Method Article

Kwantitatieve analyse van Autophagy met Advanced 3D Fluorescentiemicroscopie

DOI:

10.3791/50047

⸱

May 3rd, 2013

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular Medicine, University of California, Davis , 2NSF Center for Biophotonics Science & Technology, University of California, Davis , 3University of Tromsø, 4Department of Surgery (Division of Surgical Oncology), University of California, Davis , 5UC Davis Comprehensive Cancer Center, University of California, Davis , 6Department of Biological Chemistry, University of California, Davis

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autofagie is een alomtegenwoordige proces waarmee cellen om eiwitten en organellen degraderen en te recyclen. We passen geavanceerde fluorescentie microscopie te visualiseren en kwantificeren van de kleine, maar essentiële, fysieke veranderingen geassocieerd met de inductie van autofagie, waaronder de vorming en verspreiding van autofagosomen en lysosomen, en hun fusie in autolysosomes.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prostaatkanker is de toonaangevende vorm van maligniteiten bij mannen in de VS Terwijl chirurgie draagt ​​een significant risico op impotentie en incontinentie, hebben traditionele chemotherapeutische benaderingen grotendeels in het ongelijk gesteld. Hormoontherapie effectief is in een vroeg stadium, maar vaak mislukt met de uiteindelijke ontwikkeling van hormoon-refractaire tumoren. Wij zijn geïnteresseerd in het ontwikkelen van therapieën gericht op specifieke metabole deficiëntie van tumorcellen. We hebben onlangs aangetoond dat prostate tumorcellen specifiek missen een enzym (argininosuccinate synthase of ASS) betrokken bij de synthese van het aminozuur arginine 1. Deze voorwaarde zorgt ervoor dat de tumorcellen afhankelijk van exogene arginine te worden, en ze ondergaan metabole stress toen de vrije arginine wordt uitgeput door arginine deiminase (ADI) 1,10. We hebben inderdaad aangetoond dat het menselijke prostaatkankercellen CWR22 RV1 doeltreffend worden gedood door ADI met caspase-onafhankelijke apoptose en agressieve autophagy (of macroautofagie) 1,2,3. Autophagy is een evolutionair geconserveerde proces waarmee cellen om ongewenste eiwitten metaboliseren door lysosomale afbraak tijdens voedingswaarde verhongering 4,5. Hoewel de essentiële onderdelen van deze route zijn goed gekarakteriseerd 6,7,8,9, vele aspecten van het moleculaire mechanisme nog onduidelijk zijn - in het bijzonder, wat is de rol van autofagie in de dood-respons van prostaatkankercellen na ADI behandeling ? Om deze vraag te beantwoorden hebben we nodig een experimentele methode om het niveau en de mate van autophagic respons in cellen te meten - en omdat er geen bekende moleculaire merkers die nauwkeurig deze taak kan volgen, kozen we een imaging-gebaseerde aanpak, met kwantitatieve 3D fluorescentiemicroscopie 11,12.

Met behulp CWR22Rv1 cellen specifiek gelabeld met fluorescerende probes voor autofagosomen en lysosomen, laten we zien dat 3D-beeld stacks opgenomen met ofwel widefield deconvolutie microscopie (en later, met super-resolutie, gestructureerde-verlichting microscopie) kan de vroege stadia van autofagie inductie duidelijk vast te leggen. Met commercieel verkrijgbare digitale beeldanalyse-toepassingen, kunnen we gemakkelijk statistische informatie over autophagosome en lysosome aantal, de grootte, de distributie, en de mate van colocalization vanaf elke afgebeelde cel krijgen. Deze informatie stelt ons in staat om de voortgang van autofagie in levende cellen nauwkeurig te volgen en stelt onze voortdurende onderzoek naar de rol van autofagie in chemotherapie bij kanker.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Deel 1: Cultuur van de Cel-en Immuno-tl Labeling

