Het bestuderen van Proteolyse van cycline B op de enkele cel niveau in Hele celpopulaties

Samenvatting

Metafase naar anafase transitie wordt geactiveerd door middel van anafase-bevorderende complex (APC / C)-afhankelijke ubiquitinering en de daarop volgende vernietiging van cycline B. Hier hebben we een systeem dat, na pulse-chase etikettering, maakt het monitoren cycline B proteolyse in hele cel populaties en vergemakkelijkt de detectie van inmenging van de mitotische checkpoint.

Samenvatting

Gelijke verdeling van de chromosomen tussen de twee dochtercellen tijdens de celdeling is een voorwaarde voor het waarborgen van de genetische stabiliteit ^1. Onjuistheden in de loop van chromosoom scheiding zijn een kenmerk van maligniteit en geassocieerd met progressieve ziekte ^2-4. De assemblage van de spoel checkpoint (SAC) is een mitotische surveillance mechanisme dat tegenhoudt cellen in metafase tot elk chromosoom heeft een stabiele bipolaire gehechtheid aan de mitotische spindel ^1. De SAC oefent zijn functie door interferentie met de activerende APC / C subunit Cdc20 voor proteolyse van securin en cycline B en dus chromosoom scheiding en mitotische uitgang blokkeren. Onjuiste bevestiging van chromosomen voorkomt silencing van SAC signalering en veroorzaakt voortgezet remming van APC / C ^Cdc20 totdat het probleem is opgelost op chromosoom missegregation, aneuploïdie en kwaadaardige gezwellen ^te voorkomen ^1.

De meeste studies die de i aangepaktnfluence van onjuiste chromosomale beslag op APC / C-afhankelijke proteolyse maakte gebruik van as verstoring met depolymeriseren of microtubuli-stabiliserende medicijnen te bemoeien met chromosomale gehechtheid aan microtubuli. Omdat interferentie met microtubule kinetiek kan het transport en lokalisatie van kritische regulators beïnvloeden deze procedures voorzien van een risico op het induceren kunstmatige effecten ^5.

Om te onderzoeken hoe de SAC interfereert met APC / C-afhankelijke proteolyse van cycline B tijdens de mitose in onverstoorbaar celpopulaties, hebben we een histon H2-GFP-gebaseerd systeem waardoor de gelijktijdige monitoring van metafase afstemming van mitotische chromosomen en proteolyse van cycline B ⁶ .

Proteolytische profielen tonen, maakten wij een chimeer cycline B reporter molecuul met een C-terminale deel SNAP ⁶ (figuur 1). In een zelf-labelingsreactie, de SNAP-groep kan covalente bindingen vormen metalkylguanine-dragers (SNAP substraat) ^7,8 (figuur 1). SNAP substraatmoleculen zijn gemakkelijk verkrijgbaar en hebben een breed spectrum van verschillende fluorochromen. Chimere cycline B-SNAP moleculen worden gelabeld na toevoeging van het membraan doorlatend substraat SNAP het kweekmedium ⁷ (figuur 1). Na de labelingsreactie, de cycline B-SNAP fluorescentie-intensiteit druppels in een pulse-chase reactie-achtige wijze en fluorescentie-intensiteiten tijdens niveaus van cycline B afbraak ⁶ (figuur 1). Ons systeem vergemakkelijkt de controle op mitotische APC / C-afhankelijke Proteolyse in grote aantallen cellen (of meerdere celpopulaties) in parallel. Daardoor kan het systeem een ​​waardevol instrument om agenten / kleine moleculen die in staat zijn met proteolytische activiteit interfereren bij de metafase anafase om de overgang te identificeren. Bovendien is de synthese van cycline B tijdens mitose Onlangs werd een belangrijk mechanistischm in het bevorderen van een mitotische blok in muizen en mensen door het houden van cycline B expressie niveaus stabiel ^9,10, dit systeem ons in staat om cycline B proteolyse te analyseren als een element van een evenwichtige balans ^6.

Protocol

1. Zaaien van U2OS gebaseerde Cycline B-SNAP Reporter cellen (kloon 11 Cellen ⁶⁾ op Microscoop Chamber Slides

1. Trypsinize subconfluente SNAP reporter cellen mochten groeien asynchroon in logfase ten minste 48 uur.
2. Werken met 8 goed microscoop kamers (constante verdeling van cellen).

