Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Endotheline-1 geïnduceerde midden cerebrale slagader occlusie Model voor ischemische beroerte met Laser Doppler flowmetrie Begeleiding in Rat

19.7K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/50014

⸱

16 februari 2013

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Neurosurgery, University of Florida , 2Department of Anatomical Sciences, Shiraz University of Medical Sciences, Shiraz, Iran , 3Department of Physiology and Functional Genomics, University of Florida , 4Department of Neurology, University of Florida

In dit artikel

Samenvatting

Verschillende diermodellen van cerebrale ischemie zijn ontwikkeld om de menselijke toestand van beroerte simuleren. Dit protocol beschrijft de endotheline-1 (ET-1) geïnduceerde middelste cerebrale slagader occlusie (mCaO) model voor ischemische beroerte in ratten. Daarnaast zijn belangrijke overwegingen, voordelen en nadelen van dit model besproken.

Samenvatting

Beroerte is de nummer een oorzaak van invaliditeit en de derde doodsoorzaak in de wereld, kost naar schatting $ 70 miljard in de Verenigde Staten in 2009 1, 2. Verschillende modellen van cerebrale ischemie zijn ontwikkeld om de menselijke toestand van beroerte nabootsen. Het is gesuggereerd dat tot 80% van alle beroertes gevolg van ischemische schade in de middelste cerebrale slagader (MCA) gebied 3. In de vroege jaren 1990, endotheline-1 (ET-1) 4 werd gebruikt om ischemie te induceren door de toepassing ervan direct aan het oppervlak van de MCA na craniotomie. Later werd dit model gemodificeerd 5 door middel van een stereotactische injectie van ET-1 naast de MCA met focale cerebrale ischemie te produceren. De belangrijkste voordelen van dit model omvatten de mogelijkheid om de procedure snel uitvoeren, de mogelijkheid om slagader vernauwing regelen door verandering van de dosis van ET-1 geleverd, hoeft de extracraniale vaten die bloed naar de hersenen en geleidelijke reperfusi manipulerenop de tarieven die beter bootst de reperfusie bij de mens 5-7. Anderzijds is de ET-1 model heeft nadelen dat de noodzaak van een craniotomie, alsmede hogere variabiliteit in slagvolume 8 zijn. Deze variabiliteit kan worden verminderd met behulp van laser Doppler flowmetrie (LDF) voor cerebrale ischemie geverifieerd bij ET-1 infusie. Factoren die een beroerte variabiliteit van invloed zijn precisie van de infusie en de partij van de ET-1 gebruikt 6. Een andere belangrijke overweging is dat, hoewel reperfusie is een veel voorkomend in menselijke beroerte, kan de duur van occlusie ET-1 geïnduceerde mCaO niet na te bootsen die van humane beroerte waar veel patiënten gedeeltelijke reperfusie gedurende een periode van uren moet dagen na occlusie 9 10. Dit protocol beschrijft in detail de ET-1 geïnduceerde mCaO model voor ischemische beroerte bij ratten. Het zal ook de aandacht vestigen op bijzondere overwegingen en potentiële nadelen tijdens de gehele procedure.

Protocol

Dit protocol werd goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) aan de Universiteit van Florida en is in overeenstemming met de "Gids voor de Zorg en gebruik van proefdieren" (achtste editie, National Academy of Sciences, 2011).

