Een kwantitatieve evaluatie van celmigratie door de Phagokinetic Track Motiliteit Assay

Samenvatting

De phagokinetic motiliteit spoor assay is een methode om de beweging van cellen te beoordelen. Met name de test meet chemokinesis (random celmotiliteit) in de tijd op een kwantitatieve wijze. De assay maakt gebruik van het vermogen van cellen om een ​​meetbare spoor van de beweging van colloïdaal goud gecoate dekglaasjes maken.

Samenvatting

Cellulaire beweeglijkheid is een belangrijk biologisch proces voor zowel eencellige en meercellige organismen. Het is essentieel voor verplaatsing van eencelligen naar een bron van voedingsstoffen of weg van onjuiste wijze, en in meercellige organismen voor weefselontwikkeling, immune surveillance en wondheling, maar een paar rollen ^1,2,3 noemen. Deregulering van dit proces kan leiden tot ernstige neurologische, cardiovasculaire en immunologische ziekten, evenals verergerd tumorvorming en verspreid ^4,5. Moleculair hebben actine polymerisatie en receptor recycling aangetoond een belangrijke rol spelen bij het ​​cellulaire extensions (lamellipodia), dat de voorwaartse beweging van de cel ^6,7,8 rijden. Echter, veel biologische vragen over de migratie van cellen blijven onbeantwoord.

De centrale rol voor cellulaire motiliteit in de menselijke gezondheid en ziekte onderstreept het belang van het begrijpen van de specifieke mechanisms bij dit proces en maakt nauwkeurige methoden voor het evalueren celmotiliteit bijzonder belangrijk. Microscopen worden meestal gebruikt om de beweging van cellen te visualiseren. De cellen gaan nogal langzaam, waardoor de kwantitatieve meting van celmigratie een resource-vend proces dat dure camera's en software kwantitatieve tijd lapsed films beweeglijke cellen. Daarom is de mogelijkheid om een ​​kwantitatieve meting van celmigratie die kosteneffectief, niet bewerkelijk en die gebruik gemeenschappelijke laboratoriumapparatuur voeren is een grote behoefte aan veel onderzoekers.

De phagokinetic spoor motiliteit assay maakt gebruik van het vermogen van een bewegend cel gouddeeltjes zuiveren van de weg naar een meetbare spoor maken op een colloïdaal goud beklede glazen dekglaasje ^9,10. Met het gebruik van vrij beschikbare software kunnen meerdere sporen worden geëvalueerd voor elke behandeling statistische vereisten bereiken. De assay kan worden gebruikt om te beoordelenmotiliteit van veel celtypen, zoals kankercellen ^11,12, fibroblasten ^9, neutrofielen ^13, skeletspiercellen ^14, keratinocyten ^15, trofoblasten ^{16, 17} endotheelcellen en monocyten ^10,18-22. Het protocol omvat het creëren van dia bekleed met goud nanodeeltjes (Au °) die worden gegenereerd door een vermindering van chloroauric acid (Au ^{3 +)} door natriumcitraat. Deze methode is ontwikkeld door Turkevich et al.. In 1951 ²³ en verbeterd in de jaren 1970 door Frens et al.. ^24,25. Als gevolg van deze chemische reductie stap gouddeeltjes (10-20 nm in diameter) precipiteren uit het reactiemengsel en kan worden toegepast op dekglaasjes, die dan klaar voor gebruik in cellulaire migratie analyse ^9,26,27.

In het algemeen phagokinetic spoor beweeglijkheid assay is een snelle, kwantitatieve en eenvoudig meten van cellulaire motiliteit. Bovendienkan worden gebruikt als een eenvoudige high-throughput assay voor gebruik met celtypen die niet vatbaar zijn voor time-lapsed beeldvorming, evenals andere toepassingen afhankelijk van de behoeften van de onderzoeker. Samen het vermogen om cellulaire motiliteit van meerdere celtypen kwantitatief te meten zonder dure microscopen en software samen met het gebruik van gemeenschappelijke laboratoriumapparatuur en chemicaliën, maken het phagokinetic spoor motiliteit assay een goede keuze voor wetenschappers die geïnteresseerd zijn in het begrijpen van cellulaire motiliteit.

