piggyBac Transposon Systeem Wijziging van primaire menselijke T-cellen

Samenvatting

We beschrijven een werkwijze voor genetisch primaire humane T cellen te veranderen met een transgen via de non-virale PiggyBac Transposon systeem. T-cellen aangepast om met de PiggyBac Transposon systeem vertonen een stabiele expressie van het transgen.

Samenvatting

Het piggyBac transposon systeem is van nature actief, oorspronkelijk afkomstig van de kool grijper mot ^1,2. Deze niet-virale systeem plasmide gebaseerd meest gebruikmakend van twee plasmiden met een expressie de piggyBac transposase enzym en een transposon plasmide het gen (s) plaats tussen inverted repeat elementen die nodig zijn voor genoverdracht activiteit. PiggyBac bemiddeld door genoverdracht een "knip en plak" mechanisme waardoor de transposase het transposon segment geïntegreerd in het genoom van de doelcel (s) plaats. PiggyBac aangetoond efficiënte genafgifte activiteit in diverse insecten ^1,2, zoogdieren ^3-5, en menselijke cells6 met inbegrip van primaire humane T-cellen ^7,8. Onlangs werd een hyperactieve piggyBac transposase gegenereerd verbeteren van genoverdracht efficiëntie ^9,10.

Menselijke T lymfocyten van klinische interest voor adoptieve immunotherapie van kanker ^11. Van de nota, heeft de eerste klinische studie met transposon modificatie van menselijke T-cellen met behulp van de Doornroosje transposon systeem is goedgekeurd ^12. We hebben eerder beoordeelde de bruikbaarheid van piggyBac als niet-virale methoden voor genetische modificatie van humane T-cellen. We vonden piggyBac om efficiënt in genetische modificatie van humane T-cellen met een reportergen en een niet-immunogene induceerbare zelfmoordgentherapie ^7. Analyse van genomische integratieplaatsen gebleken dat er geen voorkeur voor integratie in of nabij bekende proto-oncogenen ^13. We gebruikten piggyBac gen-passen cytotoxische T-lymfocyten een chimeer antigen receptor gericht tegen het tumor antigen HER2 dragen, en dat gen-gemodificeerde T-cellen gemedieerd gericht doden van HER2-positieve tumorcellen in vitro en in vivo in een muizenmodel orthotope ^14. We hebben ook piggyBacmenselijke T-cellen tegen rapamycine, die van nut zijn in kankerbehandelingen waar rapamycine wordt gebruikt ¹⁵ genereren.

Hierin beschrijven we een methode om met piggyBac genetisch te modificeren primaire humane T cellen. Dit omvat isolatie van perifeer bloed mononucleaire cellen (PBMCs) uit menselijk bloed gevolgd door kweek, genetische modificatie, en activering van T-cellen. Ten behoeve van dit rapport werden T cellen gemodificeerd met een reportergen (eGFP) voor analyse en kwantificering van genexpressie door flowcytometrie.

PiggyBac kan worden gebruikt om menselijke T-cellen te passen met verschillende genen van interesse. Hoewel we gebruik piggyBac T-cellen voor tumorantigenen ¹⁴ sturen, hebben we ook een induceerbare piggyBac veiligheidsschakelaar toevoegen om genetisch gemanipuleerde cellen te elimineren indien nodig ^7. De grote laadvermogen van piggyBac is ook mogelijk genoverdracht vaneen grote rapamycine resistent mTOR molecuul (15 kb) ^15. Daarom presenteren we een niet-virale methodologie voor stabiele gen-modificatie van primaire humane T cellen voor diverse doeleinden.