Materieel

  1. Dieren: Acht weken oude, mannelijke Sprague Dawley ratten (Charles River Farms, Wilmington, MA, USA) met een gewicht van 250-300 g op het tijdstip van de operatie.
  2. Anesthesie
    1. Inhalatie-anesthesie systeem (VetEquip Inc, Pleasanton, CA, USA)
    2. Isofluraan anesthesie (Baxter Pharmaceutics, Deerfield, IL, USA)
  3. Stereotaxische systeem (David Kopf Instruments, Tujunga, CA, USA)
    1. Klein dier stereotaxische systeem
    2. Niet-breuk oor bars voor ratten
    3. Gas anesthesie hoofd houder voor ratten
  4. Temperatuurregeling
    1. BAT-12 microprobe thermometer (World Precision Instruments, Inc, Sarasota, FL, USA)
    2. T / PUMP, TP600 Thermische deken (Gaymar Industries, Inc, Orchard Park, NY, USA)
  5. Chirurgische instrumenten
    1. Scalpel handvat en # 11 blad, iris tang, Graefe tang, bulldog klem oprolmechanismen, schroevendraaier, 10 pl spuit met 26 gauge afgeschuinde naald (World Precision Instruments, Inc, Sarasota, FL, USA)
    2. Micromotor boor en stereotaxische houder, Quintessential stereotaxische Injector (Stoelting, Wood Dale, IL, USA)
    3. 1,0 mm ronde boor boor, 1,0 mm omgekeerde kegel boor boor (Roboz Chirurgisch Instrument Co, Inc, Gaithersburg, MD, USA)
  6. Chirurgische Supplies
    1. Montageschroeven 0 tot 80 x 3/32 met 2,4 mm as lengte, 21-gauge gids canule [4mm lang onder het voetstuk] en canule dummy (Plastics een, Roanoke, VA, USA)
    2. Jet prothese acryl en vloeistof (Lang Dental Manufacturing Co, Inc, Wheeling, IL, USA)
    3. 3,0 nylon hechtdraad (Oasis, Mettawa, IL, USA)
    4. Wattenstaafjes, Puralube oogzalf (Fisher Scientific, Pittsburg, PA, USA)
    5. Elektrische tondeuses (Oster, Providence, RI, USA)
  7. Chemicaliën
    1. Endotheline-1 (American Peptide, Sunnyvale, CA, USA)
    2. Chloorhexidine 2% (Agrilabs, St. Joseph, MO, USA)
    3. Buprenorfine HCl (Hospira Inc, Lake Forest, IL, USA)
  8. Visualisatie Equipment
    1. Chirurgische microscoop (Seiler Instrument and Manufacturing, St. Louis, MO, USA)
    2. Fiber Optic verlichting (TechniQuip Corp, Livermore, CA, USA)
  9. Laser Doppler flowmetrie systeem (ADInstruments, Inc, Colorado Springs, CO, USA)
    1. StAndard Pencil Probe
    2. Sondehouder
    3. Bloed FlowMeter
    4. Powerlab 4/30 met LabChart 7
  10. Meting van infarctvolume
    1. Rattenhersenen matrix (Zivic-Miller Lab. Inc, Allison Park, PA, USA)
    2. 2,3,5-trifenyltetrazoliumchloride (Sigma-Aldrich Co, St Louis, MO, USA) verdund tot 0,05% in PBS
    3. Flatbed scanner (Epson Perfection V30, Epson America, Inc, Long Beach, CA, USA)
    4. Afbeelding J-software (ImageJ 1.42q software, US National Institutes of Health, Bethesda, MA, USA)

1. Pre-operatieve stappen

  1. Voor de ingreep worden de ratten gehuisvest onder een 12:12 licht / donker-cyclus met vrije toegang tot water en knaagdieren chow.
  2. Anesthesie wordt geïnduceerd met 4% isofluraan in 100% O 2 gas mengsel in een inductie binnengebracht wanneer de rat niet meer opnames aan de achterzijde poot knijpen.
  3. Eenseptische techniek dient te worden gehandhaafd tijdens deze procedure inclusief het gebruik van steriele handschoenen, steriele chirurgische instrumenten, en een steriele chirurgische doek 11.
  4. De kroon van het hoofd wordt geschoren met elektrische tondeuses.
  5. De rat wordt in de buikligging op een absorberend kussen die op een temperatuurgeregelde contactvlak (thermische deken).
  6. Het hoofd wordt geplaatst in de stereotactische inrichting beginnen met het plaatsen van de gas verdoving gezichtsmasker.
  7. Vervolgens worden de balken oor geplaatst en vastgezet.
  8. Tijdens de procedure anesthesie wordt gehandhaafd met 2% isofluraan in 100% O2 gasmengsel.
  9. Oogzalf smeermiddel wordt toegepast op zowel ogen en oogleden gesloten oog uitdroging te voorkomen tijdens de chirurgische procedure.
  10. Een rectale temperatuur sonde wordt een constante dier kerntemperatuur van 37 ± 0,5 ° C. handhaven
  11. Met het hoofd stevig in de stereotaxischeinrichting het operatiegebied wordt gereinigd met afwisselende 2% chloorhexidine en zout driemaal.

