High-throughput screening voor kleine-molecule Modulators van Actieve Rectifier kaliumkanalen

Summary

Werkwijzen voor het ontwikkelen en valideren van een kwantitatieve fluorescentie assay voor het meten van de activiteit van de actieve gelijkrichter kalium (Kir) kanalen voor high-throughput screening verbinding gepresenteerd.

Abstract

Specifieke leden van de regeling actieve gelijkrichter kalium (Kir) kanaal familie worden gepostuleerd drug targets voor een verscheidenheid van aandoeningen, waaronder hypertensie, atriumfibrilleren, en pijn ^1,2. Voor het grootste deel, echter, is de vooruitgang in de richting van het begrijpen van hun therapeutisch potentieel of zelfs elementaire fysiologische functies is vertraagd door het gebrek aan goede farmacologische tools. Inderdaad, de moleculaire farmacologie van de actieve gelijkrichter familie ver achter die van de S4 superfamilie van voltage-gated kalium (Kv) kanalen, waarbij een aantal nanomolaire affiniteit en zeer selectieve modulatoren peptide toxine ontdekt ^3. De bijengif toxine tertiapin en derivaten daarvan zijn krachtige remmers van Kir1.1 en Kir3 kanalen ^4,5, maar peptiden een beperkt nut therapeutisch als experimenteel vanwege hun antigene eigenschappen en slechte biologische beschikbaarheid, metabolische stabiliteit en weefsel penetrantie. De ontwikkeling van krachtigeen selectieve kleine moleculen sondes met verbeterde farmacologische eigenschappen zal een sleutel tot het volledig begrijpen van de fysiologie en therapeutisch potentieel van Kir-kanalen zijn.

De Molecular Libraries Probes Production Center Network (MLPCN), ondersteund door de National Institutes of Health (NIH) Gemeenschappelijk Fonds heeft mogelijkheden gecreëerd voor academische wetenschappers sonde ontdekking campagnes te starten voor moleculaire targets en signaalwegen die behoefte hebben aan een betere farmacologie ^6. De MLPCN biedt onderzoekers toegang tot de industrie-schaal screening centra en medicinale chemie en informatica ondersteuning op laag-moleculaire sondes om de functie van genen en genproducten netwerken toe te lichten te ontwikkelen. De kritische stap in het verkrijgen van toegang tot de MLPCN is de ontwikkeling van een robuuste target-of route-specifieke assay die vatbaar voor high-throughput screening (HTS).

Hier beschrijven we hoe u een fluorescentie gebaseerde thallium (Tl ⁺⁾ flux ASSA ontwikkeleny van Kir kanaalfunctie voor high-throughput screening verbinding ^7,8,9,10. De assay is gebaseerd op de permeabiliteit van de K ⁺ kanaalporie de K ⁺ Tl ⁺ congener. Een commercieel verkrijgbare fluorescerende Tl ⁺ reporter kleurstof wordt gebruikt flux van Tl ⁺ detecteren door de porie. Er zijn minstens drie beschikbare kleurstoffen die geschikt zijn voor Tl ⁺ flux assays: BTC, FluoZin-2 en FluxOR ^7,8. Dit protocol beschrijft assay-ontwikkeling met behulp FluoZin-2. Hoewel oorspronkelijk ontwikkeld en verkocht als een zink indicator, FluoZin-2 vertoont een robuuste en dosisafhankelijke toename in fluorescentie-emissie bij Tl ⁺ binding. We begonnen te werken met FluoZin-2 voor FluxOR beschikbaar was ^7,8 en zijn doorgegaan met dat ^9,10 doen. De stappen in assay ontwikkeling zijn in wezen identiek voor alle drie kleurstoffen en gebruikers moeten bepalen welke kleurstof meest geschikt is voor de specifieke needs. We bespreken ook de test de prestaties van benchmarks die moeten worden bereikt om in aanmerking komen voor de toegang tot het MLPCN. Sinds Tl ⁺ gemakkelijk doordringt de meeste K ⁺ kanalen, moet de test kunnen worden aangepast aan de meeste K ⁺ kanaal doelstellingen.

