Bacteriële Detection & Identification gebruiken elektrochemische sensoren

Samenvatting

We beschrijven een elektrochemische sensor bepalingsmethode voor snelle bacteriële detectie en identificatie. De bepaling omvat een sensor-array gefunctionaliseerd met DNA oligonucleotide capture probes voor ribosomaal RNA (rRNA) species-specifieke sequenties. Sandwich hybridisatie van doelwit rRNA met de invangingsprobe en een mierikswortel peroxidase-linked DNA-oligonucleotide probe detector produceert een meetbare amperometrisch stroom.

Samenvatting

Elektrochemische sensoren worden veel gebruikt voor snelle en nauwkeurige meting van bloedglucose en kan worden aangepast voor de detectie van een groot aantal analyten. Elektrochemische sensoren werken door transducing een biologische gebeurtenis erkenning tot een bruikbaar elektrisch signaal. Signaaltransductie vindt plaats door het koppelen van de activiteit van een redox-enzym een ​​amperometrische elektrode. Sensor specificiteit ofwel inherent aan het enzym glucose oxidase in het geval van een glucose sensor, of een product van de koppeling tussen het enzym en een antilichaam of probe.

Hier beschrijven we een elektrochemische sensor testwerkwijze direct detecteren en identificeren van bacteriën. In alle gevallen, de hier beschreven probes DNA oligonucleotiden. Deze methode is gebaseerd op de sandwich hybridisatie van afvang en detector sondes met een doelgroep van ribosomaal RNA (rRNA). De capture probe is verankerd aan het sensoroppervlak, terwijl de detector probe is gekoppeld aan horseradish peroxidase (HRP). Wanneer een substraat zoals 3,3 ', 5,5'-tetramethylbenzidine (TMB) werd toegevoegd aan een elektrode met capture-detector-target complexen gebonden aan het oppervlak, wordt het substraat geoxideerd door HRP en verminderd met de werkelektrode. Deze redox cyclus resulteert in shuttling van elektronen door het substraat van de elektrode naar HRP, produceren stroom door de elektrode.

Inleiding

Gebruik rRNA als doelmolecuul voor bacteriële detectie en identificatie heeft een aantal voordelen. De overvloed van rRNA in bacteriële cellen voorziet in een gevoeligheidslimiet zo laag als 250 bacteriën per milliliter zonder dat doelamplificatie ^1. Bacteriële rRNA bevat unieke soort-specifieke sequenties die toegankelijk zijn voor hybridisatie met DNA probes. Bijgevolg kan een reeks van elektrochemische sensoren worden gebruikt om onbekende bacteriën, waarbij elke sensor is gefunctionaliseerd met een ander species-specifiek capture probe te identificeren. Positieve controle sensoren moeten worden opgenomen voor een synthetisch oligonucleotide doel dat "bruggen" het vangen en sondes detector een interne kalibratie-signaal te creëren.

Elektrochemische sensoren hebben een breed scala van fundamenteel en translationeel onderzoek toepassingen. Bijvoorbeeld, de assay beschreven is gebruikt om het effect van E. nauwkeurig te meten coli groeifase op RRNA en pre-rRNA aantallen kopieën, die van groot belang voor onderzoekers geïnteresseerd in bacteriële fysiologie ^2. De gevoeligheid van de elektrochemische sensor assay wordt bepaald door de signaal-ruisverhouding. Een verscheidenheid van signaalversterking en methoden ruisonderdrukking zijn onderzocht. We zien dat verbetering van de chemie van het sensoroppervlak is de sleutel tot het verminderen van niet-specifieke binding van detector probe en / of HRP enzym. Met name is een gemengde monolaag van alkanedithiols en mercaptohexanol gebleken achtergrond beperken door het elektrodeoppervlak geheel behoud toegankelijkheid van de capture probe voor hybridisatie doel ^3. Deze oppervlakte chemie behandelingen zijn bijzonder belangrijk voor testen met een complexe biologische monsters.

Protocol

1. Functionaliseringen van elektrochemische sensoren

1. Bereid de gethioleerde capture probe in een concentratie van 0,05 uM in 300 uM 1,6-hexaandithiol (HDT), 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 0,3 M NaCl, 1 mM EDTA en incubeer in het donker bij kamertemperatuur gedurende 10 min . Incubatie van de gethioleerde vangprobe met HDT zodat de thiolgroep op de vangprobe wordt verminderd, wat resulteert in meer consistente resultaten.
2. Breng een stroom stikstof tot kale goud 16 sensor-array chip (en) voor 5 sec om vocht te verwijderen en / of deeltjes.
3. Breng 6 ul van de HDT-gethioleerde capture probe-mengsel voor de werkelektrode van 16 sensoren van de sensor array en bewaar de sensor chip (s) in een bedekte petrischaal bij 4 ° C overnacht. Gethioleerde vangprobes binden rechtstreeks aan de kale goud elektrode en de HDT handelt om overpacking van de vangprobes te voorkomen en bewaar ze in een verlengde conformatie die hybridisatie bevordert met de doelgroep.
4. Devolgende dag was de sensorchip met gedeïoniseerd _H2O 2-3 seconden en onder een droge stikstofstroom gedurende 5 sec.
5. Breng 6 pl 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 0,3 M NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM 6-mercapto-1-hexanol (MCH) de werkelektrode van 16 sensoren en incubeer gedurende 50 minuten. Deze en alle volgende sensorchip incubaties worden uitgevoerd in een afgedekte petrischaal bij kamertemperatuur. MCH fungeert als blokkeermiddel, vullen de openingen wanneer de gethioleerde vangprobe of HDT niet aanwezig op het elektrodeoppervlak.