2. Chirurgische Stappen

  1. Met een scalpel wordt een incisie gemaakt op de huid boven de calvarium van de caudale aspecten van de ogen (nasion) tussen de oren (superior nuchal lijn).
  2. De huid wordt vervolgens zijdelings ingeschoven met 3 bulldog klemmen.
  3. Bindweefsel wordt verwijderd uit de schedel met droge wattenstaafjes zodat meerdere structuren duidelijk zichtbaar. Deze omvatten bregma, de coronale hechtdraad, en de rechter laterale schedel nok. Wattenstaafjes worden gebruikt om bloed te verwijderen uit het chirurgische gebied.
  4. Met de chirurgische microscoop wordt bregma gelegen en de stereotactische manipulatoren worden bijgesteld tot de 1,0 mm ronde boor boor nul bij bregma.
  5. De boor boor wordt vervolgens tot 1,6 mm anterior en 5,2 mm lateraal van bregma.
  6. Een boor gat dat de schedel doordringt is geboord voor cannula plaatsen (Figuur 1). Overtollig puin en bloed worden voortdurend gewist met behulp van wattenstaafjes.

Op dit punt kan een geleidingscanule toegevoegd (stap 7) of een directe ET-1 injectie door de boor gat kan worden uitgevoerd (direct doorgaan naar stap 16).

  1. Vervolgens boor gaten voor montageschroeven 3 doorboord gedeeltelijke dikte van de schedel met een 1,0 mm omgekeerde kegel boor boor (figuur 1). Een gat wordt geboord in elk voorhoofdsbeen ongeveer 1-2 mm anterieur van de coronale hechtdraad en 1-2 mm lateraal van de pijlnaad. Een gat geboord in de wandbeen ongeveer 2-3 mm achter de coronale hechtdraad en 2-3 mm lateraal van de pijlnaad ipsilaterale de geleidingscanule boor gat. Drie 0 tot 80 x 3/32 schroeven worden geplaatst in deze boor gaten en zal ondersteuning voor het cement in de canule te bieden. De schroeven moeten alleen advanced 2 of 3 slagen om niet de dura materieschade.
  2. De geleidingscanule wordt in de stereotactische canule houder bregma ligt.
  3. De stereotaxische manipulatoren worden aangepast totdat de gids canule wordt op nul gezet op bregma. De canule wordt naar de boor gat op 1,6 mm anterior en 5,2 mm lateraal van bregma.
  4. Tenslotte wordt de geleidingscanule neergelaten in de boor gat met de laatste tip positie van 4,5 mm ventraal bregma.
  5. Laser Doppler flow probe plaatsing (optioneel)
    1. Met het oog op de cerebrale doorbloeding met behulp van LDF te bewaken, kan een sonde houder geplaatst te worden in de juiste positie voor het aanbrengen van de gids canule met tandheelkundige cement.
    2. De sonde houder voet is afgezet vlak met het voetstuk met uitzondering van kleine wigvormige tabblad.
    3. De probe houder wordt dan posterieur van de geleidingscanule en net mediaal van de laterale rand van de schedel tab georiënteerde mediaal (figuur 1).
    4. De probe houder en gHANDLEIDING canule elkaar aangebracht met tandheelkundig cement.
  6. Tandheelkundig cement wordt vervolgens gebruikt om de canule te vergrendelen. Het cement wordt in contact met alle drie schroeven en omgeeft de gehele basis van de canule.
  7. Het cement moet volledig droog zijn voorafgaand aan verwijdering van de canule houder. Dit duurt ongeveer 5 minuten.

