Methodenartikel

Gerichte Labeling van neuronen in een specifiek functioneel Micro-domein van de neocortex door combinatie van intrinsieke signaal en twee-foton Imaging

DOI:

10.3791/50025

⸱

12 december 2012

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Neuroscience, Medical University of South Carolina

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een werkwijze wordt beschreven voor het labelen neuronen met fluorescente kleurstoffen in voorafbepaalde functionele micro-domeinen van de neocortex. Eerst wordt intrinsieke optisch imaging gebruikt om een ​​functionele kaart te verkrijgen. Dan twee-foton microscopie wordt gebruikt om het etiket en beeld neuronen binnen een micro-domein van de kaart.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In de primaire visuele cortex van de niet-knaagdier zoogdieren, worden neuronen geclusterd op basis van hun voorkeur voor stimuli functies zoals oriëntatie 1-4, richting 5-7, oculaire dominantie 8,9 en binoculaire dispariteit 9. Oriëntatie selectiviteit is de meest bestudeerde functie en een doorlopende kaart met een quasi-periodieke lay-out voor de gewenste oriëntatie aanwezig is in de gehele primaire visuele cortex 10,11. Integratie van de synaptische, cellulaire en netwerk bijdragen die leiden tot stimulans selectieve reacties in deze functionele kaarten vereist de hybridisatie van beeldvormende technieken die sub-micron overspannen millimeter ruimtelijke schalen. Bij conventionele intrinsieke signaal optische, kan de algemene indeling van functionele kaarten over het gehele oppervlak van de visuele cortex bepaald 12. De ontwikkeling van in vivo twee-foton microscopie met calcium gevoelige kleurstoffen laat toe bepalen synaptic-ingang te komen tot individuele dendritische spines 13 of een recordaantal activiteiten tegelijkertijd uit honderden individuele neuronale cellichamen 6,14. Bijgevolg combineert intrinsieke signaal beeldvorming met de sub-micron ruimtelijke resolutie van twee-foton microscopie biedt de mogelijkheid om een ​​precies welke dendritische cellen segmenten en bijdragen aan de micro-domein van elke functionele kaart in de neocortex. Hier laten we zien een hoge opbrengst methode voor het snel verkrijgen van een corticale oriëntatie kaart en tot een specifieke micro-domein in deze functionele kaart voor het labelen neuronen met fluorescente kleurstoffen in een niet-knaagdier zoogdier. Met dezelfde microscoop gebruikt voor twee-foton beeldvorming, maken we eerst een oriëntatie kaart met behulp van intrinsieke signaal optische beeldvorming. Vervolgens laten we zien hoe je een micro-domein van belang het gebruik van een micropipet geladen met kleurstof om ofwel label richten op een bevolking van neuronale cellichamen of label van een enkel neuron zodanig dat dendrieten, stekels en axonen zijn zichtbaar invivo. Onze verfijningen ten opzichte van eerdere methoden vergemakkelijken onderzoek van neuronale structuur-functie relaties met subcellulaire resolutie in het kader van neocorticale functionele architecturen.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Chirurgische Voorbereiding

