De phagokinetic motiliteit spoor assay is een methode om de beweging van cellen te beoordelen. Met name de test meet chemokinesis (random celmotiliteit) in de tijd op een kwantitatieve wijze. De assay maakt gebruik van het vermogen van cellen om een meetbare spoor van de beweging van colloïdaal goud gecoate dekglaasjes maken.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Een kwantitatieve evaluatie van celmigratie door de Phagokinetic Track Motiliteit Assay
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Cellulaire beweeglijkheid is een belangrijk biologisch proces voor zowel eencellige en meercellige organismen. Het is essentieel voor verplaatsing van eencelligen naar een bron van voedingsstoffen of weg van onjuiste wijze, en in meercellige organismen voor weefselontwikkeling, immune surveillance en wondheling, maar een paar rollen 1,2,3 noemen. Deregulering van dit proces kan leiden tot ernstige neurologische, cardiovasculaire en immunologische ziekten, evenals verergerd tumorvorming en verspreid 4,5. Moleculair hebben actine polymerisatie en receptor recycling aangetoond een belangrijke rol spelen bij het cellulaire extensions (lamellipodia), dat de voorwaartse beweging van de cel 6,7,8 rijden. Echter, veel biologische vragen over de migratie van cellen blijven onbeantwoord.
De centrale rol voor cellulaire motiliteit in de menselijke gezondheid en ziekte onderstreept het belang van het begrijpen van de specifieke mechanisms bij dit proces en maakt nauwkeurige methoden voor het evalueren celmotiliteit bijzonder belangrijk. Microscopen worden meestal gebruikt om de beweging van cellen te visualiseren. De cellen gaan nogal langzaam, waardoor de kwantitatieve meting van celmigratie een resource-vend proces dat dure camera's en software kwantitatieve tijd lapsed films beweeglijke cellen. Daarom is de mogelijkheid om een kwantitatieve meting van celmigratie die kosteneffectief, niet bewerkelijk en die gebruik gemeenschappelijke laboratoriumapparatuur voeren is een grote behoefte aan veel onderzoekers.
De phagokinetic spoor motiliteit assay maakt gebruik van het vermogen van een bewegend cel gouddeeltjes zuiveren van de weg naar een meetbare spoor maken op een colloïdaal goud beklede glazen dekglaasje 9,10. Met het gebruik van vrij beschikbare software kunnen meerdere sporen worden geëvalueerd voor elke behandeling statistische vereisten bereiken. De assay kan worden gebruikt om te beoordelenmotiliteit van veel celtypen, zoals kankercellen 11,12, fibroblasten 9, neutrofielen 13, skeletspiercellen 14, keratinocyten 15, trofoblasten 16, 17 endotheelcellen en monocyten 10,18-22. Het protocol omvat het creëren van dia bekleed met goud nanodeeltjes (Au °) die worden gegenereerd door een vermindering van chloroauric acid (Au 3 +) door natriumcitraat. Deze methode is ontwikkeld door Turkevich et al.. In 1951 23 en verbeterd in de jaren 1970 door Frens et al.. 24,25. Als gevolg van deze chemische reductie stap gouddeeltjes (10-20 nm in diameter) precipiteren uit het reactiemengsel en kan worden toegepast op dekglaasjes, die dan klaar voor gebruik in cellulaire migratie analyse 9,26,27.
In het algemeen phagokinetic spoor beweeglijkheid assay is een snelle, kwantitatieve en eenvoudig meten van cellulaire motiliteit. Bovendienkan worden gebruikt als een eenvoudige high-throughput assay voor gebruik met celtypen die niet vatbaar zijn voor time-lapsed beeldvorming, evenals andere toepassingen afhankelijk van de behoeften van de onderzoeker. Samen het vermogen om cellulaire motiliteit van meerdere celtypen kwantitatief te meten zonder dure microscopen en software samen met het gebruik van gemeenschappelijke laboratoriumapparatuur en chemicaliën, maken het phagokinetic spoor motiliteit assay een goede keuze voor wetenschappers die geïnteresseerd zijn in het begrijpen van cellulaire motiliteit.