Protocol

1. Bereiding van gelatine beklede dekglaasjes

1. Place zuur gewassen dekglaasjes (15 mm in diameter) in een steriele plastic 100 mm schaal (es). Plaats acht-negen coverslips per schaal en zorg ervoor dat ze elkaar niet aanraken of de zijkanten van de schotel ..

Opmerking: dekglaasjes, naalden en pincet moeten steriel mogelijke verontreinigende micro-organismen en endotoxinen die invloed cellulaire functies, waaronder motiliteit elimineren.

2. Weeg de gelatinepoeder en resuspendeer de poeder in gedeïoniseerd water met een gelatine-oplossing te maken met een eindconcentratie van 0,5 g/300 ml. Vervolgens wordt de gelatine oplossing worden geautoclaveerd.
3. Pipetteer 2-3 druppels van gelatine (~ 100-150 ml) op elke dekglaasje aan.

Opmerking: Let erop dat de gelatine om de schotel aan te raken of je zal niet in staat zijn om de dekglaasjes te verwijderen uit de schotel.

4. Bak de gelatine beklede dekglaasjes in de 100 mm schaal in een oven bij 90 ° C gedurende 10 minuten.
5. Verwijder het teveel aan gelatine door zachte pipetteren.
6. Droog de dekglaasjes in de 100 mm schaal in de oven bij 70 ° C gedurende 45 minuten.
7. Eenmaal droog, verwijder de dekglaasjes van de 100 mm schaal met behulp van een steriele, endotoxine-vrij naald en pincet (de naald wordt gebruikt om voorzichtig duwtje de dekglaasje toegankelijk te maken voor de pincet om voorzichtig te verwijderen).
8. Plaats individuele gelatine beklede dekglaasjes in afzonderlijke putjes van een 24-wells schaal.

2. Bereiding van colloïdaal goud beklede dekglaasjes

1. Weeg een geschikte hoeveelheid chloroauric zuur (tetrachlorogoudzuur trihydraat; _HAuCl4 · 3H ₂ O) en resuspendeer in steriel gedeïoniseerd water om een uiteindelijke 14,5 mM oplossing (toxisch) te bereiden. Bereid 1,5 ml van de oplossing per 8-9 coverslips.

Waarschuwing: Chloroauric zuur is harmvol opname door de mond, veroorzaakt ernstige brandwonden en oogletsel en kan een allergische huidreactie veroorzaken. Giftig bij inslikken.

2. Weeg een geschikte hoeveelheid natriumcitraat (trinatrium diwaterstof 2-hydroxypropaan-1 ,2,3-tricarboxylaat, Na ₃ C ₆ H ₅ O ₇₎ en resuspendeer de poeder in gedeïoniseerd water om een uiteindelijke 0,5% oplossing. Bereid 1 ml van de oplossing per 8-9 coverslips.

Waarschuwing: Natriumcitraat kan oog-en huidirritatie veroorzaken. Het kan ook irritatie van de luchtwegen en het spijsverteringskanaal irritatie.

3. In een steriele, endotoxinevrij bekerglas combineren 1,5 ml van de steriele 14,5 mM _{HAuCl4-oplossing} en 13,5 ml steriel gedeïoniseerd water, door deze maatregelen een lichtgele oplossing verkregen. Bovengenoemde volumes stellen voor 8-9 colloïdaal goud dekglaasjes worden gemaakt.
4. Terwijl continu roeren verwarmen van de oplossing op een hete plaat tot het begint te bolie.

Waarschuwing: de verwarming van de oplossing moet worden uitgevoerd in de zuurkast als dampen kunnen schadelijk / giftig. De dampen zijn destructief voor het weefsel van de slijmvliezen en de bovenste luchtwegen.