Voor het zaaien van cellen op 8 goed microscoop kamers met een constante verdeling over het gehele oppervlak van de microscoop kamer centrifuge 10.000 cellen en resuspendeer in 350 ul fenol rood-vrij normale groei medium (aangevuld met 10% foetaal runderserum, penicilline / streptomycine en natriumpyruvaat). Breng de celsuspensie microscoop kamer (figuur 2).

Werken met 8 goed microscoop kamers (maximaal celdichtheid in het midden).

Voor het zaaien van cellen op een hogere dichtheid in het centrum van de microscoop chambeh, laadt u de kamer met 300 ul fenol rood-vrij normale groei medium. Voorzichtig 5.000 cellen naar het centrum van de microscoop kamer (figuur 2).

Werken met 96 wells speciale optiek platen (constante verdeling van cellen).

Voor het zaaien van cellen op platen met 96 putjes bij een constante verdeling over het gehele oppervlak van de put, centrifugeer 5.000 cellen en resuspendeer in 300 ul fenol rood-vrij normaal kweekmedium. Breng de celsuspensie op een 96-well plaat. Afhankelijk van het totale aantal benodigde cellen bevattende wells, passen de cel aantal en het totale volume van de suspensie medium (figuur 2).

Werken met 96 putjes platen speciale optica (maximum celdichtheid in het midden).

Voor het zaaien van cellen op platen met 96 putjes, voorzichtig 1.500 cellen in 15 ul fenol rood-vrij normaal kweekmedium in een small druppel naar het midden van elk putje om beperking bereiken van celgroei in het midden van de put (figuur 2).

3. Toestaan ​​gezaaide cellen gedurende ten minste 18 uur groeien onder standaard celkweekomstandigheden (37 ° C, 100% luchtvochtigheid, _5% CO2).

2. Kleuring van Reporter Cellen met SNAP ondergrond

1. 30 min voor het begin van de kleuring mogelijk aliquots van fenolrood-vrij normaal kweekmedium op te warmen tot 37 ° C.
2. Voor de hantering van de SNAP substraat (in ons geval TMR ster) los TMR Star in DMSO tot een concentratie die in de stockoplossing van 400 uM, die kunnen worden opgeslagen bij -20 ° C.
3. Voorafgaand aan kleuring verdunnen 0,5 pi TMR Star voorraadoplossing in 200 ul fenol rood-vrij normaal kweekmedium (37 ° C) tot een uiteindelijke concentratie van 1 labeling urn.
4. Bij normale groeimedium van asynchroon groeiende cellen en incubeer in lAbeling medium gedurende 25 min onder standaard kweekomstandigheden.
5. Verwijder etikettering medium en wassen cellen vier keer met fenol rood-vrij normaal kweekmedium (37 ° C). Incubeer cellen in 300 ul fenol rood-vrij normaal kweekmedium (37 ° C) gedurende 30 minuten. Voorafgaand aan transport naar de microscoop vervangen met vers medium zonder fenolrood normaal kweekmedium (37 ° C) om de resterende ongebonden SNAP substraat te verwijderen.
6. Transportcellen de microscoop in een piepschuim doos op een voorverwarmde (37 ° C) warmteblok temperatuurvariatie te minimaliseren.

3. Meting van fluorescentie-intensiteit

1. Twee uur voor de analyse stel de temperatuur van de klimaatruimte bij 37 ° C in droge modus om het gehele microscoop met alle componenten te brengen op de gewenste temperatuur. Voorverwarmen voordat de luchtvochtigheid belangrijk te voorkomen condensatie en schade aan de microscoop.
2. Stel luchtvochtigheid to 60% en CO ₂ tot 5% voor de start van de analyse.
3. Start de scan ^ R Acquisition software en definiëren standaard instellingen (zie tabel 1).
4. Definieer de posities van de putjes te analyseren.
5. Definieer de At (verwerving cyclustijd) en het absolute aantal van de overname cycli.
6. Als een analyse van een groter aantal putten gewenst is, selecteer hardware autofocus, anders is het voldoende om alleen software autofocus gebruiken.
7. Start de overname en toezicht voor de eerste twee acquisitie cycli. De microscoop richt zich op de histone H2-GFP signaal met daaropvolgende acquisitie van een eerste beeld in dat kanaal voordat het filter wordt vervangen en de overeenkomstige TMR ster wordt verkregen (Figuur 3). Dit wordt herhaald voor alle posities in een goed en voor elk van de putjes te onderzoeken, voordat men weer de volgende cyclus.