Protocol

Day 0

1. Isolatie van PBMC uit humaan bloed

1. Verzamel 20 ml vers menselijk bloed met behulp van venapunctie in Na-Vacutainer buizen.
2. Mix bloed en geavanceerde RPMI 1640 in 1:1 (v / v) verhouding.
3. Voeg 20 ml lymphoprep medium aan een 50 ml centrifugebuis (25 ° C). Langzaam 25-30 ml bloed RPMI 1640 mix bovenop de Lymphoprep.
4. Centrifugeer op 400 xg gedurende 40 min zonder remmen.
5. Verzamel zowel verschillende en fuzzy lagen met behulp van een disposable pipet in 10 ml 1x PBS (25 ° C) en breng het volume op 50 ml met 1x PBS.
6. Centrifugeer bij 450 xg gedurende 10 minuten.
7. Volledig Zuig het supernatant en voeg 20 ml van Advanced RPMI 1640.
8. Centrifugeer bij 400 xg gedurende 5 minuten.
9. Zuig het supernatant. Voeg 10 ml compleet T-cel medium aangevuld met 5 ng / ml rhIL-15 voorverwarmd bij 37 ° C.
10. Tel het aantal cellen en de plaat in een 24 well weefselkweek vachted plaat bij 2 x 10 ⁶ cellen / putje in compleet T-cel medium aangevuld met 5 ng / ml rhIL-15 steriel water aan omringende putjes. Incubeer overnacht in een bevochtigde incubator bij 37 ° C, _5% CO2.

Dag 1

2. Coating platen met anti-CD28 en anti-CD3 antilichaam voor het stimuleren van T-cellen

1. Verdun anti-CD28 en anti-CD3 antilichamen in steriel water bij een concentratie van 1 ug / ml elk.
2. Voeg 500 ul elk antilichaam oplossing 5 aangegeven putjes van een niet-beklede weefselkweek plaat met 24 putjes.
3. Voeg steriel water om uit te rusten van de putten. Wikkel de plaat in krimpfolie en plaats in een 4 ° C koelkast.

3. Nucleofectie van gestimuleerde T-cellen

1. Voorverwarmen T-cel media bij 37 ° C en supplement met 5 ng / ml rhIL-15. Bereid volledige nucleofector oplossing door toevoeging van 500 pi Nucleofector Supplement 1 2,25 ml van Nucleofector oplossing.
2. Eenliquot 5 ug elk van transposon (Zeo-pT-CMV-EGFP) en transposase (pCMV-piggyBac) in een 1,5 ml microfugebuis. Opmerking: Het kan nodig zijn de transposase en transposon DNA bedrag voor optimale genafgifte optimaliseren en te minimaliseren cellulaire toxiciteit. De plasmiden kunnen worden bij de auteurs op verzoek.
3. Harvest PBMCs van de 24 wells weefselkweekplaat in een 50 ml buis. Tel het aantal cellen. Bewaar 2 x 10 ⁶ cellen voor gebruik als controle tijdens flowcytometrie.
4. Voeg 7-10 x 10 ⁶ cellen om een 15 ml en centrifugeer bij 400 xg, 5 min, aspireren supernatant en vinger trap de pellet.
5. Voeg 100 ul van T cel volledige nucleofectie oplossing los cel pellet.
6. Voeg de oplossing-celmengsel aan de buis met de plasmiden.
7. Voeg de oplossing-cel-plasmide mengsel aan de bodem van de cuvette nucleofectie. Wees voorzichtig en laat geen luchtbellen te introduceren.
8. Nucleofect de cellen met behulp program U-014 (gestimuleerde T cellen, humane, http://bio.lonza.com/resources/product-instructions/protocols/ ).
9. Onmiddellijk voeg 500 ul van voorverwarmde media met rhIL-15 naar de cuvette. Breng de cellen aan een putje van een plaat met 24 putjes met 1,5 ml voorverwarmde media rhIL15.
10. Incubeer overnacht in een bevochtigde incubator bij 37 ° C, _5% CO2.