2. Monstervoorbereiding

1. Breng 1 ml bacteriekweek in de log fase van groei (OD ₆₀₀ ≈ 0,1) een microcentrifugebuis en centrifugeer bij 16.000 xg gedurende 5 minuten. Verwijder het supernatant. De bacteriële pellet kan onmiddellijk worden verwerkt of bewaard bij -80 ° C voor later gebruik.
2. Grondig resuspendeer de bacteriële pellet in 10 gl 1 M NaOH door toepassing van de pipetpunt het bottom van de microcentrifugebuis en en neer te pipetteren meerdere malen. Incubeer de suspensie bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten.
3. Neutraliseer het bacteriële lysaat door toevoeging van 50 ui 1 M fosfaatbuffer, pH 7,2, bevattende 2,5% runderserumalbumine (BSA) en 0,25 mM van fluoresceïne gemodificeerde detector probe. Incubeer de geneutraliseerd lysaat gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Fluoresceïne-gemodificeerde probes detector hybridiseren met bacteriële rRNA-moleculen.

3. Elektrochemische sensor Assay

1. Was de MCH van de sensorchip met gedeïoniseerd _H2O 2-3 seconden en drogen onder een stroom van stikstof gedurende 5 sec.
2. Breng 4 pl geneutraliseerd bacterieel lysaat van de werkelektrode van elk van 14 sensoren en incubeer gedurende 15 minuten. Target-detector probe complexen hybridiseren aan geïmmobiliseerd gethioleerde vangprobes.
3. Breng 4 pi 1 nM overbruggen oligonucleotide in 1 M fosfaatbuffer, pH 7,2, die 2,5% BSA en 0,25 μ M fluoresceïne-gemodificeerde detector sonde naar 2 positieve controle sensoren (gebruikt voor signaal normalisatie) en incubeer gedurende 15 minuten.
4. Was de sensorchip met gedeïoniseerd _H2O 2-3 seconden en drogen onder een stroom van stikstof gedurende 5 sec.
5. Breng 4 ui 0,5 U / ml anti-fluoresceïne-HRP in 1 M fosfaatbuffer, pH 7,2, dat 0,5% caseïne de werkelektrode van 16 sensoren en incubeer gedurende 15 minuten. De anti-fluoresceïne-HRP bindt aan de geïmmobiliseerde fluoresceïne gemodificeerde probes detector.
6. Was de sensorchip met gedeïoniseerd _H2O 2-3 seconden en drogen onder een stroom van stikstof gedurende 5 sec.
7. Breng een film goed sticker op het oppervlak van de sensor chip en lading in de sensor chip mount. Pipetteer 50 ul van TMB substraat op alle 16 sensoren en sluit de sensor chip mount.
8. Verkrijgen amperometrie en cyclische voltammetrie metingen voor alle 16 sensoren met behulp van het Helios Chiplezer. Amperometrische stroom is proportioneel aan de TMB reduction op de sensor oppervlak (zie figuur 1).

Resultaten

We beschrijven een elektrochemische test die gelijk is gestructureerd om een ​​sandwich ELISA. Zoals getoond in figuur 1, doel ribosomaal RNA (rRNA) hybridisatie met capture detector en probes wordt ontwikkeld door een redox reactie gekatalyseerd door HRP geconjugeerd aan anti-fluoresceïne antilichaam fragmenten die binden aan het 3'-fluoresceïne koppeling op de detector probe. Een belangrijk onderdeel van assaygevoeligheid is de oppervlaktechemie van de goudelektrode. Wij hebben gevonden dat een te...

Discussie

De elektrochemische sensor assay beschreven maakt een snelle detectie van nucleïnezuurdoelen. Sensitiviteit en specificiteit hangen gedeeltelijk van de vrije energie van target-probe hybridisatie, op zijn beurt afhankelijk van de lengte en het GC-gehalte van de opname en probes detector. We meestal uit te voeren de stappen hybridisatie bij kamertemperatuur (~ 20 ° C) ^{5, 6.} De stappen hybridisatie (3.2 en 3.3) kan worden bij hogere temperaturen in een hybridisatie oven uitgevoerd als de chip wordt geplaatst in...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
6-mercapto-1-hexanol (MCH)	Sigma	451088	Bewaar op kamertemperatuur
1,6-hexanedithiol (HDT)	Sigma	H-12005	Bewaar op kamertemperatuur
Thiolated capture probes	Operon	N/A	Bewaar op 100 μM in 0,1x TE bij -20 °C
Fluoresceïne-gemodificeerde detector probes	Operon	N/A	Bewaar op 100 μM in 0,1x TE bij -20 °C
Bridging Oligonucleotide	Operon	N/A	Bewaar op 100 μM in 0,1x TE bij -20 °C
Anti-Fluoresceïne-HRP, Fab fragmenten	Roche	11 426 346 910	Bewaar op 4 °C
Helios Chip Reader	GeneFluidics	GFR-2009
Sensor Chip Mount	GeneFluidics	GFR-003
Film well sticker	GeneFluidics		Verstuurd met sensor chips
Bare gold 16-sensor array chips	GeneFluidics	SC1000-16X-B	Bewaar in 100% N2 op kamertemperatuur
Bovine Serum Albumin	Sigma	A7906	Bewaar op 4 °C
1M Fosfaatbuffer, pH 7.2			0,35M NaH2PO4, 0,65M K2HPO4, aangepast naar pH 7,2
Blocker Casein in PBS	Pierce	37528	Verdun met een gelijk volume van 1M Fosfaatbuffer, pH 7,2, bewaar op 4 °C
Tabel 1. Reagentia en apparatuur.