Protocol
1. Bereiding van gelatine beklede dekglaasjes
- Place zuur gewassen dekglaasjes (15 mm in diameter) in een steriele plastic 100 mm schaal (es). Plaats acht-negen coverslips per schaal en zorg ervoor dat ze elkaar niet aanraken of de zijkanten van de schotel ..
Opmerking: dekglaasjes, naalden en pincet moeten steriel mogelijke verontreinigende micro-organismen en endotoxinen die invloed cellulaire functies, waaronder motiliteit elimineren.
- Weeg de gelatinepoeder en resuspendeer de poeder in gedeïoniseerd water met een gelatine-oplossing te maken met een eindconcentratie van 0,5 g/300 m....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Getoond is een voorbeeld van beelden die onder een lichtmicroscoop met een trackgebied gewist door een cel (een monocyt van onze experimenten is getoond in figuur 2). Niet-beweeglijke cellen te creëren karakteristieke kleine, ovale of cirkelvormige stukken rond zichzelf wijst op een laag basaal niveau van verkeer van deze gestimuleerde cellen (Figuren 2A en 2B). Daarentegen zijn zeer beweeglijke cellen [in ons systeem, menselijk cytomegalovirus (HCMV)-geïnfecteerde cellen] gekenmerkt do.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De phagokinetic spoor beweeglijkheid test die in dit artikel is een eenvoudige en zeer effectieve methode voor de kwantitatieve analyse van cel migratie. Omdat meerdere celtypen kunnen worden geanalyseerd 9-17, deze werkwijze heeft het potentieel brede gebruik over meerdere disciplines. Het gebruik van colloïdaal goud beklede dekglaasjes maakt de meting van een trackgebied gewist door een bewegende cel. De test kan van het effect van verschillende stimuli (bijvoorbeeld groeifactoren, gezuiverd ECM li.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Geen belangenconflicten verklaard.
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund door subsidies van de National Institutes of Health (AI050677, HD-051998, en GM103433), een Malcolm Feist cardiovasculair onderzoek gemeenschap, en een American Heart Association predoctorale gemeenschap (10PRE4200007).
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Naam van het reagens | Vennootschap | Catalogusnummer | Reacties |
| Dekglaasjes (15 mm) | Fisher Scientific | 12-545-83 | |
| Gelatine 300 Bloom | Sigma-Aldrich | G-1890 | |
| Tetrachlorogoudzuur Trihydraat | Fisher Chemical | G54-1 | 14,5 mM (een uiteindelijke werkoplossing) |
| Natriumcitraat | Fisher Scientific | BP327-500 | 0,5% (een uiteindelijke werkoplossing) |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | O4042 | 3% (een uiteindelijke werkoplossing) |
| 100 mm weefselkweekplaat | Sarstedt | 83,1802 | |
| 12-well platen | Fisher Scientific | 08-772-29 | |
| 24-well platen | Fisher Scientific | 07-200-84 | |
| Techne Oven veredelaar HB-1D | LabPlanet | 2040500 | De standaard laboratorium oven volstaat |
| 10 ml Serologische pipetten | Sarstedt | 86.1254.001 | |
| Pipet-Aid Filler / Dispenser | Drummond | 13-681-15 | |
| P200 Single-Channel Manual Pipet | Rainin | PR-200 | |
| 200 ml Barrier Tips | CLP | BT200 | |
| ImageJ software | http :/ / rsb.info.nih.gov / ij / | Licentie: Public Domain | |
| Nikon Eclipse TE300 met een lichttechniek CoolSNAPfx monochroom 12-bits CCD-camera | Nikon | Gestaakt; De vergelijkbare specificatie heeft Nikon Eclipse Ti, maar een ondereinde Nikon 80i zal geschikt. Andere merken bieden ook vergelijkbaar microscopen. | |
| Opmerking: De reagentia en het hierna genoemde materieel zijn gebruikt door ons in onze verschillende studies. Andere benodigdheden leveranciers, reagentia en apparatuur kan worden gebruikt, zolang zij vergelijkbare specificaties. |
Referenties
- Armstrong, P. B. The control of cell motility during embryogenesis. Cancer Metastasis Rev. 4, 59-79 (1985).
- Dustin, M. L. Stop and go traffic to tune T cell responses. Immunity. 21, 305-314 (2004).
- Mutsaers, S. E., Bishop, J. E., McGrouther, G., Laurent, G. J.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