Dag 2

4. Niet-specifieke stimulatie van T-cellen

1. Oogst cellen en bepalen celaantallen. Vernietiging 0,5 x 10 ⁶ cellen voor flowcytometrie om de frequentie van GFP-positieve cellen te bepalen. Gebruik de niet-getransfecteerde PBMC als controles.
2. Zuig het CD3/28 antilichaamoplossing uit de niet weefselkweek gecoate platen en spoel elk putje met T-cel media.
3. Resuspendeer de nucleofected cellen bij 0,5 x 10 ⁶ cellen per ml in compleet media CTLaangevuld met 5 ng / ml rhIL-15. Voeg 2,0 ml van de cellen in nucleofected 4 wells van de niet weefselkweekplaat. Voeg 0,5 x 10 ⁶ cellen niet nucleofected ^de 5e goed.
4. Incubeer gedurende 3 dagen in een bevochtigde incubator bij 37 ° C, _5% CO2.

Dag 5

1. Oogst de gestimuleerde T-cellen van niet-beklede weefselkweekplaat.
2. Tellen en de cellen replate in een 24 wells beklede weefselkweekplaat van 0,7 x 10 ⁶ cellen / ml in T cell media met 5 ng / ml IL-15.

Dag 7

7. Analyse van genexpressie

1. Oogst cellen en vlekken met anti-humaan CD8 antilichaam (kon ook anti-CD3 en anti-CD4) en geanalyseerd met flowcytometrie voor GFP expressie%.

Dag 8 (Optioneel)

8. Expansie van T-cellen

1. Op dag 8 na transfectie, kunnen T-cellen worden opnieuw uitgeplaat in T-Celmedium met IL-15 bij een dichtheid van 0,7 x 10 ⁶ cellen per putje voor verdere uitbreiding ^16.

Resultaten

Een schematische tonen de stappen genetische verandering menselijke T-lymfocyten met een reportergen (eGFP) wordt getoond in Figuur 1. Deze plasmiden zijn op verzoek verkrijgbaar bij de auteurs. Een schemtic tonen de stappen in genetisch gemodificeerde humane T-lymfocyten met een reportergen (eGFP) is showin in figuur 2. Er moet T-cellen activeren om hen te verdelen, uitbreiden en in cultuur propageren. Gemodificeerde menselijke T-cellen werden vervolgens geanalyseerd met behulp van flo...

Discussie

De hierin beschreven werkwijze worden stabiele transgene modificatie van primaire menselijke T-lymfocyten. We hebben eerder geteste het gebruik van het piggyBac transposon systeem T-cellen wijzigen om een reportergen (meer dan 4 weken), een niet-immunogene suïcidegen een chimeer antigen receptor voor adoptieve immunotherapie (langer dan 100 dagen) te drukken, en om de weerstand ingenieur aan immunosuppressieve geneesmiddelen ^7,13-15. Niet-virale modificatie van T cellen voor adoptieve immunotherapie ...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Naam van het reagens	Vennootschap	Catalogusnummer	Opmerkingen (optioneel)
Lympholyte	Cedarlane	CL5015
Geavanceerde RPMI 1640	LifeTechnologies	12633020
Foetaal runderserum Hyclone	Fisher Scientific	SH3008803
Glutamax-I Supplement	LifeTechnologies	35050-061
Humaan IL-15 Recombinant Protein	eBioscience	14 tot 8159
EndoFree Plasmide Maxi Kit	Qiagen	12362
Amaxa Nucleofector	Lonza	AAD-1001S	& Nbsp;
Humane T-cel Nucleofector Kit	Lonza	VPA-1002
CD8-APC	Zuid-Biotech	9536-11
Anti-Human CD3	eBioscience	16-0037-81
Anti-Human CD28	BD Pharmingen	555725
24 Nou Tissue Culture Behandeld Plate	BD Falcon	353047
24 Nou Niet Tissue Culture Behandeld Plate	BD Falcon	351147
			Compleet T-cel media samenstelling 1x Geavanceerde RPMI 1640 5% door warmte geïnactiveerd foetaal runderserum 2 mM GlutamaxIM-I