  1. Groei CWR22 RV1 humane prostaattumorcellen op glazen dekglaasjes (# 1.5 en 170 urn dik) geplaatst in 6-well platen met RPMI (Mediatech, VA) met 10% foetaal bovine serum (FBS) en 1% penicilline / streptomycine / glutamine.
  2. Induceren autophagy door behandeling geselecteerde monsters met arginine deiminase (ADI, 0,3 ug / ml) in met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS).
  3. Bevestig cellen met 4% paraformaldehyde (PFA, Fisher Scientific, NH) verdund in PBS, 100 ul per dekglaasje gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
  4. Was de cellen 3x met 1 ml HBS / BSA.
  5. Permeabilize cellen met 0,05% saponine (Sigma, MO) in HEPES (HBS) / BSA, 100 ul per dekglaasje gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
  6. Vóór immuno-labeling, blok monsters met 2,5% caseïne (Sigma, MO) in HBS / BSA, 100 ul per dekglaasje gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
  7. Incubeer vaste cellen met primaire antilichamen verdund in 2,5% caseïne / HBS / BSA, 100 ul per coverslip, O / N bij 4 ° C.
  8. Was de cellen 3x met 1 ml HBS / BSA.
  9. Incubeer gefixeerde cellen met secundaire antilichamen verdund in 2,5% caseïne / HBS / BSA, 100 ul per dekglaasje gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
  10. Was de cellen 3x met 1 ml HBS / BSA.
  11. Monteer voorbereide coverslips op gewoon glas microscoopglaasjes met Slowfade Goud of Verleng Gold antifade reagens (Invitrogen, CA) met 4 ',6-diamidino-2-fenylindool (DAPI).
  12. Afdichting dekglaasje randen met nagellak. Voor de beste beeldresultaten, zodat ze tijdig (idealiter O / N) voor de anti-fade papier goed laten doordringen cellen.
  13. Schoon dekglaasje oppervlak met methanol en / of chloroform.
  14. Voeg immersie-olie (brekingsindex 1,520 wanneer beeldvorming bij 37 ° C, of ​​1,516 als beeldvorming bij RT) aan de 60X 1,42 NA objectief (Olympus, Japan).
  15. Positie dia op de microscoop podium en focus aan te brengen met de cellen van belang.

2. Deel 2: Het voorbereiden Cellen voor Live Imaging

  1. Groeien CWR22 RV1 cellen die groen fluorescent eiwit-gekoppelde lichte keten 3 (LC3-GFP) in RPMI kweekmedium bevattende 10% FBS en 1% antibiotica op 35 mm poly-d-lysine beklede glazen bodem kweekschalen (MatTek, MA). Cellen worden uitgeplaat bij voldoende dichtheid snelle verspreiding bevorderen, maar niet zoveel dat cellen zijn begroeid en samengeklonterd op het moment van weergave.
  2. Behandel geselecteerd celmonsters met ADI (0,3 ug / ml) in PBS.
  3. Ongeveer 1 uur voorafgaand aan de beeldvorming, verdunnen 1.5 pi Lysotracker Red DND-99 (Invitrogen, CA) met 20 ml RPMI. bevattende 10% FBS en 1% antibiotica. Met oplossingen die ADI voor geselecteerde monsters. Warm alle media tot 37 ° C voorafgaand aan het toevoegen aan de kweekschaal.
  4. Incubeer cellen met RPMI bevattende Lysotracker Rood DND-99 gedurende 15-45 min bij 37 ° C.
  5. Ongeveer 30 minuten voorafgaand aan de beeldvorming, zet de weerstation milieu-behuizing om de temperatuur tot 37 ° C en 5% CO 2 (met Humidified lucht).
  6. Was de cellen met PBS en media vervangen door standaard RPMI dat slechts 10% FBS en 1% antibiotica. Voeg ADI monsters aangegeven.
  7. Mount 35 mm dekglaasje-bodem cultuur gerechten in aangepaste adapter (Applied Precision, Inc, WA), en de plaats op de microscoop podium. Gebruik immersie-olie (brekingsindex 1,520) op de 60X 1,42 NA objectief, en plaats de gemonteerde cultuur schotel op het podium.

3. Deel 3: Deconvolutie Microscopy and Analysis

Het protocol in deze sectie veronderstelt het gebruik van de DeltaVision Personal DV deconvolutie microscoop en bijbehorende SoftWorX applicatie suite (Applied Precision, Inc, WA).