5. Neem het bekerglas van de kookplaat.
6. Onder roeren, voeg 0,7 ml van de 0,5% natriumcitraatoplossing. Bovengenoemde volume zal voor 8-9 colloïdaal goud dekglaasjes worden gemaakt.
7. Blijf roeren deze gecombineerde oplossing voor ongeveer 2 minuten (Let op: De kleur van de oplossing zal geleidelijk veranderen van licht geel, met, duidelijk uit grijs, paars, tot diep paars, voordat ze uiteindelijk het bereiken van een rode wijn of, bij voorkeur, roest kleur) . Dit product is uw colloïdaal goud-oplossing.
8. Koel de oplossing colloïdaal goud in een 10 ml pipet voor 1-2 min (om de gelatinelaag op het dekglaasje houden van smelten wanneer het colloïdale goud oplossing toegevoegd) en voeg 1,0-2,0 ml colloidal goud oplossing op elk gelatine-gecoate dekglaasje eerder geplaatst in een 24-wells schotel (s) (het bedrag van de colloïdaal goud oplossing die u toevoegt aan de gelatine-gecoate dekglaasjes hangt af van hoe goed de gouddeeltjes neergeslagen in de oplossing - zie opmerkingen hieronder).

Opmerking: Omdat er misschien verschillen in de efficiëntie van gouddeeltje neerslag wordt geadviseerd om eerst toevoegen 0,5-1 ml van de oplossing colloïdaal goud aan de gelatine gecoate dekglaasjes en vervolgens de 24-well gerecht in de incubator gedurende 0,5 uur . Na deze incubatie tijd moet de dekglaasjes worden gecontroleerd onder de lichtmicroscoop voor de dichtheid van de gouddeeltjes op de dekglaasjes. Zie figuur 1 voor 20x microscopiebeelden voorbeelden van te lage en te hoge concentratie van gouddeeltjes. Zie figuur 2 voor 40x microscopiebeelden een ideale concentratie van gouddeeltjes (tenminste voor gebruik met monocyten). De optiMAL dichtheid van de gouden nanodeeltjes op de dia proefondervindelijk worden bepaald voor elke gebruikte celtype, de kenmerken van de verschillende cellen hun sterkte verkeer dicteren dekglaasjes. Indien de concentratie van gouddeeltjes onvoldoende, een extra 0,5-1 ml van het colloïdaal goud oplossing van het met gelatine beklede dekglaasjes.

Afhankelijk van de celgrootte, kunnen de juiste concentraties van gouddeeltjes variëren en dus uiteindelijk afhangen van de grootte van de cel onderzocht motiliteit. Bijvoorbeeld met humane monocyten zijn kleine cellen (~ 10-20 um ²⁸⁾ werd een hogere concentratie van goud deeltjes vereist in de analyses. De juiste verdeling van goud nanodeeltjes biedt de onderzoeker de mogelijkheid om eenvoudig en efficiënt te onderscheiden van de randen van cellulaire tracks. Een concentratie van gouddeeltjes te hoge belemmert het vermogen van cellen om daardoor bewegen en een nauwkeurige metinghun beweeglijkheid, terwijl een concentratie van gouddeeltjes te lage grenzen zijn dat men een nauwkeurig bij motiliteit bakenen.

Belangrijke opmerking: Als de synthese van goud nanodeeltjes is problematisch, gesynthetiseerd goud nanodeeltjes zijn commercieel verkrijgbaar in de maten van 5 nm tot 400 nm. Daarnaast zijn fluorescerende microbolletjes ook gebruikt in studies van celmotiliteit ^29. Het gebruik van deze microsferen is een fluorescentiemicroscoop voor de analyse van celmigratie.

9. Plaats de 24-well schaal met colloïdaal goud bedekte dekglaasjes in een incubator bij 37 ° C en incubeer 1 uur tot 's nachts.
10. Na incubatie, spoelen / verwijderen ongebonden goud door dompelen de dekglaasjes (3x) in steriele fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS, pH 7,4).
11. Plaats deze colloïdale goud beklede dekglaasjes in een schone 12-well schaal (es) met PBS.
12. Bewaar deze dekglaasjes bij 4 ° C tot klaar tegebruiken (parafilm de plaat voor het plaatsen in de koelkast).

Belangrijk: altijd het colloïdale goud gecoate dekglaasjes houden in een soort van vloeibare / media als gouddeeltjes kan afschilferen van de dekglaasjes bij opdrogen. De colloïdaal goud dekglaasjes moet worden gebruikt binnen 2-3 maanden na de datum waarop ze werden gemaakt.