Na deze stappen, kan de chirurgische incisie worden gesloten en de canule dummy kan worden geschroefd in de geleider canule. Als alternatief kan ET-1 geïnduceerde mCaO worden uitgevoerd op de rat na een periode van herstel van de canule implantatie chirurgie. Voor deze methode moet volgende stap 19 worden uitgevoerd en stappen 14-18 kunnen worden uitgevoerd op een later tijdstip. Om geleidingscanule implantatie en ET-1 injectie voeren tijdens dezelfde operatie moet volgende stap 14 worden uitgevoerd.

  1. De infusie spuit is geladen met ET-1 (verdund tot 80 uM in PBS) en dan bevestigd in de stereotaxische injector.
  2. Destereotaxische manipulatoren worden aangepast totdat de naaldpunt wordt op nul gezet aan de rand van de gids canule.
  3. De naaldpunt wordt neergelaten door de geleidingscanule een positie van 17,2 mm ventraal van de rand van de geleidingscanule. Als een gids canule niet wordt gebruikt, wordt de naald op nul gezet bij bregma en lager in de boor gat om een ​​positie 8,7 mm ventraal van bregma.
  4. 3 pl van 80 pM ET1 wordt toegediend met een snelheid van 1 ul per min.
  5. De spuit is blijven voor 3 min na voltooiing van de infusie en langzaam verwijderd.
  6. De incisie wordt gesloten met 3.0 nylon hechtdraad en de canule dummy is geschroefd in de canule.
  7. Een dosis van passende pijnstillende (dwz buprenorfine bij +0.05-0,1 mg / kg) te worden gebruikt na de operatie om pijn en ongemak te minimaliseren tijdens de herstelperiode.
  8. De rat wordt verwijderd uit de chirurgische suite en in een warme, droge herstelgebied om onderkoeling te voorkomen, met vrije en gemakkelijke toegang tot zacht voedsel en water.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

1. Post-Op neurologisch onderzoek

Nadat het dier terug bij bewustzijn komt, kan een breed scala aan tests worden gebruikt om neurologische stoornissen, zoals balans, de grijpkracht, poot plaatsen, posturale asymmetrie en trap klimmen evalueren. De zonnebloemzaad taak is een grove beoordeling van de motorische en sensorische functie die significante correlatie heeft met infarct volume 7, 12. Tijdens deze taak, worden ratten getimed tijdens het openen en consumeren 5 zonnebloempitten. ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De ET-1 geïnduceerde mCaO is een gevestigde model van experimentele ischemische beroerte die regelmatig wordt gebruikt in meerdere ratten stammen. Vele variabelen, zoals rattenstam, dier leeftijd, lichaamstemperatuur, anesthesie methode en operator deskundigheid kan leiden tot verhoogde variabiliteit in infarct volumes bij gebruik van dit model 5, 14. Toch hebben verschillende onderzoekers aangetoond dat voordelen van dit model de relatief niet-invasieve benadering dosisrespons van cerebrale bloedtoevoer naa...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

