RNA-seq Analyse van transcriptomen in trombine-behandelde en Control Human Pulmonary microvasculaire endotheelcellen

Summary

Dit protocol geeft een volledige en gedetailleerde procedure voor RNA-seq, een krachtige volgende generatie DNA sequencing technologie, toepassing profiel transcriptomen in menselijke long microvasculaire endotheliale cellen met of zonder behandeling trombine. Dit protocol is generaliseerbaar verschillende cellen of weefsels die door verschillende reagentia of ziekten.

Abstract

De karakterisering van genexpressie in cellen via meting van de mRNA niveaus is een nuttig hulpmiddel bij het ​​bepalen hoe de transcriptionele machinerie van de cel wordt beïnvloed door externe signalen (bijv. behandeling met geneesmiddelen), of hoe cellen verschillen tussen een gezonde toestand en een zieke toestand. Met de komst en continue verfijning van de volgende generatie DNA-sequencing technologie, heeft RNA-sequencing (RNA-seq) uitgegroeid tot een steeds populaire methode van transcriptoom analyse van alle soorten van transcripten in de catalogus van de transcriptionele structuur van alle uitgedrukte genen te bepalen en te kwantificeren de veranderende expressie van het geheel van transcripten in een bepaalde cel, weefsel of organisme ^1,2. RNA-seq vervangt geleidelijk DNA microarrays een voorkeurswerkwijze voor transcriptoom omdat het de voordelen van profileren is volledig transcriptoom, die een digitaal type datum (kopienummer van elke transcript) en niet vertrouwen op bekende genomische sequence ^3.

Hier presenteren we een volledig en gedetailleerd protocol om RNA-seq van toepassing op het profiel transcriptomen in de menselijke long microvasculaire endotheelcellen met of zonder trombine behandeling. Dit protocol is gebaseerd op recent gepubliceerde studie getiteld "RNA-seq onthult Novel Transcriptome van genen en hun isovormen in menselijke pulmonaire microvasculaire endotheelcellen behandeld met trombine" ⁴ waarbij we succesvol uitgevoerde eerste volledige transcriptoomanalyse van menselijke long microvasculaire endotheelcellen behandeld met trombine met RNA-seq. Het leverde ongekende bronnen voor verdere experimenten om inzicht te krijgen in de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan trombine gemedieerde endotheel dysfunctie in de pathogenese van inflammatoire aandoeningen, kanker, diabetes en hart-en vaatziekten, en biedt potentiële nieuwe aanknopingspunten voor therapeutische doelen voor deze ziekten.

De beschrijvende tekst van dit protocolis verdeeld in vier delen. Het eerste deel beschrijft de behandeling van menselijke long microvasculaire endotheelcellen met trombine en RNA isolatie, kwaliteit en kwantificering. Het tweede deel beschrijft bibliotheek bouw en sequencing. Het derde deel beschrijft de data-analyse. Het vierde deel beschrijft een RT-PCR-validatie test. Representatieve resultaten van een aantal belangrijke stappen worden weergegeven. Nuttige tips of voorzorgsmaatregelen voor succes in belangrijke stappen te stimuleren worden in de discussie sectie. Hoewel dit protocol gebruikt de menselijke long microvasculaire endotheelcellen behandeld met trombine kan worden gegeneraliseerd naar profiel transcriptomen in zowel zoogdieren en niet-zoogdiercellen en in weefsels behandeld met verschillende stimuli of inhibitoren of transcriptomen vergelijken in cellen of weefsels van een gezonde toestand en een ziektetoestand.

Protocol

Een stroomdiagram waarin dit protocol wordt weergegeven in figuur 1.

1. Behandeling van cellen met trombine, RNA-isolatie, kwaliteitsbeoordeling en Kwantificering van RNA

1. Cultuur humane long microvasculaire endotheelcellen (HMVEC-LBL) tot 90-100% confluentie in 6-well platen in EGM-2 medium met 5% FBS, groeifactoren en antibiotica (Lonza, cat # CC-3202).
2. Veranderingsmedia de honger media (0% FBS) 30 min vóór de behandeling met trombine.
3. Behandel de cellen met 0,05 U / ml trombine of laat onbehandeld als controle gedurende 6 uur bij 37 ° C en _5% CO2.
4. Isoleer totaal RNA....

Results

Voor Stap 1: de 28S: 18s verhouding wordt traditioneel gebruikt als indicator van RNA degradatie. Idealiter 28S piek moet ongeveer tweemaal het gebied van het 18S band (een verhouding van 2) hebben, maar dit is vaak niet ideale verhouding gezien in de praktijk. Bovendien 28s: 18s kan verkregen waarde van spectrofotometrische methoden onderschatten de hoeveelheid degradatie van het RNA. Nauwkeuriger kwantificeren de afbraak en dus de kwaliteit van het RNA monster Experion het systeem berekent een RNA kwa.......

Discussion

Belangrijke stappen

RNA Handling: RNasen zal zelfs degraderen de meest hoogwaardige RNA, dus zorg moet genomen tijdens de isolatie, de opslag en het gebruik van RNA ¹⁰ worden. Handschoenen worden altijd gedragen om verontreiniging te voorkomen door RNasen gevonden op de menselijke handen. Handschoenen moeten vaak worden gewijzigd, met name na het aanraken van de huid, deurknoppen en andere gangbare ondergronden. Een set van pipetten dienen uitsluitend gewijd aan het .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagentia of Uitrustingen	Vennootschap	Catalogusnummer	Reacties
Humane long microvasculaire endotheelcellen	Lonza	CC-2815
Lonza, Bullet Kit	Lonza	CC-3202	Bevat EGM-2, FBS, groeifactoren en antibiotica
Trombine	Sigma	T4393
Ambion mir Vana Kit	Life Technologies	AM 1560
RNase-Zap	Life Technologies	AM9782
Experion StdSens RNA	Bio-Rad	700-7103
TruSeq RNA BereidingUitrusting	Illumina	FC-122-1001
AMPureXP Beads	Beckman Coulter	A63881
Superscript reverse transcriptase II	Life Technologies	18064-014
Experion DNA 1K	Bio-Rad	700-7107
QuantiTect SyberGreen	Qiagen	204163
PE Cluster Generation Kit	Illumina	PE-401-3001
PhiX Control Kit	Illumina	FC110-301
200 Cyclus SBS Kit	Illumina	FC-401-3001
HiScanSQ *	Illumina	SY-103-2001
CBOT	Illumina	SY-301-2002
qPCR machine - Viia7	Life Technologies	Model # VIIA7 / Apparatuur # 10631261	Of gelijkwaardig
Experion System	Bio Rad	7007001	Bioanalyzer is een alternatief systeem
Spectrofotometer	Bio-Tek	Epoch Microplate Spectrofotometer	Of gelijkwaardig
Centrifuge - Sorvall Legend XTR	Thermo Scientific	75004521	Of gelijkwaardig
Magnetische standaard	Life Technologies	AM10027
96-wells thermocycler	General Lab Leverancier
			Tabel 3. Lijst van Key Reagentia en Major Eapparatuur in. *, In de video, werd HiSeq1000 in plaats van HiScanSQ aangetoond.