Kwaliteitscontrole: In een phagokinetic spoor motiliteit assay, is het essentieel om dekglaasjes die worden gekenmerkt door een vergelijkbare concentratie van gouddeeltjes gebruikt. Deze eenvoudige punt zal de kwantitatieve verschillen in cellulaire motiliteit tussen monsters als uitsluitend door de aard van de behandeling en niet de fysische eigenschappen van het colloïdale goud gecoate dekglaasjes. Wij geven de voorkeur met alleen dekglaasjes die tegelijkertijd in afzonderlijke experimenten, hoewel we hebben aangetoond dat zolang de dichtheid van de gouden nanodeeltjes gelijk zijn, het gebruik van dekglaasjesuit verschillende preparaten geschikt.

3. Analyse van de Cellulaire Motiliteit

1. Plaats de colloïdale goud gecoate dekglaasjes in een geschikte cellulaire media voor de cellen van belang.
2. Breng passende behandelde cellen aan de colloïdale goud gecoate dekglaasjes in een 24-wells schaal (es)

Opmerking: Het aantal cellen overgeheveld naar de put moet worden bepaald voor elk celtype onderzocht. Idealiter cellen moeten gelijkelijk verdeeld over de colloïdale goud gecoate dekglaasje, die op hun beurt zorgen voor de statistische analyse van slechts sporen die door een enkele cel. Als cellen worden uitgeplaat bij een te hoge concentratie, wordt zeer waarschijnlijk dat overlappende fragmenten van meerdere cellen worden gezien. Overlappende titels niet nauwkeurig kunnen worden gekwantificeerd en dus kunnen zij niet worden meegenomen in de analyses van de beweging van de geteste cellen. Overlappende sporen als gevolg vanbetrokkenheid van meerdere cellen zijn meestal gemakkelijk waargenomen, zoals samengevoegd of gepasseerd tracks (in het gebied van analyse) waarin twee of meer cellen worden waargenomen in dezelfde aaneengesloten open plek.

3. Incubeer bij 37 ° C / 5% _CO2 gedurende 24 uur (of elke geschikte tijd, bijvoorbeeld we hebben geanalyseerd monocyte beweeglijkheid tussen 6 uur en 24 uur na behandeling en endotheelcellen op 12 uur na de behandeling). De optimale tijd voor het bepalen en het meten van cellulaire motiliteit zal variëren met het celtype onderzocht en derhalve proefondervindelijk worden bepaald voor elk celtype (een goed uitgangspunt, echter is 6 - 12 uur na behandeling).

Opmerking: Als experimentele colloïdaal goud beklede dekglaasjes moeten worden opgeslagen en / of geanalyseerd op een later tijdstip, de cellen en goud nanodeeltjes moeten worden vastgesteld op dekglaasjes. Om dit te bereiken fixatie stap; volgende stap 3.3, eerste wasbeurt dekglaasjes voorzichtig 2 keer met 1xPBS (onderdompelen van dekglaasjes de voorkeur, als verwijdering van goud nanodeeltjes uit coverslips moet worden vermeden), gebruik dan een standaard mobiele fixatiemethode zoals incubatie met kamertemperatuur 3% paraformaldehyde. Na 15 min incubatie dient de 3% paraformaldehyde worden verwijderd en de dekglaasjes gewassen voorzichtig 3 maal met 1 x PBS. De vaste coverslips kunnen worden opgeslagen in een koelkast.

4. Met behulp van een lichtmicroscoop, foto's maken van de tracks die door een enkele bewegende cel (Opmerking: De vergroting wordt gebruikt om foto's van cellulaire tracks te nemen zal zeker afhankelijk van het celtype in onderzoek). Voorbeelden van cellulaire tracks gecreëerd door niet-beweeglijke en beweeglijke cellen van colloïdaal goud gecoate dekglaasjes worden getoond in Figuur 2.

Opmerking: De gouden nanodeeltjes van de grootte in de phagokinetic spoor motiliteit assay is gebleken volledig toxisch voor cellen ^30. Eventueel, De levensvatbaarheid van de cellen onderzocht worden beoordeeld door kleuring met trypan blauw of onderzocht op andere markers van cellulaire levensvatbaarheid. Zou men rekening houden met de noodzaak voor fixatie, soort bevestiging enz., indien deze stap moet worden uitgevoerd.

