We beschrijven een nieuwe werkwijze voor het isoleren van genomisch DNA uit volbloed voor plasma / serologie. Na het plasma, wordt de verdichte bloed meestal weggegooid. Onze nieuwe methode is een aanzienlijke verbetering ten opzichte van bestaande methoden en maakt DNA en plasma verkrijgbaar vanaf een enkele collectie, zonder daarvoor extra bloed.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Een praktische en nieuwe methode om Genomic DNA Uittreksel uit Bloedafname Kits voor Plasma Protein Preservation
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Laboratoriumonderzoek kan de cellulaire of vloeibare delen van het bloed. Het gebruik van verschillende bloedafnamebuisjes vastgesteld welk deel van het bloed dat kan worden geanalyseerd (volbloed, plasma of serum). Laboratoria betrokken bij het bestuderen van de genetische basis van menselijke aandoeningen afhankelijk anti-gecoaguleerd bloed in EDTA-bevattende vacutainer verzameld als bron van DNA voor genetische / genomische analyse. Omdat de meeste klinische laboratoria voeren biochemische, serologische en virale testen als een eerste stap in de fenotypische uitkomst onderzoek wordt ontstold bloed ook verzameld in heparine bevattende buis (plasma buis). Daarom als DNA en plasma nodig voor gelijktijdige en parallelle analyses van zowel genomische en proteomische gegevens, is het gebruikelijk om bloed te verzamelen in zowel EDTA en heparine buizen. Als bloed in een buis verzameld kunnen worden en dienen als een bron voor zowel plasma als DNA, zou deze werkwijze worden beschouwd als een plaatsing in bestaande methods. Het gebruik van het gecomprimeerde bloed plasma na extractie is een alternatieve bron van genomisch DNA, dus het minimaliseren van de hoeveelheid bloed monsters verwerkt en het aantal benodigde monsters van elke patiënt. Dit zou uiteindelijk bespaart tijd en middelen.
De BD-P100 bloedafnamesysteem voor plasma-eiwit conservering werden geschapen als een verbeterde methode ten opzichte van eerdere plasma of serum collectie buizen 1, om het eiwitgehalte van het bloed te stabiliseren, waardoor een betere eiwit biomarker ontdekking en proteomics experimenten uit menselijk bloed. De BD P100 buisjes bevatten 15,8 ml gesproeidroogde en gevriesdroogde K2EDTA eigen breed spectrum cocktail van proteaseremmers coagulatie te voorkomen en de plasma-eiwitten te stabiliseren. Ze hebben ook een mechanische afscheider, die een fysieke barrière tussen plasma en celpellets na centrifugeren biedt. Enkele werkwijzen zijn ontwikkeld om DNA extraheren uit gestold bloed samples opgevangen in oude plasma buizen 2-4. Uitdagingen deze methoden werden voornamelijk geassocieerd met het type afscheider in de buizen (gel separator) en inclusief moeite terugwinnen van het gestolde bloed, het ongemak te fragmenteren of dispergeren van de klonter en obstructie van de klonter extractie van de gel.
We presenteren de eerste methode die extracten en zuivert genomisch DNA uit bloed getrokken in de nieuwe BD-P100 buizen. Wij vergelijken de kwaliteit van het DNA monster van P100 buizen die uit EDTA-buisjes. Onze benadering is eenvoudig en efficiënt. Het gaat om vier grote stappen als volgt: 1) het gebruik van een plasma BD P100 (BD Diagnostics, Sparks, MD, USA) buis met mechanische afscheider voor bloedafname, 2) de verwijdering van de mechanische afscheider met een combinatie van sucrose en een steriele paperclip metalen haak 3) het scheiden van de buffy coat laag die de witte cellen en 4) het isoleren van het genomische DNA van debuffy coat met een gewone commerciële DNA-extractie kit of een vergelijkbare standaard protocol.
Protocol
1. Monsterneming
- Verzamelen bloedmonsters van mensen met de juiste informed consent. Voor elk individu, trekken 4 à 5 ml bloed in een buisje P100 (BD Diagnostics, Franklin Lake, NY, USA). Ter vergelijking, gelijktijdig afnemen van bloed in een EDTA-buis.