  1. Laten anesthesie en permanent toezicht op de hartslag, eindigen getijden CO 2, EEG, en de temperatuur. Alle procedures werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite van de Medische Universiteit van South Carolina en waren gebaseerd op die we eerder gepubliceerde 9,15.
  2. Maak de dorsale oppervlak van de schedel door het snijden van de huid met een scalpel. Prepareer het bindweefsel bovenop het bot met behulp van een Brudon curette. Reinig het bot met behulp van katoen getipt applicators en een gaasje. Breng bot was (indien nodig) naar de schedel, af en toe bloeden te stoppen door kleine afgezant aderen.
  3. Bevestig een titanium of roestvrij staal kopplaat de schedel (over het gebied waar de craniotomie worden uitgevoerd) met tandheelkundig cement gemengd met zwarte verf (zie Materialen). Een rechthoekige opening in het midden van de kopplaat geeft toegang tot de craniotomie en optische. Bevestig een metalen kamer bovenop de kopplaat. Deze kamer dient als vloeistofreservoir voor beeldvorming met water immersie objectief.
  4. Bevestig de kopplaat op een xy tafel met metalen palen.
  5. Dunnen een groot deel van het bot in de rechthoekige opening van de kopplaat door een tandartsboor. Het gebied dat moet worden uitgedund moet zich uitstrekken tot ver buiten de grenzen van de geplande craniotomie. De dikke schedel van knaagdieren zoogdieren moet verdund als hoge-resolutie beelden worden verkregen van de neocortex omdat bij de craniotomie site, de dikte van bot zal de dikte van de agarose bepalen tussen het dekglaasje en neocorticale oppervlak (zie hieronder) .
  6. Boor een 2 x 2 mm vierkante omtrek in het bot de craniotomie. Periodiek Spoel de kamer met verse kunstmatige cerebrospinale vloeistof (ACSF) aan het bot scherven te verwijderen en het minimaliseren van de warmteafvoer van de onderliggende cortex. Breng bot was als nodig is, om af en toe bloeden te stoppen.
  7. Lift het bot flap met een # 3 tang.
  8. Verwijder alles behalve de onderste laag van dura met een fijn pincet (# 5CO) en Vannas lente schaar. De dura in knaagdieren zoogdieren dik en ondoorzichtig maar kan worden verwijderd in verschillende lagen. Bloeden is zeldzaam, maar kan worden gestopt met Gelfoam en eventuele bloedresten moet voorzichtig worden verwijderd van de overblijvende laag dura behulp van een tang en spoelen met ACSF. De laatste laag dura is transparant en pial vaartuigen duidelijk zichtbaar doorheen. Het verlaten van deze laatste laag van dura intact tijdens een intrinsiek signaal beeldvorming zal de slaagkans van laden van bulkgoederen fluorescerende calcium indicatoren voor de daaropvolgende twee-foton beeldvorming fase van het experiment (zie Discussie).
  9. Breng een druppel van warme 2% agarose (opgelost in ACSF) en onmiddellijk een dekglaasje plaats over de craniotomie. Controleer de craniotomie opdat respiratoire en cardiovasculaire pulsaties minimaal zijn middels een chirurgische dissectiemicroscoop of de lenzen van de twee-foton microscoop in bright-field-modus.

2. Intrinsieke Signal Optical Imaging

  1. Voeg gel-schuim doordrenkt met ACSF rond de buitenkant van de coverglass de agarose uitdroogt tijdens intrinsieke signaal imaging.
  2. Bevestig de intrinsieke signaal imaging CCD camera de standaard C-mount poort aan de bovenzijde van de twee-foton microscoop (Figuur 1). Plaats de belichtingslichtbron de lucht tafel bij de kruistafel (Figuur 1A). Positioneer en bevestig de lichtgeleiders over de craniotomie en gitaarkop plaat / kamer (Figuur 1B). Zodat Schuif de primaire dichroïsche spiegel en onder de C-mount poort die gereflecteerd rood licht nodig voor intrinsieke signalen rechtstreeks overgaan van de craniotomie de CCD camera (figuur 1C-D). Met behulp van de 4x lucht doelstelling (0,13 NA, 17 mm WD), een 2 x 2 mm gezichtsveld is beschikbaar voor intrinsieke signaal beeldvorming.
  3. Plaats een warmte filter in de light pad naar de cortex voorkomen verwarming. Gebruik een filter dat groen licht (546 nm centrum λ) en neem een ​​digitale referentiebeeld van de corticale oppervlak bloedvaten passeert.
  4. Verplaats de aandacht z tot 500 urn onder het corticale oppervlakte. Een rood filter (630 nm center λ) de cortex verlichten meten intrinsieke signalen. Plaats de lichtgeleiders zodanig dat de corticale oppervlak gelijkmatig verlicht. Scherm de craniotomie van het licht geproduceerd door de visuele stimulus display. Presenteer een opeenvolging van visuele stimuli en opnemen reflectie gegevens beelden. Een oriëntatie kaart binnen 10 min genereren verzamelen overeenkomend met 4 herhalingen van een sequentie van 8 stimuli (4 oriëntaties en twee richtingen voor elke oriëntatie).
  5. Analyseer de intrinsieke signaal gegevens naar een valse kleuren oriëntatie kaart te genereren. Selecteer potentieel doelwit regio's voor twee-foton etikettering van neuronen, bijvoorbeeld oriëntatie pinwheel singulariteiten - punten in de kaart waaralle preferente oriëntaties convergeren (Figuur 2A). Overlay de oriëntatie kaart en het beeld van de corticale oppervlak vaatstelsel (Figuur 2B-C). Gebruik de indeling van functionele domeinen en de locatie van grote oppervlakteschepen selecteren van een doel, het vermijden plaatsen met grote bloedvaten en arteriolen 15.