5. Door de vrij beschikbare software, zoals ImageJ software ( http://rsbweb.nih.gov/ij/ ) of NIH Image ( http://rsb.info.nih.gov/nih-image/ ), beide ontwikkeld op National Institutes of Health, of ImageTool ( http://ddsdx.uthscsa.edu/dig/itdesc.html ) ontwikkeld aan de Universiteit van Texas Health Science Center in San Antonio, de gemiddelde oppervlakte (in willekeurige eenheden) van colloïdaal goud gewist door 10-20 of meer cellen (per monster) wordt per experimentele arm van de vastgelegde beelden. Statistieken kunnen dan worden uitgevoerd op thij verzamelde resultaten. Bijvoorbeeld, kunnen de resultaten worden uitgezet als gemiddelden ± de standaardfout van de middelen (SEM) met de uitgeoefende Student's t test, en een P-waarde van <0,05 als de mate van statistische significantie tussen de monsters. Figuren 3 en 4 tonen stappen in de analyse van het gebied van colloïdaal goud vrijgegeven door de cel.

Resultaten

Getoond is een voorbeeld van beelden die onder een lichtmicroscoop met een trackgebied gewist door een cel (een monocyt van onze experimenten is getoond in figuur 2). Niet-beweeglijke cellen te creëren karakteristieke kleine, ovale of cirkelvormige stukken rond zichzelf wijst op een laag basaal niveau van verkeer van deze gestimuleerde cellen (Figuren 2A en 2B). Daarentegen zijn zeer beweeglijke cellen [in ons systeem, menselijk cytomegalovirus (HCMV)-geïnfecteerde cellen] gekenmerkt do...

Discussie

De phagokinetic spoor beweeglijkheid test die in dit artikel is een eenvoudige en zeer effectieve methode voor de kwantitatieve analyse van cel migratie. Omdat meerdere celtypen kunnen worden geanalyseerd ^9-17, deze werkwijze heeft het potentieel brede gebruik over meerdere disciplines. Het gebruik van colloïdaal goud beklede dekglaasjes maakt de meting van een trackgebied gewist door een bewegende cel. De test kan van het effect van verschillende stimuli (bijvoorbeeld groeifactoren, gezuiverd ECM li...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Naam van het reagens	Vennootschap	Catalogusnummer	Reacties
Dekglaasjes (15 mm)	Fisher Scientific	12-545-83
Gelatine 300 Bloom	Sigma-Aldrich	G-1890
Tetrachlorogoudzuur Trihydraat	Fisher Chemical	G54-1	14,5 mM (een uiteindelijke werkoplossing)
Natriumcitraat	Fisher Scientific	BP327-500	0,5% (een uiteindelijke werkoplossing)
Paraformaldehyde	Fisher Scientific	O4042	3% (een uiteindelijke werkoplossing)
100 mm weefselkweekplaat	Sarstedt	83,1802
12-well platen	Fisher Scientific	08-772-29
24-well platen	Fisher Scientific	07-200-84
Techne Oven veredelaar HB-1D	LabPlanet	2040500	De standaard laboratorium oven volstaat
10 ml Serologische pipetten	Sarstedt	86.1254.001
Pipet-Aid Filler / Dispenser	Drummond	13-681-15
P200 Single-Channel Manual Pipet	Rainin	PR-200
200 ml Barrier Tips	CLP	BT200
ImageJ software	http :/ / rsb.info.nih.gov / ij /		Licentie: Public Domain
Nikon Eclipse TE300 met een lichttechniek CoolSNAPfx monochroom 12-bits CCD-camera	Nikon		Gestaakt; De vergelijkbare specificatie heeft Nikon Eclipse Ti, maar een ondereinde Nikon 80i zal geschikt. Andere merken bieden ook vergelijkbaar microscopen.
			Opmerking: De reagentia en het hierna genoemde materieel zijn gebruikt door ons in onze verschillende studies. Andere benodigdheden leveranciers, reagentia en apparatuur kan worden gebruikt, zolang zij vergelijkbare specificaties.