Methodenartikel

RNA-seq Analyse van transcriptomen in trombine-behandelde en Control Human Pulmonary microvasculaire endotheelcellen

DOI:

10.3791/4393

⸱

13 februari 2013

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Children's Mercy Hospital and Clinics, School of Medicine, University of Missouri-Kansas City

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol geeft een volledige en gedetailleerde procedure voor RNA-seq, een krachtige volgende generatie DNA sequencing technologie, toepassing profiel transcriptomen in menselijke long microvasculaire endotheliale cellen met of zonder behandeling trombine. Dit protocol is generaliseerbaar verschillende cellen of weefsels die door verschillende reagentia of ziekten.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De karakterisering van genexpressie in cellen via meting van de mRNA niveaus is een nuttig hulpmiddel bij het ​​bepalen hoe de transcriptionele machinerie van de cel wordt beïnvloed door externe signalen (bijv. behandeling met geneesmiddelen), of hoe cellen verschillen tussen een gezonde toestand en een zieke toestand. Met de komst en continue verfijning van de volgende generatie DNA-sequencing technologie, heeft RNA-sequencing (RNA-seq) uitgegroeid tot een steeds populaire methode van transcriptoom analyse van alle soorten van transcripten in de catalogus van de transcriptionele structuur van alle uitgedrukte genen te bepalen en te kwantificeren de veranderende expressie van het geheel van transcripten in een bepaalde cel, weefsel of organisme 1,2. RNA-seq vervangt geleidelijk DNA microarrays een voorkeurswerkwijze voor transcriptoom omdat het de voordelen van profileren is volledig transcriptoom, die een digitaal type datum (kopienummer van elke transcript) en niet vertrouwen op bekende genomische sequence 3.

Hier presenteren we een volledig en gedetailleerd protocol om RNA-seq van toepassing op het profiel transcriptomen in de menselijke long microvasculaire endotheelcellen met of zonder trombine behandeling. Dit protocol is gebaseerd op recent gepubliceerde studie getiteld "RNA-seq onthult Novel Transcriptome van genen en hun isovormen in menselijke pulmonaire microvasculaire endotheelcellen behandeld met trombine" 4 waarbij we succesvol uitgevoerde eerste volledige transcriptoomanalyse van menselijke long microvasculaire endotheelcellen behandeld met trombine met RNA-seq. Het leverde ongekende bronnen voor verdere experimenten om inzicht te krijgen in de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan trombine gemedieerde endotheel dysfunctie in de pathogenese van inflammatoire aandoeningen, kanker, diabetes en hart-en vaatziekten, en biedt potentiële nieuwe aanknopingspunten voor therapeutische doelen voor deze ziekten.

De beschrijvende tekst van dit protocolis verdeeld in vier delen. Het eerste deel beschrijft de behandeling van menselijke long microvasculaire endotheelcellen met trombine en RNA isolatie, kwaliteit en kwantificering. Het tweede deel beschrijft bibliotheek bouw en sequencing. Het derde deel beschrijft de data-analyse. Het vierde deel beschrijft een RT-PCR-validatie test. Representatieve resultaten van een aantal belangrijke stappen worden weergegeven. Nuttige tips of voorzorgsmaatregelen voor succes in belangrijke stappen te stimuleren worden in de discussie sectie. Hoewel dit protocol gebruikt de menselijke long microvasculaire endotheelcellen behandeld met trombine kan worden gegeneraliseerd naar profiel transcriptomen in zowel zoogdieren en niet-zoogdiercellen en in weefsels behandeld met verschillende stimuli of inhibitoren of transcriptomen vergelijken in cellen of weefsels van een gezonde toestand en een ziektetoestand.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een stroomdiagram waarin dit protocol wordt weergegeven in figuur 1.