3. Bulk Laden van TL-Calcium-indicatoren

  1. Bereid een oplossing van 20% Pluronic / DMSO door 1 g Pluronic in 5 pi DMSO. Verwarm het mengsel op 60 ° C gedurende 10 min om volledig op te lossen Pluronic. Laat het mengsel afkoelen tot kamertemperatuur. Voeg 4 pi van het Pluronic / DMSO mengsel in een 50 ug flesje met fluorescente calcium indicator Oregon Green 488 Bapta-1 AM (OGB-1 AM). Voeg 1 pl van een rode kleurstof (Alexa Fluor 594, 2 mM stock-oplossing) en 35 pi pipetoplossing (zie Materialen) voor een eindconcentratie van 1 mM OGB-1 uur. Sonificeer de oplossing voor ½ uur ineen waterbad gekoeld en centrifugeer met een 0,45 urn filter om onzuiverheden te verwijderen.
  2. Trek een lange taps pipet met een buitendiameter tip diameter van 2,0-2,5 micrometer. Plaats 5 pl van het kleurstofmengsel in de pipet.
  3. Verwijder de laatste laag aan dura pipet insertie en het verkrijgen van de hoogste kwaliteit beelden twee-foton.
  4. Bepaal de identificatie op de corticale oppervlak dat de pipet worden geplaatst om zijn doel in corticale laag 2/3. De vooraf bepaalde corticale doel een pinwheel singulariteit in de richting kaart (Figuur 2). De pipet wordt gedreven in de cortex op een hoek van 30 ° te geven tussen de kamerwand en het doel. Dus de doelregio 200 urn onder het corticale oppervlak label, wordt de pipet invoerpositie aan de corticale oppervlak ongeveer 350 urn dwars op de beoogde positie (Figuur 3 AB).
  5. Verplaats de kruistafel (waarop het dier en de pipette micromanipulator worden geplaatst) om naar het midden van de corticale oppervlak invoerpositie onder de doelstelling (figuur 3C). Gebruik een 20x of 40x objectief met een werkafstand (WD) van ten minste 3 mm (zie materialen), zodat de pipet gemakkelijk de cortex voeren zonder het doel of het been langs de wand van de craniotomie. Zodra de invoerpositie wordt gecentreerd onder de doelstelling, verhogen de Z-positie van het doel met 2 mm (figuur 3D). Met de groene epi-fluorescentie ingeschakeld om de rode Alexa kleurstof zichtbaar in de pipet, met de diagonale as van de micromanipulator de pipet bewegen totdat de punt is gericht (en gericht) onder het objectief direct boven de corticale oppervlak invoerpositie ( figuur 3E).
  6. Laat de pipet verticaal (langs de z-as) tot de pipet bereikt het corticale oppervlak (figuur 3F), terwijl continu het bekijken van de pipetpunt via de OCUlars van de microscoop. Met behulp van bright-field verlichting, de corticale oppervlak bloedvaten en de resterende meningeale membranen (pia en arachnoidea) zijn goed zichtbaar als de pipet het corticale oppervlak benadert. Als de pipet niet bereikt het gewenste item positie, breng de pipet en opnieuw te kalibreren richten op basis van de vasculaire monumenten op het corticale oppervlak.