4. Analyse van proteolytische profielen uzingen Scan ^ R

1. Start de Scan ^ R Analysis software en analyseren van de afbeeldingen met de celkernen, zoals die door histon H2-GFP, beschouwd als de belangrijkste object, met een drempel gebaseerd op signaalsterkte en waterscheiding algoritme te helpen bij het scheiden van naburige cellen. Een subobject bestaande uit een kern met cytoplasma wordt aangemaakt TMRstar analyse. (Belangrijke eigenschappen van het hoofddoel zijn X en Y-posities, de tijd, en de maximale en de gemiddelde intensiteit van GFP voor de belangrijkste object en de totale intensiteit gedeeld door gebied voor de TMRstar subobject.) Deze analyse proces kan enkele uren duren als gevolg van grote hoeveelheden gegevens hoeveelheden.
2. Naar de modus te traceren naar de subobject gemiddelde TMR Star fluorescentie-intensiteit in de tijd (cel sporen), toegewezen aan de geanalyseerde belangrijkste objecten (figuur 4) te visualiseren. Het aantal cellen te onderzoeken kunnen worden verkleind door gating op de metingen van ten minste 140 cycli met een hoge maximale intensiteit van H2-GFP. Op zoekbij grotere aantallen cellen kan een eerste representatieve en objectief beeld (figuur 4).
3. Selecteer een cel spoor van belang histone H2-GFP en TMR Star fluorescentie gelijktijdig te visualiseren op enkele cel (Figuur 5A).
4. Met behulp van de rechter muisknop op een cel van de rente en het genereren van een exporteerbaar fotogalerij ter illustratie van histon H2-GFP en cycline B-SNAP TMR-ster voor elke keer punt.
5. Ga naar de bevolking modus van de Scan ^ R Analyse software en de poort van de regio waar de cel van belang is vertegenwoordigd op de X vs Y dot plot (Figuur 5B).
6. Breng een nieuwe dot plot venster om de gated regio en visualiseren betekenen TMR Star fluorescentie-intensiteit in de tijd (Figuur 5C).
7. Gegevens exporteren (tijd en fluorescentie-intensiteit) naar Microsoft Excel voor verdere berekening.

5. Representatieve resultaten

Vijgure 5D en 5E tonen cycline B kinetiek, vertegenwoordigd door een TMR Star fluorescentie-intensiteit curve, van een cel die verloopt via een regelmatige mitose zonder tekenen van chromosomale afwijking (Figuur 5E). Bij verdichting van het cytoplasma na nucleaire envelop verdeling (NEBD, zoals aangegeven door de rode driehoek), TMR Star fluorescentie intensiteit laat een abrupte stijging tot isomorf venster (helder gedeelte van het diagram) wordt bereikt wanneer de cel binnenkomt prometafase ^6. Fluorescentie-intensiteit blijft op een stabiel niveau zolang de cel verloopt door profase metafase en begint snel na vallen alle chromosomen hebben een stabiele metafase plaat (figuur 5D en 5E). Deze daling gaat vooraf aan chromosoom scheiding bij anafase (blauwe stip op de curve). In het najaar van mitose het chromatine begint decondense aan (blauwe balken) en de cel neemt interfase morfologie, terwijl de fluorescentie-intensiteit curve benadert eenplateau die lager is dan het plateau voor mitose (figuur 5D en 5E).

Autofocus instellingen	Histon H2-GFP (hoofddoel overname-instellingen)	Cycline B-SNAP gelabeld met TMR Star (Verwerving instellingen)	Acquisitie cyclustijd Herhalingen
Grof autofocus + / -39 micrometer 24 Lagen Fijn autofocus + / -5,4 Micrometer 14 Lagen	GFP filter in te stellen: Sluitertijd: 100 ms Lichtintensiteit: 25%	TRITC filter in te stellen: Sluitertijd: 150 msec Lichtintensiteit: 33,3%	2 tot 5 min.
GFP filter in te stellen: Sluitertijd: 12 msec Lichtintensiteit: 12,5%			Tot 48 uur van verdere analyse (beperkt door verminderde vochtigheid van 60%)

Tabel 1. Standaardinstellingen zoals gebruikt voor de analyse van cycline B proteolyse. Histone H2-GFP werd gebruikt als referentie structuur om de focus vlak definiëren voor het meten van cycline B-SNAP fluorescentie-intensiteit. Lichtintensiteiten gedurende de focus procedure lager zijn in vergelijking met beeldacquisitie instellingen om cumulatieve fototoxiciteit te voorkomen.