1. Behandeling van cellen met trombine, RNA-isolatie, kwaliteitsbeoordeling en Kwantificering van RNA

  1. Cultuur humane long microvasculaire endotheelcellen (HMVEC-LBL) tot 90-100% confluentie in 6-well platen in EGM-2 medium met 5% FBS, groeifactoren en antibiotica (Lonza, cat # CC-3202).
  2. Veranderingsmedia de honger media (0% FBS) 30 min vóór de behandeling met trombine.
  3. Behandel de cellen met 0,05 U / ml trombine of laat onbehandeld als controle gedurende 6 uur bij 37 ° C en 5% CO2.
  4. Isoleer totaal RNA uit de behandelde en controle cellen met de Ambion mir Vana kit volgens instructies van de fabrikant.
  5. De kwaliteit van het RNA met een Experion StdSense eukaryote RNA chip volgens het standaard protocol van de Experion Automated Electrophoresis Station (= "_blank"> Www.bio-rad.com).
  6. Kwantificeren van het RNA met behulp van een standaard spectrofotometrische methode.

2. Bibliotheek Bouw en Sequencing

  1. Gebruik 1 ug totaal RNA kwaliteit per sample als uitgangsmateriaal.
  2. Om de bibliotheek te bouwen, volg dan de standaard procedure van Illumina (protocol # 15008136 Rev A). In dit protocol twee ronden van poly (A) mRNA bevattende selecties uitgevoerd om rRNA verwijderen om de rRNA sequentie minimaliseren.
  3. Beoordeel de kwaliteit van de bibliotheken met behulp van een Experion DNA 1K-chip volgens het standaardprotocol van de Experion Automated Electrophoresis Station ( www.bio-rad.com ).
  4. Kwantificeren de bibliotheek door qPCR: Een bibliotheek die eerder de sequentie als een standaardcurve en primers specifiek voor de geligeerde adapters. Gebruik verschillende verdunningen van het onbekende bibliotheken (bijvoorbeeld 1:100, 1:500 en 1:1000). Voer de qPCR According de SyberGreen MM-protocol en bereken de oorspronkelijke stam concentratie van elke bibliotheek.
  5. Verdun de bibliotheek voorraden 10 nM en bij -20 ° C tot gebruik cluster een stroomcel.
  6. Als u klaar bent om cluster een flow cel, ontdooi de CBOT reagens plaat in een waterbad. CBOT is een Illumina instrument dat wordt gebruikt om het cluster generatie proces te stroomlijnen.
  7. Was de CBOT instrument.
  8. Denaturatie van de libraries: Combineer 13 ul 1 x TE en 6 pi 10 pM bibliotheek en aan de zijkant van de buis, voeg 1 ui 1 N NaOH (door Illumina). Vortex, gaat draaien, incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten en plaats het gedenatureerde bibliotheken op ijs.
  9. Verdun de libraries: Verdun het gedenatureerde bibliotheken met voorgekoeld hybridisatiebuffer (HT1, door Illumina) door het combineren van 996 pl HT1 en 4 pi gedenatureerd bibliotheek voor een eindconcentratie van 12 pM. Plaats de gedenatureerde en verwaterde bibliotheken op ijs.
  10. Omkeren elke rij buisjes met CBOT plaat,zodat alle reagentia zijn ontdooid. Spin down van de plaat, verwijderen / doorboren de folie afdichtingen en laden op de CBOT.
  11. Aliquot 120 pl van de verdunde, gedenatureerd bibliotheken een strip buis gelabeld 1-8. Voeg 1,2 ul verdunde, gedenatureerd PhiX control library (van Illumina) in elke buis als een piek-in controle. Vortex en draaien langs de buizen en laadt ze op de CBOT in de juiste oriëntatie (buis # 1 naar rechts).
  12. Plaats een flow cel en spruitstuk op de CBOT.
  13. Vul de stroom te controleren en beginnen met de clustering run.
  14. Na de run is voltooid, controleert u reagens levering op alle rijstroken. Noteer eventuele afwijkingen. Hetzij onmiddellijk starten sequencing run of bewaar het in de doorstroomcel ontvangen buis bij 4 ° C.
  15. Ontdooi de sequentiebepaling-door-synthese (SBS, Illumina) reagentia.
  16. Laad de reagentia op de juiste plekken op het reagens trays, zorg ervoor dat u de andere reagentia te raken na het aanraken van de splitsing mix.
  17. Met een non-sequencing flow cel (dwz een die eerder werd de sequentie), prime het reagens lijnen twee keer.
  18. Reinig de sequencing doorstroomcel met 70% EtOH en Kimwipes, gevolgd door 70% EtOH en de lens papier. Controleer de flow cel voor eventuele strepen. Re-reinig deze indien nodig.
  19. Plaats de doorstroomcel op de sequencer en voert een stroom te controleren of de afdichting tussen de verdeelleidingen en stromingscel vastzit.
  20. Start de sequencing run.
  21. Beoordeel de kwaliteit metrics (bijvoorbeeld de cluster dichtheid, clusters passeren filter, Q30, intensiteit) zodra ze beschikbaar zijn tijdens de run.
  22. Monitor intensiteit gedurende de run.
  23. Na 101 cycli zijn voltooid, voert u turnaround chemie te voltooien de tweede lezen: Ontdooi de gepaarde einde reagentia en de tweede read Oprichting Buffer (ICB, een onderdeel van de SBS-reagentia, Illumina) en laad de reagentia.
  24. Ga door met de sequencing run, het beoordelen van 2 e gelezen intensiteit, Q30 eennd andere kwaliteit metrics zoals de run vordert.