Geen belangenconflicten verklaard.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door subsidies van de American Heart Association Greater Zuidoost Affiliate (09GRNT2060421), de American Medical Association, en van de Universiteit van Florida klinisch en translationeel Science Institute. Adam Mekka is een NIH / NINDS, NRSA predoctorale collega (F30 NS-060335). Robert Regenhardt ontvangen predoctorale beurs steun van de Universiteit van Florida Multidisciplinaire Training Program in Hypertensie (T32 HL-083810).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
  1. Dieren: Acht weken oude, mannelijke Sprague Dawley ratten (Charles River Farms, Wilmington, MA, USA) met een gewicht van 250-300 g op het tijdstip van de operatie.
  2. Anesthesie
    1. Inhalatie-anesthesie systeem (VetEquip Inc, Pleasanton, CA, USA)
    2. Isofluraan anesthesie (Baxter Pharmaceutics, Deerfield, IL, USA)
  3. Stereotaxische systeem (David Kopf Instruments, Tujunga, CA, USA)
    1. Klein dier stereotaxische systeem
    2. Niet-breuk oor bars voor ratten
    3. Gas anesthesie hoofd houder voor ratten
  4. Temperatuurregeling
    1. BAT-12 microprobe thermometer (World Precision Instruments, Inc, Sarasota, FL, USA)
    2. T / PUMP, TP600 Thermische deken (Gaymar Industries, Inc, Orchard Park, NY, USA)
  5. Chirurgische instrumenten
    1. Scalpel handvat en # 11 blad, iris tang, Graefe tang, bulldog klem oprolmechanismen, schroevendraaier, 10 pl spuit met 26 gauge afgeschuinde naald (World Precision Instruments, Inc, Sarasota, FL, USA)
    2. Micromotor boor en stereotaxische houder, Quintessential stereotaxische Injector (Stoelting, Wood Dale, IL, USA)
    3. 1,0 mm ronde boor boor, 1,0 mm omgekeerde kegel boor boor (Roboz Chirurgisch Instrument Co, Inc, Gaithersburg, MD, USA)
  6. Chirurgische Supplies
    1. Montageschroeven 0 tot 80 x 3/32 met 2,4 mm as lengte, 21-gauge gids canule [4mm lang onder het voetstuk] en canule dummy (Plastics een, Roanoke, VA, USA)
    2. Jet prothese acryl en vloeistof (Lang Dental Manufacturing Co, Inc, Wheeling, IL, USA)
    3. 3,0 nylon hechtdraad (Oasis, Mettawa, IL, USA)
    4. Wattenstaafjes, Puralube oogzalf (Fisher Scientific, Pittsburg, PA, USA)
    5. Elektrische tondeuses (Oster, Providence, RI, USA)
  7. Chemicaliën
    1. Endotheline-1 (American Peptide, Sunnyvale, CA, USA)
    2. Chloorhexidine 2% (Agrilabs, St. Joseph, MO, USA)
    3. Buprenorfine HCl (Hospira Inc, Lake Forest, IL, USA)
  8. Visualisatie Equipment
    1. Chirurgische microscoop (Seiler Instrument and Manufacturing, St. Louis, MO, USA)
    2. Fiber Optic verlichting (TechniQuip Corp, Livermore, CA, USA)
  9. Laser Doppler flowmetrie systeem (ADInstruments, Inc, Colorado Springs, CO, USA)
    1. Standaard Potlood Probe
    2. Sondehouder
    3. Bloed FlowMeter
    4. Powerlab 4/30 met LabChart 7
  10. Meting van infarctvolume
    1. Rattenhersenenmatrix (Zivic-Miller Lab. Inc, Allison Park, PA, USA)
    2. 2,3,5-trifenyltetrazoliumchloride (Sigma-Aldrich Co, St Louis, MO, USA) verdund tot 0,05% in PBS
    3. Flatbed scanner (Epson Perfection V30, Epson America, Inc, Long Beach, CA, USA)
    4. Afbeelding J-software (ImageJ 1.42q software, US National Institutes of Health, Bethesda, MA, USA)