- De BD P100 buisjes bevatten 15,8 ml gesproeidroogde en gevriesdroogde K2EDTA eigen breed spectrum cocktail van proteaseremmers coagulatie te voorkomen en de plasma-eiwitten te stabiliseren. Ze bevatten ook een mechanische afscheider. Na het verzamelen van het bloed, houd beide buizen bij kamertemperatuur gedurende 60 minuten 's nachts tot de bewerking.
- Centrifugeer de buizen bij BD P100 2500 g gedurende vijftien minuten bij kamertemperatuur. Breng de boven de mechanische afscheider in micro centrifuge buizen ingezameld plasma.
- Bewaar de P100 buizen, met daarin het bloed verdicht onder de afscheider, bij -80 ° C totdat u klaar bent om te beginnen met de DNA-ext zijnraction.
2.1 Van het bloed van P100 buis (P100_DNA)
- De P100 buizen worden opgeslagen bij -80 ° C na extractie plasma. Binnen 3 tot 4 maanden, halen de P100 buis met het verdichte bloed uit de vriezer en ontdooien bij 37 ° C in een waterbad gedurende 5 min (Figuur 1A). Verwijder eventuele resterende plasma dat zit boven de afscheider. Voeg 2 ml van 17% sucrose-oplossing (gradiënt oplossing getest in huis - niet gepubliceerde gegevens) in de P100 buizen boven de separator (Figuur 1B). Centrifugeer de buizen bij kamertemperatuur gedurende 20 min bij 2500 g, een proces duwt de mechanische afscheider naar de top van de buis en levert drie lagen oplossing zoals de bufferlaag (figuur 1C). Handmatig uit te pakken de separator met een steriled verslaafd metalen paperclip (figuur 1D).
- Na het ophalen van de mechanische afscheider van elke buis (figuur 1D), te verwijderen en Discard de bovenste sucrose laag. Breng de middelste laag, die de buffy coat (BC)-laag, in een steriele 15 ml conische buis. Voeg fosfaatbuffer zoutoplossing (PBS) om de bufferlaag volume verhogen tot 3 ml. Extraheer het DNA van de bufferlaag met reagentia van Qiagen Puregene Blood Kit volgens aanbevelingen van de fabrikant, behalve een centrifugeersnelheid van 2500 g (in plaats van 2000 g).
- Te lyseren en verwijder de rode bloedcellen (RBC), voeg 9 ml RBC lysis tot 3 ml buffycoat. Inverteer elke buis meerdere malen en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten met af en toe omkeren tijdens incubatie. Spin elk mengsel neer op 2500 g gedurende 5 minuten en gooi het supernatant. Behandel de overblijvende pellet in elk buisje met 3 ml lysis-oplossing en vortex gedurende 15 seconden. Behandel het lysaat met 1 ml eiwit precipitatieoplossing en vortex gedurende 15 seconden.
- Centrifugeer bij 2500 g gedurende 5 minuten en breng het supernatans in een frisse 15 ml conische buis met3 ml 100% isopropanol. Inverteer de nieuwe buisjes 10 keer en centrifugeer bij 2500 g gedurende 3 minuten. Verwijder het supernatant en voeg 1 ml 70% ethanol. Keer de conische buizen een paar keer te verjagen en was de DNA-pellet. Centrifugeer bij 2500 g gedurende 1 minuut. De pellet drogen gedurende 3 minuten (plaats de buis ondersteboven) bij kamertemperatuur en vervolgens opschorten DNA met 250 ml rehydratatie oplossing bij 37 ° C gedurende 10 minuten en overbrengen in een pre-gelabelde 1,7 ml microbuisjes. Bewaar de flesjes bij -80 ° C tot gebruik.
2.2 Van het bloed van EDTA Ttube (EDTA_DNA)
- De volbloed immunohematology routine testen verzameld in plastic buizen vaccutainer spray gecoat met 10,8 mg K2 EDTA en opgeslagen bij -80 ° C. Omdat de buizen geen mechanische afscheider bevatten, wordt de DNA-extractie niet de stappen omvatten waarbij de mechanische afscheider (2.1.1 en 2.1.2).
- Binnen 3 tot 4 maanden opslag van bloed, de DNA wordt geëxtraheerd met behulp van de KingFisher Flex (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Het is een automatiseringssysteem DNA extractie gebaseerd op magnetisch techniek en bestaat cellysis / DNA binding, verscheidene wasstappen en DNA elutie.