  7. Verwijder de doelstelling, lont overmatig hersenvocht uit de craniotomie en droog de aangrenzende bot met behulp van niet-pluizend absorptie speren. Breng een druppel warm 3% agarose (opgelost in ACSF) de cortex dat zichtbaar is door de craniotomie (Figuur 3G) stabiliseren. In niet-knaagdieren, 3% agarose moet pulsaties temperen voor succesvolle opname van fluorescerende kleurstoffen door neuronen. Voor intrinsieke optisch imaging slechts 2% agarose is nodig omdat de combinatie van 2% agarose en de coverglass de noodzakelijke stabiliteit. Hier wordt geen coverglass gebruikt voor het kleurstof-beladingsstap zodat 3% agarosenodig. Nadat de agarose is gestold, plaatst u een 40x objectief (0,8 NA, 3,3 mm WD) en opnieuw te vullen de kamer met ACSF.
  8. Overschakelen van de bright-field tot twee-foton bekijken en zoek de pipetpunt. Met de diagonale as van de micromanipulator, verplaatst de pipet totdat de punt op de gewenste diepte in de cortex (Figuur 3H). Af en toe druk uitwerpen rookwolken van de kleurstof mengsel (een paar psi, elke puls 0,1 sec) zal helpen voorkomen dat de pipetpunt verstopt raakt. Omdat OGB-1 uur alleen zichtbaar bij binnenkomst cellen, de rode Alexa kleurstof is essentieel voor visualisatie van de pipetpunt in de cortex.
  9. Alvorens tot neuronen in corticale Layer 2/3 geladen met de volledige dosis van kleurstof, opnieuw richten van de doelstelling op de corticale oppervlakte om de diepte van de pipetpunt bevestigen en de tip in de doellocatie op basis van de indeling van waarborgen oppervlak bloedvaten. Als de pipet in laag 2/3, moeten kleine pufjes van het kleurstofmengsel verlichten deextracellulaire ruimte en onthullen een dichte montage van ronde cellichamen als donkere schaduwen.
  10. Voor het laden van neuronale cellichamen in een sfeer van cortex 3-600 micrometer diameter, injecteren de kleurstof mengsel in de extracellulaire ruimte met 30 tot 90 pulsen, elke puls 1,0 sec, 2-10 psi. De pulsen van druk niet zo groot zijn dat het weefsel beweegt. Na de injectie is voltooid, een paar minuten wachten, en verwijder de pipet en objectief. Wacht 1 uur om de OGB-1 uur tot volledig overgenomen-up door neuronen.
  11. Verwijder de agarose voor de kleurstof laden en spoel de opname kamer. Doe een kleine druppel van 2-3% agarose op het oppervlak wordt snel een dekglaasje over de craniotomie. Omdat de fluorescente kleurstoffen zijn lichtgevoelig, voorkomen overbelicht de cortex bright-field of epi-fluorescent licht. Plaats een hoge NA (1,0) 20x objectief in de objectieve houder en opnieuw centreren de gelabelde corticale regio onder de doelstelling met behulp van de xy tafel. Scherm de craniotomie van extraneous lichtbronnen, bijvoorbeeld visuele stimulus display, met behulp van meerdere lagen van black-out materiaal.