Protocol

1. Genereren van stabiele cellijnen Polyclonal

1. De oprichting van een hoge kwaliteit stabiele cellijn die de Kir kanaal van belang is een belangrijke eerste stap in de richting van het ontwikkelen van een robuuste high-throughput screening test. Constitutieve K ⁺ kanaal overexpressie kan leiden tot activering van celdood pathways, stabiele cellijn degeneratie en verlies van de bepaling. Om deze eventuele problemen te vermijden en een geschikte interne controle voor assay ontwikkeling (zie hieronder) is een tetracycline-induceerbaar expressiesysteem aanbevolen ^8.
2. Cultuur de ouderlijke T-rex-HEK293 cellen onder toepassing van s....

Results

Het gebruik van een tetracycline-induceerbaar expressiesysteem een handige interne controle voor het onderscheid Tl ⁺ flux via endogene routes en Kir kanaal plaats. Figuur 1 toont voorbeelden van cel plating kaarten in verschillende experimenten. De posities van putjes met geïnduceerde of tetracycline-geïnduceerde cellen worden aangeduid met verschillende kleuren. Figuur 2A toont de bron plaat kaart gebruikt om de optimale concentratie voor Tl ⁺ assay ontwikkeling .......

Discussion

Gegevensverwerking: Nadat de gegevens zijn verzameld, een gebruikelijke stap in de analyse omvat normaliseren elke put fluorescentie respons, F, zijn initiële waarde aan het begin van het experiment F _0. Dit wordt gewoonlijk aangeduid als de "statische ratio" en symbool "F / F ^_0". Wanneer F ₀ wordt gedomineerd door de indicatorkleurstof de statische operatie verhouding aanzienlijk zal corrigeren vele factoren zoals disuniformities in verlic.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Naam van het reagens	Vennootschap	Catalogusnummer	Reacties
pcDNA5/TO	Invitrogen	V1033-20	Tetracycline induceerbare expressievector
T-Rex-HEK293 cellen	Invitrogen	R71007	Tetracycline-induceerbare cellijn
Lipofectamine LTX / Plus Reagens	Invitrogen	15338100	Transfectiereagens
FBS	ATLANTA Biologicals	S11550	Celcultuurmedia
DMEM	Invitrogen	11965	Celcultuurmedia
Hygromycine B	Invitrogen	10687-010	Celcultuurmedia
Blasticidine S	Invitrogen	R210-01	Celcultuurmedia
Penicilline / streptomycine	Invitrogen	15140	Celcultuurmedia
HBSS-divalente gratis	Mediatech	21022CV	Cel wassen
Trypsine-0,25%	Mediatech	25053CI	Cel dissociatie
Tetracycline-HCl	Sigma	T9823	Inductie reagens
Gedialyseerde FBS	ATLANTA Biologicals	S12650	Plating media
FluoZin-2	Invitrogen	F24189	Fluorescerende kleurstof
Pluronic F-127	Invitrogen	P-3000MP	Dye laden
HBSS	Invitrogen	14175	Testbuffer
HEPES	Invitrogen	15630	Testbuffer
NaHCO3	Sigma	S6297	Tl + stimulus buffer
MgSO4	Sigma	M2643	Tl + stimulus buffer
CaSO 4 • 2H 2 O	Sigma	C3771	Tl + stimulus buffer
D-Glucose	Sigma	G7528	Tl + stimulus buffer
Thallium sulfaat	Aldrich	204625	Tl + stimulus buffer
HEPES	Sigma	H4034	Tl + stimulus buffer
DMSO	Sigma	D4540	Solvent
Acht-kanaals elektronische pipet	Biohit	E300	Cel plating in 384 -putjesplaten
BD PureCoat amine beklede 384-putjes	BD Biosciences	356719	Assay microplaten
Echo gekwalificeerd 384-Well polypropyleen microplaat (384pp)	Labcyte	P-05525	Compound bron microplaten
384-wells polypropyleen microplaten	Greiner Bio-One	781280
Multidrop Combi reagens dispenser	Thermo Scientific	5840300
ELx405 microplaat wasmachine	BioTek	ELx405HT	Geautomatiseerde cel wassen
Echo vloeibare handler	Labcyte	Labcyte Echo 550
Bravo geautomatiseerde liquid handling platform	Agilent Technologies	Standaard model
Hamamatsu FDSS 6000	Hamamatsu		Kinetic imaging plaat lezer