Figuur 1. Schematische weergave van de meting van cycline B proteolyse door expressie van een chimeer cycline B derivaat met afbraak soortgelijke kenmerken als de endogene eiwit. De afname in fluorescentie-intensiteit na pulse-chase labeling is een maat APC / C-activiteit.

Figuur 2. Analyse van cellen op 8 en slides of 96 well platen. Verdeling van hetcellen over het oppervlak van de put bereikt door hersuspensie in een eindvolume van 300 pi en wordt aanbevolen, wanneer slechts een of een paar posities handmatig gedefinieerd voor analyse. Verrijking van cellen in het middengebied wordt bereikt door toevoeging van cellen naar het centrum van voorgevulde of lege putjes. Deze techniek wordt aanbevolen in geval van geautomatiseerde beeldacquisitie in verschillende putten.

Figuur 3. Volgorde van de data-acquisitie. A) Detectie van histon H2-GFP wordt gebruikt voor focus vliegtuig definitie en monitoring van chromosomale uitlijning tijdens de mitose. B) fluorescentie-intensiteit van de fluorescentie-intensiteit Star TMR is een maat voor de absolute hoeveelheid pulse-chase gelabeld cycline B-SNAP.

Figuur 4. Vertegenwoordiger Scan ^ R Analyse software-gebaseerde weergave van de gemiddelde TMR Starfluorescentie-intensiteiten (totaal TMRstar intensiteit gedeeld door gebied) tijd. selectie van een representatieve cel trace (blauw). De bijbehorende afbeeldingen (rechts afgebeeld) kan de gelijktijdige visualisatie van histon H2-GFP (groen) en cycline B-SNAP (rood). Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .

Figuur 5. A + B) Voorbeeld voor gating van punten die een cel van de rente op de XY-dot plot. C) Visualisatie van de gemiddelde TMRstar fluorescentie-intensiteit (totaal TMRstar intensiteit gedeeld door gebied) na verloop van tijd met behulp van de dot plot. D + E) Vertegenwoordiger fluorescentie-intensiteit curve van cycline B-SNAP met isomorfe venster (brigher veld op het schema) tussen NEBD (nucleaire envelop afbraak) en chromatine decondensatie (blauwe balk) zoals gegenereerd in Microsoft Excel. Anafase aangegeven met thij blauwe stip op de curve. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .

Film 1. Klik hier om aanvullende film te bekijken .

Discussie

We presenteren hier een live-cell imaging benadering het vergemakkelijken van de gelijktijdige bewaking van cycline B proteolyse en chromosoom uitlijning. Deze aanpak maakt het mogelijk de studie van de mitotische controle in celpopulaties onverstoorbaar op de enkele cel niveau. Cycline B afbraakcurven vergemakkelijken direct inzicht in de activiteit van de APC / C en daarmee indirect geven de status van de SAC ^6.

Deze benadering, hoewel vastgesteld op basis van de Scan ^ R softwa...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Naam van het product	Vennootschap	Catalogusnummer	Opmerkingen (optioneel)
Reporter cellijn	gegenereerd in-house zoals beschreven 6	klonen 11 verslaggever cellen (U2Os gebaseerde cycline B-SNAP expressie brengende cellen)
Retrovirale cycline B-SNAP expressievector	gegenereerd in-house zoals beschreven 6	pLNCX2-cycline B mut5-SNAP
Fenolrood-vrij DMEM	Gibco	21063-029	Suppletie met FCS, natriumpyruvaat, penicilline / strepto-mycin vereist
SNAP-Cell TMR-Star	New England Biolabs	S9105S	Voorraadoplossing in DMSO 400 uM
Speciale Opstics Plate, 96 en	Costar	3720
μ-Slide 8 goed, ibiTreat	Ibidi	80826
Microscopie eenheid	Olympus	IX-81 inverse microscoop met klimaatkamer
Objectief	Olympus	UPLSAPO 20x objectief (NA 0,75)
Acquisitie software	Olympus	Scan ^ R Acquisition software (v.2.2.09)
Analysis software	Olympus	Scan ^ R Analyse software (v.1.2.0.6)