4. Eencellige Elektroporatie van fluorescerende kleurstoffen

  1. Voor het bestuderen van dendritische morfologie, een oplossing van 100 uM Alexa Fluor 594 (1:20 verdunning in ACSF van 2 mM Alexa Fluor 594 voorraad). Voor functionele beeldvorming van dendrieten een OGB zout kan worden gebruikt 16,17.
  2. Trek een long taper pipet met een tip grootte van 1 pm en laden 5 pi kleurstof in de pipet. Alle andere stappen van het richten een functioneel domein identiek zijn met de bulk laadmethode (figuren 1-3). Om de pipetpunt naast een neuronale cellichaam membraan positioneren, toezicht op de toename van de impedantie van de elektrode en oefen druk pufjes van de kleurstof naar de extracellulaire ruimte te verlichten en te zien cellichamen als schaduwen in de loop van twee-foton beeldvorming.
  3. Wanneer de pipetpunt grenst aan een neuronale cel lichaam membraan met de Axoporator 800A toepassing1 tot 3 pulsen (-8 t -10 V, 10 msec puls). De onmiddellijke vullen van de neuron met kleurstof gemakkelijk gevisualiseerd met twee-foton microscopie. Haal de pipet en het verzamelen van beelden met hoge resolutie van dendrieten en axonen in vivo.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Om de precisie van onze dye labeling methoden illustreren, gericht op de kleinste micro-domein van elke bekende functionele kaart in de knaagdieren neocortex. Dun doorspekt het hele oriëntatie kaart in de primaire visuele cortex zijn singulariteiten. Deze komen op de plaatsen waar alle gewenste richtingen samenkomen, zodanig dat in valse kleuren kaarten van voorkeursrichting, de regio's rond de singulariteit eruit "pinwheels" (Figuur 2A-B). Een pinwheel per craniotomie is geselecteerd voor...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We een methode om de labeling van neuronale cellichamen (of dendrieten en axonen) in vooraf bepaalde functionele micro-domeinen van de neocortex richten. Fuserende intrinsieke optisch beeldvorming met twee-foton microscopie biedt de mogelijkheid te bepalen welke cellen bij synapsen en de micro-domein van elke functionele kaart, of neuronale selectiviteit correleert met de locatie van de neuron in een functionele kaart en de neuronale circuitcomponenten die veranderen met visuele ervaring 7 of de toepassing va...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Geen belangenconflicten verklaard.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door subsidies van de National Eye Institute R01EY017925 en R21EY020985 en financiering van de Dana & Whitehall Foundations naar PK We hebben ook Matthew Petrella bedanken voor hulp bij chirurgische procedures; Grace Dion voor het traceren van de dendrieten getoond in figuur 5A en Pratik Chhatbar voor commentaar op het manuscript.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Naam van de Reagens / Materiaal Vennootschap Catalogus nummer Reacties
1. Life support / experiment prep
Isofluraan Webster Vet NDC 57319-474-05
Isofluraan vaporizer Midmark VIP 3000
Terugkoppeling gereguleerde verwarming deken Harvard Apparatus 50-7079F
ECG-monitor Digicare Biomedische LifeWindow Lite
EEG-versterker AM Systems 1800
EEG monitor Hewlett Packard 78304A
Einde tidal CO 2-monitor Respironics Novametrix Capnoguard 1265 Optimaliseer ventilatie
Hardmetalen boor bramen voor het boren bot Henry Schein fijne (0,5 mm tip) en grof (1,25 mm tip)