- De kit gebruikt in de DNA-extractie is de KingFisher Flex 24 Blood DNA kit (Qiagen, Duitsland).
3. DNA Kwantiteit en kwaliteit Assessment
De hoeveelheid, de kwaliteit en integriteit van het genomisch DNA werd bepaald door een combinatie van methode picogreen, spectroscopie en elektroforese omvat.
- De concentratie van het genomische DNA wordt bepaald door kwantificering Nanodrop en picogreen.
- De zuiverheid wordt bepaald uit de 260/280 verhoudingsmeting de Nanodrop spectrofotometer.
- Het monster (500 ng) wordt ook op 1% agarosegel geladen om de integriteit (afbraak) van het DNA te beoordelen.
4. Genotyping Testen en Quality Control
- Vijf P100_DNA en hun bijbehorende EDTA_DNA monsters worden willekeurig geselecteerd voor verdere analyse met behulp van de aangepaste Immunochip (Immuno DNA Analysis BeadChip). Immunochip is een Infinium genotypering chip met daarin 196.524 polymorfismen en is ontworpen voor immunogenetische studies 5.
- Voor elk monster wordt 200 ng DNA geamplificeerd, gefragmenteerd, geprecipiteerd en geresuspendeerd in het geschikte hybridisatiebuffer.
- De gedenatureerde monsters worden gehybridiseerd op Immunochips bij 48 ° C gedurende minimaal 16 uur.
- Na hybridisatie worden de Immunochips verwerkt voor single-base extensie reacties en gekleurd.
- De immunochips worden vervolgens afgebeeld met behulp van Illumina Hiscan Bead-array-lezer en de genormaliseerde kraal intensiteit data wordt in de Illumina GenomeStudio software geladen en omgezet in genotypen. Genotypen worden genoemd met de autocalling algoritme van GenomeStudio. De kwaliteitscontrolevolves uitsluiting van single nucleotide polymorfismen (SNP's) met een oproep van <95%.
- De SNP gesprekstarief wordt gebruikt als een maat voor de efficiëntie immunochip assay. Het wordt berekend als het percentage van het totale aantal assays op de chip (196.524 SNPs gecodeerd op elke chip) voldoende signaalsterkte en kwaliteit te bereiken een geautomatiseerd genotype opdracht ontvangt. Hoge kwaliteit DNA (260/280 verhouding van 1,8 of hoger en afwezigheid van afbraak) zal naar verwachting ten minste dezelfde call rate bereikt de HapMap control DNA in de immunochip assay. Kwaliteitscontrole impliceert uitsluiting van SNPs met een oproep percentage <95% in elke dataset.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
DNA kwaliteitsbeoordeling en meting van de concentratie
De opbrengsten van P100_DNAs waren significant lager dan die van EDTA_DNAs (tabellen 1 en 2). De DNA zuiverheid vertegenwoordigd door de 260/280 verhoudingswaarde gelijk voor zowel P100_DNA en EDTA_DNA sample set (tabellen 1 en 2). De kwaliteit van het DNA globaal eenzelfde elk pakket monster hoewel sommige afbraak wordt gezien in de EDTA_DNA monsters, zoals aangegeven doo...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Vele menselijke ziekten hebben genetische oorzaken en onderzoeken de genetische basis van menselijke ziekten vereist een toenemende hoge kwaliteit DNA. De meest voorkomende bron van DNA gebruikt in genetische studies wordt anticoagulated volbloed. Omdat de meeste klinische laboratoria voeren biochemische, serologische, en virale testen als een eerste stap in de fenotypische uitkomst onderzoek, wordt het bloed vaak opgevangen in een plasma buis. Na het verzamelen van het plasma, wordt de verdichte bloed vaak weggegooid. ...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Geen belangenconflicten verklaard.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| BD P100 buizen | BD Diagnostics | 366448 | |
| EDTA buizen | BD Diagnostics | 367863 | |
| Sucrose | Sigma | S9378 | |
| Paperclip | Kantoorartikel | ||
| 15 ml buis | Corning | 430052 | |
| Rode bloedcellen (RBC) | Qiagen | 158389 (kit) | |
| Fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) | Thermo Scientific | SH30256.01 | |
| BioSprint 96 DNA Blood Kit (48) | Qiagen | 940054 | |
| 1,7 ml microtubes | Axygen | MCT-175-C | |
| Human Immuno DNA Analysis BeadChip Kit | Illumina | WG-352-1001 | |
| Bead array reader | Illumina | NA | |
| GenomeStudio Software | Illumina | N/A |
Referenties
- Yi, J., Kim, C., Gelfand, C. A. Inhibition of intrinsic proteolytic activities moderates preanalytical variability and instability of human plasma. Journal of Proteome Research. 6, 1768-1781 (2007).