Referenties

  1. Stroke--1989. Recommendations on stroke prevention, diagnosis, and therapy. Report of the WHO Task Force on Stroke and other Cerebrovascular Disorders. Stroke. 20, 1407-1431 (1989).
  2. Lloyd-Jones, D., et al. Heart disease and stroke statistics--2009 update: a report from the American Heart Association Statistics Committee and Stroke Statistics Subcommittee. Circulation. 119, 480-486 (2009).
  3. Mohr, J. P., Gautier, J. C., Hier, D., Stein, R. W. Stroke: pathophysiology, diagnosis, and management. Barnett, H. J. M., Stein, B. M., Mohr, J. P., Yatsu, F. M. , Churchill Livingstone. New York. 377-450 (1986).
  4. Robinson, M. J., Macrae, I. M., Todd, M., Reid, J. L., McCulloch, J. Reduction of local cerebral blood flow to pathological levels by endothelin-1 applied to the middle cerebral artery in the rat. Neurosci. Lett. 118, 269-272 (1990).
  5. Sharkey, J., Ritchie, I. M., Kelly, P. A. Perivascular microapplication of endothelin-1: a new model of focal cerebral ischaemia in the rat. J. Cereb. Blood Flow Metab. 13, 865-871 (1993).
  6. O'Neill, M. J., Clemens, J. A. Rodent models of focal cerebral ischemia. Curr. Protoc. Neurosci. Chapter 9 (Unit 9), (2001).
  7. Mecca, A. P., O'Connor, T. E., Katovich, M. J., Sumners, C. Candesartan pretreatment is cerebroprotective in a rat model of endothelin-1-induced middle cerebral artery occlusion. Exp. Physiol. 94, 937-946 (2009).
  8. Braeuninger, S., Kleinschnitz, C. Rodent models of focal cerebral ischemia: procedural pitfalls and translational problems. Exp. Transl. Stroke Med. 1, 8(2009).
  9. Tomsick, T. A. Intravenous thrombolysis for acute ischemic stroke. J. Vasc. Interv. Radiol. 15, 67-76 (2004).
  10. Olsen, T. S., Lassen, N. A. A dynamic concept of middle cerebral artery occlusion and cerebral infarction in the acute state based on interpreting severe hyperemia as a sign of embolic migration. Stroke. 15, 458-468 (1984).
  11. Pritchett-Corning, K. R., Luo, Y., Mulder, G. B., White, W. J. Principles of rodent surgery for the new surgeon. J. Vis. Exp. (47), e2586(2011).
  12. Gonzalez, C. L., Kolb, B. A comparison of different models of stroke on behaviour and brain morphology. Eur. J. Neurosci. 18, 1950-1962 (2003).
  13. Ansari, S., Azari, H., McConnell, D. J., Afzal, A., Mocco, J. Intraluminal middle cerebral artery occlusion (MCAO) model for ischemic stroke with laser doppler flowmetry guidance in mice. J. Vis. Exp. (51), e2879(2011).
  14. Sharkey, J., Butcher, S. P. Characterisation of an experimental model of stroke produced by intracerebral microinjection of endothelin-1 adjacent to the rat middle cerebral artery. J. Neurosci. Methods. 60, 125-131 (1995).
  15. Macrae, I. M., Robinson, M. J., Graham, D. I., Reid, J. L., McCulloch, J. Endothelin-1-induced reductions in cerebral blood flow: dose dependency, time course, and neuropathological consequences. J. Cereb. Blood Flow Metab. 13, 276-284 (1993).
  16. Mecca, A. P., et al. Cerebroprotection by angiotensin-(1-7) in endothelin-1-induced ischaemic stroke. Exp. Physiol. 96 (1-7), 1084-1096 (2011).
  17. Fisher, M., et al. Update of the stroke therapy academic industry roundtable preclinical recommendations. Stroke. 40, 2244-2250 (2009).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Ischemisch slagzijmodelstereotactische injectie bij rattencraniotomieprocedurecerebrale ischemieneurologische onderzoekenTTC kleuringinfarctvolume
Endotheline-1 geïnduceerde midden cerebrale slagader occlusie Model voor ischemische beroerte met Laser Doppler flowmetrie Begeleiding in Rat
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.