Cement voor kopplaat / kamer Dentsply 675571, 675572
Black Powder Tempera Paint Sargent Art Inc 22-7.185 Toevoegen aan cement aan het licht afscherming te verbeteren en reflecties te verminderen
Agarose - Type III-A Sigma A9793 Voor het minimaliseren van pulsaties in de loop van de intrinsieke signaal en twee-foton beeldvorming
Dekglaasje: 5 of 8 mm diameter, 0,17 mm dikte Wereld Precision Instrumenten 502040, 502041 Voor het minimaliseren pulsaties tijdens beeldvorming, kan het dekglaasje worden gesneden behoefte
Brudon curettes George Tiemann 105-715-0, 105-715-3 Reiniging schedel oppervlak
Bone wax Ethicon W31G Snel stoppen met bloeden
Katoen Fooi Applicator Electron Microscopy Sciences 72.308-05 Schoon en droog botoppervlak
Dumont # 5CO Forceps Fine Science Tools 11.295-20 Pak individuele lagen van dura of pia
Vannas Spring Schaar Fine Science Tools 15.000-03 Cut dura
Gelfoam Pfizer 09-0396-05 Om het bloeden te stoppen op de dura
Absorptie speren Fine Science Tools 18.105-01 Ultrasnelle en niet-pluizende absorberende van CSF
Blackout materiaal Thorlabs BK5 Shield craniotomie
2. Kleurstofpreparaat / injectie
Dimethylsulfoxide (DMSO) Sigma D2650
Pluronic Sigma P2443
Oregon Green 488 Bapta-1 AM Invitrogen O6807 Calcium-indicator
Alexa Fluor 594 Invitrogen A10438
Centrifugaal filter (0,45 urn poriegrootte) Millipore UFC30HV00 Om verontreinigingen te verwijderen vóór de injectie
Glazen pipet trekker Sutter Instrumenten P97
Borosilicaatglas filamented capillair (1,5 mm buitendiameter) Wereld Precisie-instrumenten 1B150F-4 Dye uitwerpen pipet
Microloader Eppendorf 5242 956 003 Voor het laden kleurstof in pipet
Micromanipulator Sutter Instrumenten MP-285 Om pipet positioneren
Drukpuls controller Parker Hannifin PicoSpritzer III Voor druk inspuiten van de kleurstof
Single-cell elektroporator Molecular Devices Axoporator 800A Voor elektroporatie van de kleurstof
3. Intrinsieke imaGing
4x Doelstelling (0,13 NA, 17 mm WD) Olympus UPLFLN4X
Intrinsieke hardware / software Optische Imaging Inc Imager 3001 / VDAQ VDAQ software wordt gebruikt voor episodische beeldvorming
CCD Camera Adimec Adimec-1000
Lichtbron voeding KEPCO ATE 15-15M
Lichtbron Optische Imaging Inc HAL 100 Lichtintensiteit op de corticale oppervlak is 3-5 mW
Green filter (voor vasculaire comping) Optische Imaging Inc λ = 546 nm (30 nm bandbreedte) Ter referentie beeld van het oppervlak vaatstelsel
Rood filter (voor intrinsieke signaal) Optische Imaging Inc λ = 630 nm (30 nm bandbreedte) Om intrinsieke signalen te verzamelen
Warmtefilter Optische Imaging Inc KG-1
4. Twee-foton rig / imaging
Twee-foton microscoop en software Prairie Technologies Zie Shen et al.. 2012 voor lichtpad, filters en laservermogen
Ti: saffier-laser Spectra-Physics Mai Tai XF
20x (0,5 NA; 3,5 mm WD) Olympus UMPLFLN20X 0,5 NA doel wordt alleen gebruikt voor het uitlijnen pipet de craniotomie (niet voor twee foton imaging)
20x (1,0 NA; 2,0 mm WD) Olympus XLUMPLFLN20X
40x (0,8 NA; 3,3 mm WD) Olympus LUMPLFLN40X/IR
Air tafel Newport ST-200 Isoleert de voorbereiding van externe trillingen
xy podium Mike's Machine Co (Attleboro, MA) Proefpersoon en Sutter micromanipulator geplaatst op xy tafel
Recepten
Kunstmatige cerebro-spinale vloeistof NaCl (135 mM), KCl (5,4 mM), MgCl2 (1,0 mM), CaCl2 (1,8 mM), HEPES (5 mM), pH 7,4
Pipetteer Oplossing 14 NaCl (150 mM), KCl (2,5 mM), HEPES (10 mM), pH 7,4