  1. Schakel microscoop systeem, inclusief aankoop werkstation en instrument controller. Open Resolve3D toepassing te initialiseren de microscoop podium en zet de xenon lichtbron. Laat 10 min voor de lichtbron te warmen en te bereiken stabiele omstandigheden.
  2. Voeg eendruppel immersie olie (brekingsindex 1,520 voor levende monsters bij 37 ° C en 1,516 voor vaste monsters bij kamertemperatuur) op de 60X 1,42 NA objectieflens en centrum specimen (dekglas beneden) via objectieflens.
  3. Met behulp van bright-field of externe verlichting en de grove scherpstelling knop, langzaam verhogen het objectief totdat de hiel van immersie olie maakt contact met de omgekeerde deksel glas. (Vanaf dit punt, moet de cellaag in beeld binnen een paar slagen van de fijne scherpstelling knop komen). Bij het werken met vaste monsters op de dia's, is het raadzaam om cellen binnen of in de buurt van gebieden met luchtbellen te vermijden. Bij het bekijken met levende monsters op de glazen onderste schaal, vermijd de objectieflens buiten de grenzen van de glazen dekglaasje bewegen.
  4. Autofagosomen kunnen worden geïdentificeerd door eGFP signaal (groen). Lysosomen worden geïdentificeerd door Lysotracker Rood (levend monster) of anti-Lamp1 fluorescerend antilichaam (vaste sample). Celkernen worden geïdentificeerd door DAPI staining (vaste sample).
  5. Selecteer de gewenste gezichtsveld. Idealiter zou cellen goed fluorescent signaal vertonen in alle geschikte kanalen, voldoende goed vastzitten en verspreid op het dekglaasje oppervlak, zodat de intracellulaire inhoud zijn eenvoudig te visualiseren. Kleine aanpassingen in laterale x, y en z-focus kan worden geregeld door computer met de Acquire3D interface. Stel binning op 1x1 of 2x2, afhankelijk van de gewenste gezichtsveld (meer cellen kan worden gezien in het veld bij binning is ingesteld op 2x2).
  6. Voor een bepaald beeld door de buik van een cel, stelt u de belichting parameters (bv.% zendvermogen en belichtingstijd), zodanig dat de maximale pixelintensiteit niet meer dan 3000 telt. In het algemeen, moet% transmissie worden zo laag mogelijk, zonder verhoging van de overeenkomstige belichtingstijd dan 1 sec. Herhaal deze procedure voor elke fluorescentie kleur af te beelden en voor elke afzonderlijke gezichtsveld om de hoogste kwaliteit beelden te verkrijgen.
  7. Stel de upper en ondergrenzen van de Z-stack van de scherpstelling net iets meer dan de boven-en onderkant van het celmonster, respectievelijk. Het totale aantal afbeeldingen in een bepaalde Z-stack wordt dus bepaald door deze grenzen en de afstand tussen lagen (standaardwaarde: 0,2 urn).
  8. Om bewegingsartefacten te minimaliseren tijdens beeldopname, raden wij u aan de beeldopname mode om "golflengte dan z-stack 'voor vaste monsters, en" z-stack dan golflengte "voor live-samples.
  9. Fluorescentie beelden worden deconvolved behulp SoftWorX (Applied Precision, WA) en later geanalyseerd met behulp Volocity (Improvision, nu Perkin Elmer, MA).

4. Deel 4: Super-resolution, Structured-verlichting (OMX) Microscopy

Het protocol in deze sectie heeft betrekking op het gebruik van de OMX Structured Illumination Microscope (Applied Precision, WA).