3. Data-analyse

  1. Gebruik de nieuwste versie van Casava (Illumina, op dit moment 1.8.2) aan de basis oproep bestanden (. Bcl) bestanden te converteren naar. Fastq bestanden, het instellen van fastq-cluster-count op 0 tot de oprichting van een enkel fastq bestand zorgen voor elk monster . Pak het fastq bestanden voor downstream-analyse.
  2. Voer gepaarde einde uitlijning met behulp van de nieuwste versies van TopHat (1.4.1) 5, die prima RNA-seq leest van zoogdieren-en kleinbedrijf genomen met behulp van de ultra high-throughput korte read aligner (Bowtie, 0.12.7) 6 en SAMtools (0,1. 17) 7. SAMtools voert verschillende hulpprogramma's voor post-processing optimalisaties in de SAM-formaat. De verwijzing menselijk transcriptoom kan worden gedownload vanaf iGenomes ( www.illumina.com ). Bij het runnen van TopHat, gebruikten we alle standaard parameterinstellingen inclusief de bibliotheek soort optie fr-unstranded (standaard).
  3. Onsde Programma CuffDiff deel van de Manchetknopen (1.3.0) 8 softwarepakket, vergelijk trombine behandelde cellen de controles cellen screenen van de differentieel tot expressie gentranscripten in de eerste gebaseerd op het menselijk transcriptoom referentie. Deze vergelijking detecteert de differentiële expressie van bekende transcripten. Gebruik Microsoft Excel om het resultaat in tabelvorm te visualiseren. Bij het runnen van Manchetknopen programma, gebruikten we alle standaard parameterinstellingen. Deze gentranscripten met FPKM <0,05 en p> 0.05 worden uitgefilterd.
  4. Om nieuwe isovormen te detecteren, voert Manchetknopen zonder een verwijzing transcriptoom. Vergelijk het monster transcript bestanden naar de referentie-genoom met behulp van Cuffcompare en test de differentiële expressie met Cuffdiff met behulp van de gecombineerde trombine transcript bestanden als referentie genoom voor een analyse en de gecombineerde controle transcript bestanden als referentie genoom voor een tweede analyse. Gebruik Microsoft Excel om het resultaat in tabelvorm te visualiseren. Nogmaals, Those gentranscripten met FPKM <0,05 en p> 0.05 worden uitgefilterd. Na deze stap kan onderzoekers ervoor kiezen om een lijst met onlangs gemeld transcripten te uploaden naar de UCSC Genome Browser website ( http://genome.ucsc.edu/ ) om hun geldigheid te controleren door een handmatige inspectie.
  5. Indienen lijsten van differentieel tot expressie komende genen om Ingenuity Pathway Analysis (IPA, www.ingenuity.com ) voor de karakterisering van de genen en pathways beïnvloed door de trombine behandeling. In deze stap kunnen onderzoekers kiezen buikband (gebruik http://compbio.mit.edu/cummeRbund/ ), een R pakket dat is ontworpen om te helpen en te vereenvoudigen de analyse van RNA-seq Manchetknopen uitgang voor het beheren, visualiseren en integreren van alle gegevens die door een Cuffdiff analyse.