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Blasdel, G. G., Salama, G. Voltage-sensitive dyes reveal a modular organization in monkey striate cortex. Nature. 321, 579-585 (1986).
  2. Grinvald, A., Lieke, E., Frostig, R. D., Gilbert, C. D., Wiesel, T. N. Functional architecture of cortex revealed by optical imaging of intrinsic signals. Nature. 324, 361-364 (1986).
  3. Bonhoeffer, T., Grinvald, A. Iso-orientation domains in cat visual cortex are arranged in pinwheel-like patterns. Nature. 353, 429-431 (1991).
  4. Ohki, K., et al. Highly ordered arrangement of single neurons in orientation pinwheels. Nature. 442, 925-928 (2006).
  5. Shmuel, A., Grinvald, A. Functional organization for direction of motion and its relationship to orientation maps in cat area 18. J. Neurosci. 16, 6945-6964 (1996).
  6. Ohki, K., Chung, S., Ch'ng, Y. H., Kara, P., Reid, R. C. Functional imaging with cellular resolution reveals precise micro-architecture in visual cortex. Nature. 433, 597-603 (2005).
  7. Li, Y., Van Hooser, S. D., Mazurek, M., White, L. E., Fitzpatrick, D. Experience with moving visual stimuli drives the early development of cortical direction selectivity. Nature. 456, 952-956 (2008).
  8. Bonhoeffer, T., Kim, D. S., Malonek, D., Shoham, D., Grinvald, A. Optical imaging of the layout of functional domains in area 17 and across the area 17/18 border in cat visual cortex. Eur. J. Neurosci. 7, 1973-1988 (1995).
  9. Kara, P., Boyd, J. D. A micro-architecture for binocular disparity and ocular dominance in visual cortex. Nature. 458, 627-631 (2009).
  10. da Costa, N. M., Martin, K. A. Whose Cortical Column Would that Be. Frontiers in Neuroanatomy. 4, 16(2010).
  11. Kaschube, M., et al. Universality in the evolution of orientation columns in the visual cortex. Science. 330, 1113-1116 (2010).
  12. Villeneuve, M. Y., Vanni, M. P., Casanova, C. Modular organization in area 21a of the cat revealed by optical imaging: comparison with the primary visual cortex. Neuroscience. 164, 1320-1333 (2009).
  13. Chen, X., Leischner, U., Rochefort, N. L., Nelken, I., Konnerth, A. Functional mapping of single spines in cortical neurons in vivo. Nature. 475, 501-505 (2011).
  14. Stosiek, C., Garaschuk, O., Holthoff, K., Konnerth, A. In vivo two-photon calcium imaging of neuronal networks. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 7319-7324 (2003).
  15. Shen, Z., Lu, Z., Chhatbar, P. Y., O'Herron, P., Kara, P. An artery-specific fluorescent dye for studying neurovascular coupling. Nat. Methods. 9, 273-276 (2012).
  16. Nevian, T., Helmchen, F. Calcium indicator loading of neurons using single-cell electroporation. Pflugers Archiv. 454, 675-688 (2007).
  17. Kitamura, K., Judkewitz, B., Kano, M., Denk, W., Hausser, M. Targeted patch-clamp recordings and single-cell electroporation of unlabeled neurons in vivo. Nat. Methods. 5, 61-67 (2008).
  18. Pohl-Guimaraes, F., Krahe, T. E., Medina, A. E. Early valproic acid exposure alters functional organization in the primary visual cortex. Exp. Neurol. 228, 138-148 (2011).
  19. Bock, D. D., et al. Network anatomy and in vivo physiology of visual cortical neurons. Nature. 471, 177-182 (2011).
  20. Rochefort, N. L., et al. Development of direction selectivity in mouse cortical neurons. Neuron. 71, 425-432 (2011).
  21. Mrsic-Flogel, T. D., et al. Homeostatic regulation of eye-specific responses in visual cortex during ocular dominance plasticity. Neuron. 54, 961-972 (2007).
  22. Bonhoeffer, T., Grinvald, A. Optical Imaging Based on Intrinsic Signals. Brain mapping: The Methods. Toga, A. W., Mazziotta, J. C. , Academic Press. San Diego. 55-97 (1996).
  23. Kerr, J. N., Greenberg, D., Helmchen, F. Imaging input and output of neocortical networks in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 14063-14068 (2005).
  24. Hofer, S. B., et al. Differential connectivity and response dynamics of excitatory and inhibitory neurons in visual cortex. Nat. Neurosci. 14, 1045-1052 (2011).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Intrinsic Signal ImagingTwo photon MicroscopyOrientation MapNeuron LabelingFunctional Micro domainCortical ImagingFluorescent DyeSingle Neuron ResolutionVisual CortexSub cellular Resolution

Gerelateerde artikelen