- Garg, U. C., Hanson, N. Q., Tsai, M. Y., Eckfeldt, J. H. Simple and rapid method for extraction of DNA from fresh and cryopreserved clotted human blood. Clinical Chemistry. 42, 647-648 (1996).
- Salazar, L. A., Hirata, M. H., Cavalli, S. A., Machado, M. O., Hirata, R. D. Optimized procedure for DNA isolation from fresh and cryopreserved clotted human blood useful in clinical molecular testing. Clinical Chemistry. 44, 1748-1750 (1998).
- Xu, R., Ye, P., Luo, L., Wu, H., Dong, J., Deng, X. A simple and efficient method for DNA purification from samples of highly clotted blood. Molecular Biotechnology. 46, 258-264 (2010).
- Cortes, A., Brown, M. A. Promise and pitfalls of the Immunochip. Arthritis Research & Therapy. 13, 101(2011).
- Basuni, A. A., Butterworth, L. A., Cooksley, G., Locarnini, S., Carman, W. F. An efficient extraction method from blood clots for studies requiring both host and viral DNA. Journal of Viral Hepatitis. 7, 241-243 (2000).
- Kanai, N., Fujii, T., Saito, K., Tokoyama, T. Rapid and simple method for preparation of genomic DNA from easily obtainable clotted blood. Journal of Clinical Pathology. 47, 1043-1044 (1994).
- Adkins, K. K., Strom, D. A., Jacobson, T. E., Seemann, C. R., O'Brien, D. P., Heath, E. M. Utilizing genomic DNA purified from clotted blood samples for single nucleotide polymorphism genotyping. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 126, 266-270 (2002).
- Siafakas, N., Burnett, L., Bennetts, B., Proos, A. Nonenzymatic extraction of DNA from blood collected into serum separator tubes. Clinical Chemistry. 41, 1045-1046 (1995).
- Everson, R. B., Mass, M. J., Gallagher, J. E., Musser, C., Dalzell, J. Extraction of DNA from cryopreserved clotted human blood. BioTechniques. 15, 18-20 (1993).
- Se Fum Wong, S., Kuei, J. J., Prasad, N., Agonafer, E., Mendoza, G. A., Pemberton, T. J., Patel, P. I. A simple method for DNA isolation from clotted blood extricated rapidly from serum separator tubes. Clin. Chem. 53, 522-524 (2007).
- Garg, U. C., Hanson, N. Q., Tsai, M. Y., Eckfeldt, J. H. Simple and rapid method for extraction of DNA from fresh and cryopreserved clotted human blood. Clin. Chem. 42, 647-648 (1996).
- Salazar, L. A., Hirata, M. H., Cavalli, S. A., Machado, M. O., Hirata, R. D. Optimized procedure for DNA isolation from fresh and cryopreserved clotted human blood useful in clinical molecular testing. Clin. Chem. 44, 1748-1750 (1998).
- Matheson, L. A., Duong, T. T., Rosenberg, A. M., Yeung, R. S. Assessment of sample collection and storage methods for multicenter immunologic research in children. Journal of Immunological Methods. 339, 82-89 (2008).
- Xu, R., Ye, P., Luo, L., Wu, H., Dong, J., Deng, X. A simple and efficient method for DNA purification from samples of highly clotted blood. Mol. Biotechnol. 46, 258-264 (2010).
- Polychronakos, C. Fine points in mapping autoimmunity. Nature. 43, 1173-1174 (2011).
- Cooper, J. D., Simmonds, M. J., Walker, N. M., Burren, O., Brand, O. J., Guo, H., Wallace, C., Stevens, H., Coleman, G., Franklyn, J. A., Todd, J. A., Gough, S. C. Seven newly identified loci for autoimmune thyroid disease. Human Molecular Genetics. , (2012).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