4. Validatie van de RNA-seq Resultaten op Kwantitatieve Real-time-Polymerase Chain Reaction (qRT-PCR)

  1. Voer totaal RNA geïsoleerd van controle en trombine behandelde HMVEC-LBL cellen, RNA kwaliteitsbeoordeling en RNA kwantificering beschreven in stap 1.4 tot 1.6.
  2. Genereren complementair DNA van 1 ug totaal RNA van elk monster met SuperScript First-Strand III Synthesis System RT Kits volgens de instructies van de fabrikant (Invitrogen, 18,080-051).
  3. Voer qRT-PCR analyse op een Applied Biosystems VIIa 7 Real-Time PCR-systeem met behulp van Taqman assay-on-Demand ontworpen oligonucleotiden voor de detectie van CUGBP, Elav-likefamilymember1 (CELF1, Hs00198069_m1), Fanconianemia, complementationgroupD2 (FANDCD2, Hs00276992_m1), TNFreceptor -geassocieerde factor 1 (TRAF1, Hs01090170_m1) en β-actine (ACTB, Hs99999903_m1). Elk monster had een template overeenkomt met 5 ng van totaal RNA. Meet kwantificatie met behulp van de werkwijze en DDCT normaliseren β-actine. Elke assay werd uitgevoerd in ten minste drie biologische repliceert.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Voor Stap 1: de 28S: 18s verhouding wordt traditioneel gebruikt als indicator van RNA degradatie. Idealiter 28S piek moet ongeveer tweemaal het gebied van het 18S band (een verhouding van 2) hebben, maar dit is vaak niet ideale verhouding gezien in de praktijk. Bovendien 28s: 18s kan verkregen waarde van spectrofotometrische methoden onderschatten de hoeveelheid degradatie van het RNA. Nauwkeuriger kwantificeren de afbraak en dus de kwaliteit van het RNA monster Experion het systeem berekent een RNA kwa...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Belangrijke stappen

