootschap | Catalogusnummer | Opmerkingen (optioneel) |
| Overnight Express Instant TB Medium | Merck KGaA | 71.491-4 | |
| Fastbreak | Promega Ltd | V8573 | |
| Lysonase Bioprocessing Reagens / 1 ml | Merck KGaA | 71230 | |
| Antifoam 204 | Sigma-Aldrich Company Ltd | A6426 | |
| MagneHis Ni-deeltjes | Promega | V8565 | |
| Imidazool | Sigma-Aldrich Company Ltd | 56750 | |
| Trizma basis | Sigma-Aldrich Compelke Ltd | 93362 | |
| NaCl | VWR | 27810.295 | |
| Bicinchoninic Acid eiwitbepaling | Sigma-Aldrich Company Ltd | BCA1-1KT | |
| Deep Well Plate 2,2 ml Vierkante Wells PP PK10 | Anachem Ltd | 1810-00 | |
| Microplate MicroWell 96 well platte bodem polystyreen niet behandeld 12 hulzen van 5 platen helder 0,4 ml en het volume 128 mm x 86 mm Thermo Scientific Nunc | Fisher Scientific Ltd | DIS-984-090M | |
| Microplate Blauw | VWR | NUNC367001 | |
| 24-Well Blokken RB (24) | Qiagen | 19583 | |
| Guanidinehydrochloride | VWR | ALFAA13543.0B | |
| Wasbaar naald voor TheOnyx | Aviso GmbH | 8152-317001 | |
| Reagens Rack voor Magnetic Beads | Aviso GmbH | 8152-035003 | |
| Plate Reader Synergy HT | BioTek | 4200-000043 | |
| Robotic Platform TheOnyx 44OH/150/100 | Aviso GmbH | 8145-050046 | |
| Microplate Shaker Variomag Teleshaker | Inheco | 3800047 | |
| 96-well Magneet Type A | Qiagen | 36915 |
Referenties
- Weinzierl, R. O. The nucleotide addition cycle of RNA polymerase is controlled by two molecular hinges in the Bridge Helix domain. BMC Biol. 8, 1741-7007 (2010).
- Nottebaum, S., Tan, L., Trzaska, D., Carney, H. C., Weinzierl, R. O. The RNA polymerase factory: a robotic in vitro assembly platform for high-throughput production of recombinant protein complexes. Nucleic Acids Res. 36, 245-252 (2008).
- Tan, L., Wiesler, S., Trzaska, D., Carney, H. C., Weinzierl, R. O. Bridge helix and trigger loop perturbations generate superactive RNA polymerases. J. Biol. 7, 40(2008).
- Wiesler, S. C., Weinzierl, R. O. The linker domain of basal transcription factor TFIIB controls distinct recruitment and transcription stimulation functions. Nucleic Acids Res. 39, 464-474 (2011).
- Weinzierl, R. O., Wiesler, S. C. Revealing the Function of TFIIB. Transcription. , Forthcoming (2011).
- Bell, S. D., Magill, C. P., Jackson, S. P. Basal and regulated transcription in Archaea. Biochemical Society transactions. 29, 392-395 (2001).
- Parvin, J. D., Sharp, P. A. DNA topology and a minimal set of basal factors for transcription by RNA polymerase II. Cell. 73, 533-540 (1993).
- Tyree, C. M. Identification of a minimal set of proteins that is sufficient for accurate initiation of transcription by RNA polymerase II. Genes. 7, 1254-1265 (1993).
- Batada, N. N., Westover, K. D., Bushnell, D. A., Levitt, M., Kornberg, R. D. Diffusion of nucleoside triphosphates and role of the entry site to the RNA polymerase II active center. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 17361-17364 (2004).
- Liu, X., Bushnell, D. A., Wang, D., Calero, G., Kornberg, R. D. Structure of an RNA Polymerase II-TFIIB Complex and the Transcription Initiation Mechanism. Science (New York, N.Y). 327, 206-209 (2010).
- Kostrewa, D. RNA polymerase II-TFIIB structure and mechanism of transcription initiation. Nature. 462, 323-330 (2010).
- Werner, F., Weinzierl, R. O. Direct modulation of RNA polymerase core functions by basal transcription factors. Molecular and cellular biology. 25, 8344-8355 (2005).
Herprints en machtigingen