RNA Handling: RNasen zal zelfs degraderen de meest hoogwaardige RNA, dus zorg moet genomen tijdens de isolatie, de opslag en het gebruik van RNA 10 worden. Handschoenen worden altijd gedragen om verontreiniging te voorkomen door RNasen gevonden op de menselijke handen. Handschoenen moeten vaak worden gewijzigd, met name na het aanraken van de huid, deurknoppen en andere gangbare ondergronden. Een set van pipetten dienen uitsluitend gewijd aan het ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Geen belangenconflicten verklaard.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs willen graag Dr Stephen Kingsmore en de Pediatric Genome Medicine Center bedanken Children's Mercy ziekenhuizen en klinieken voor het gebruik van hun computer clusters voor onze data-analyse, Illumina's field service team (Elizabeth Boyer, Scott Cook en Mark Cook) en technische consultant team voor hun snelle reacties en nuttige suggesties over de werking van de volgende generatie DNA-sequencing instrument, HiScanSQ, en kwaliteit van de gegevens-analyse. Dit werk werd mede ondersteund door National Institutes of Health Grant HL080042 (tot SQY) en start-up fonds en begiftiging van Children's Mercy ziekenhuizen en klinieken, Universiteit van Missouri in Kansas City (tot SQY).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Reagentia of Uitrustingen Vennootschap Catalogusnummer Reacties
Humane long microvasculaire endotheelcellen Lonza CC-2815
Lonza, Bullet Kit Lonza CC-3202 Bevat EGM-2, FBS, groeifactoren en antibiotica
Trombine Sigma T4393
Ambion mir Vana Kit Life Technologies AM 1560
RNase-Zap Life Technologies AM9782
Experion StdSens RNA Bio-Rad 700-7103
TruSeq RNA BereidingUitrusting Illumina FC-122-1001
AMPureXP Beads Beckman Coulter A63881
Superscript reverse transcriptase II Life Technologies 18064-014
Experion DNA 1K Bio-Rad 700-7107
QuantiTect SyberGreen Qiagen 204163
PE Cluster Generation Kit Illumina PE-401-3001
PhiX Control Kit Illumina FC110-301
200 Cyclus SBS Kit Illumina FC-401-3001
HiScanSQ * Illumina SY-103-2001
CBOT Illumina SY-301-2002
qPCR machine - Viia7 Life Technologies Model # VIIA7 / Apparatuur # 10631261 Of gelijkwaardig
Experion System Bio Rad 7007001 Bioanalyzer is een alternatief systeem
Spectrofotometer Bio-Tek Epoch Microplate Spectrofotometer Of gelijkwaardig
Centrifuge - Sorvall Legend XTR Thermo Scientific 75004521 Of gelijkwaardig
Magnetische standaard Life Technologies AM10027
96-wells thermocycler General Lab Leverancier
Tabel 3. Lijst van Key Reagentia en Major Eapparatuur in. *, In de video, werd HiSeq1000 in plaats van HiScanSQ aangetoond.

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat. Rev. Genet. 10, 57-63 (2009).
  2. Shendure, J., Ji, H. Next-generation DNA sequencing. Nat. Biotechnol. 26, 1135-1145 (2008).
  3. Marioni, J. C., Mason, C. E., Mane, S. M., Stephens, M., Gilad, Y. RNA-seq: an assessment of technical reproducibility and comparison with gene expression arrays. Genome Res. 18, 1509-1517 (2008).
  4. Zhang, L. Q., et al. RNA-seq Reveals Novel Transcriptome of Genes and Their Isoforms in Human Pulmonary Microvascular Endothelial Cells Treated with Thrombin. PLoS One. 7, e31229(2012).
  5. Trapnell, C., Pachter, L., Salzberg, S. L. TopHat: discovering splice junctions with RNA-Seq. Bioinformatics. 25, 1105-1111 (2009).
  6. Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biol. 10, R25(2009).
  7. Li, H., et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25, 2078-2079 (2009).
  8. Trapnell, C., et al. Transcript assembly and quantification by RNA-Seq reveals unannotated transcripts and isoform switching during cell differentiation. Nat. Biotechnol. 28, 511-515 (2010).
  9. Khatri, P., Sirota, M., Butte, A. J. Ten years of pathway analysis: current approaches and outstanding challenges. PLoS Comput. Biol. 8, e1002375(2012).
  10. Nielsen, H. Working with RNA. Methods. Mol. Biol. 703, 15-28 (2011).
  11. Trapnell, C., et al. Differential gene and transcript expression analysis of RNA-seq experiments with TopHat and Cufflinks. Nat. Protoc. 7, 562-578 (2012).
  12. Robertson, G., et al. De novo assembly and analysis of RNA-seq data. Nat. Methods. 7, 909-912 (2010).
  13. Garber, M., Grabherr, M. G., Guttman, M., Trapnell, C. Computational methods for transcriptome annotation and quantification using RNA-seq. Nat. Methods. 8, 469-477 (2011).
  14. Martin, J. A., Wang, Z. Next-generation transcriptome assembly. Nat. Rev. Genet. 12, 671-682 (2011).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Transcriptome ProfilingThrombin TreatmentRNA IsolationLibrary ConstructionData AnalysisRT PCR ValidationHighSeq 1000Cuffdiff Analysis

Gerelateerde artikelen