  1. Schakel de hoofdschakelaar en de gewenste lasers (410 nm, 488 nm, en / of 532 nm). Wacht 20 kmn de lasers te thermisch gestabiliseerd.
  2. Voeg immersie-olie (brekingsindex 1,516 voor vaste monsters bij RT) op de 60X 1,42 NA objectief. Als er bellen worden gezien in de olie druppel, het reinigen van de objectieve en opnieuw olie bijvullen.
  3. Plaats monster dia op het podium en indien nodig, laat 10 min. voor de cellen om zich te vestigen op de dekglaasje.
  4. Initialiseer de acquisitie programma. Gebruik fluorescentie verlichting om de scherpstelling aan te passen tot een scherpe contouren van de cel kan worden gezien. (Er dient te allen tijde worden genomen om de blootstelling van de cellen te beperken tot fluorescentie excitatie, totdat de eigenlijke beeld acquisitie).
  5. Een spiraal mozaïek scan kan worden verworven om een ​​voorbeeld van grotere gebieden van het monster aan cellen of gebieden van belang te selecteren. Het wordt aanbevolen om korte belichtingstijden (1-10 msec) en lage excitatie vermogen (0,1-1% transmissie) te gebruiken tijdens het scannen van het monster of het vinden van targets.
  6. Identificeer autofagosomen door GFP-fluorescentie LC3. Identificeer lysosomen door Alexa Fluor 555 anti-LAMP(Lysosoom-geassocieerde membraaneiwitten) en celkernen met DAPI (gefixeerde monsters).
  7. Kies experimentele omstandigheden waaronder excitatie golflengte, beeldgebied (bijv. 512x512), stack dikte, belichtingstijd, en lasertransmissie percentage. Voor super opgelost beelden, ervoor zorgen dat de optie gestructureerde verlichting wordt ingeschakeld. Voor deconvolutie microscopie op de OMX, selecteert u de optie conventionele verlichting.
  8. Voor de beste reconstructieresultaten, selecteert experimentele omstandigheden zodat het maximale aantal intensiteit tussen 10.000 en 15.000 tijdens de overname. Als photobleaching is een punt van zorg, kan beeldvorming bij een lagere blootstelling (tellingen tussen 5000 en 10000) worden gebruikt. Idealiter dient het telt niet meer dan een factor twee verminderen gedurende de gehele acquisitie en daalt met meer dan een factor van vier worden vermeden. Verlaag zo nodig de stack dikte een aanhoudende tellen intensiteit waarborgen. De camera verzadigt bij 64.000 counts, dus maximaal intensity mag nooit meer dan dit. Voor goede monsters, vonden we de experimentele condities te zijn 10 ~ 50 msec belichtingstijd met 1% lasertransmissie. Lichte en fotostabiele monsters die herhaaldelijk kan worden afgebeeld voorkeur. Een stabiele vlek is vereist voor time-lapse, super opgelost afbeeldingen.
  9. Om ruis, een 95MHz uitleessnelheid (Gemiddelde snelheid optie) en de acquisitie tijd van 2 msec of meer te verminderen wordt aanbevolen. Verhoogde artefacten worden verkregen in de gereconstrueerde afgebeeld, wanneer monster beweegt tijdens de overname. Vanwege dit effect, zijn korte blootstelling aanbevolen voor niet-klevende of snel bewegende cellen.
  10. Multichannel beeldvorming kan gelijktijdig of achtereenvolgens worden uitgevoerd. Sequentiële modus wordt voor minder overspraak en wordt dus aanbevolen.
  11. Te verminderen photobleaching, in het algemeen aanbeveling om de afbeelding met langere golflengten eerste (532 nm, 488 nm, en vervolgens 410 nm). Voor de in figuur 3 experimentele resultaten, deze volgorde is omgekeerdd (bijvoorbeeld 48 nm, 532 nm en 410 nm) door de fotostabiliteit van dit monster.
  12. Stel de boven / ondergrens van de Z-stack door het bewegen van de microscoop podium tot aan de bovenkant / onderkant van de cellen is enigszins onscherp. De gewenste afstand tussen elke afbeelding moet constant worden gehouden op 0,125 micrometer voor super resolutie imaging, zoals reconstructie software krijgen deze waarde als standaard.
  13. Reconstrueren image stacks met SoftWorX (Applied Precision, WA) en het analyseren van het gebruik Volocity 6.0 (Perkin Elmer, MA).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De afbeelding die wordt weergegeven in Figuur 1 de fysieke veranderingen die optreden in CWR22-cellen gedurende de eerste 80 min van autofagie. In deze en andere studies (niet weergegeven) we consistent waargenomen: (1) verplaatsing van de kern van het celcentrum, (2) reductie van adhesie focal points, en (3) de algemene translocatie van autophagosomes en lysosomen naar het midden van de cel. Verder hebben we ook een kleine toename colocalization (geel aangegeven) tussen autophagosomes (groen) en lysoso...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Terwijl de directe waarneming van cellen gelabeld met fluorescerende probes tegen LC3 wordt algemeen aanvaard als een standaard methode om autofagocytische respons 6, kwantitatieve 3D beeldvorming van hetzelfde systeem (zoals wij gedaan hebben) biedt ongekende informatie en details over het complexe proces van cellulaire autofagie bevestigen . In het bijzonder zien we dat honderden (zo niet duizenden) van autofagosomen in levende cellen worden gevormd binnen 80 min van autofagie inductie. Ook zien we zeer int...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Geen belangenconflicten verklaard.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Grant ondersteuning: NIH CA165263, NIH CA150197, NIH CA150197S1 (HJ Kung), NIH CA150197S1 (CA Changou), NSF PHY-0120999 Centrum voor Biophotonics Wetenschap & Technologie (DL Wolfson, FYS Chuang), DOD PC073420 (RJ Vet), The Research Raad van Noorwegen, Leiv Eiriksson Travel Grant 209286/F11 (BS Ahluwalia). HJ Kung erkent ook de steun van de Auburn Gemeenschap Cancer Endowment Fund. RJ Vet erkent ook de steun van de J. McDonald schenking.

Wij danken dr. Jenny Wei-Jen Kung en Dr Bor-wen Wu bij DesigneRx voor genereuze aanbod van de ADI.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Arginine Deiminase (ADI)DesigneRx
HEPESSigmaH4034
CaseïneSigmaC5890
ParaformaldehydeFisher4042
SaponineSigmaS4521
Alexa anti-muis 555InvitrogenA21422
Alexa anti-konijn 647InvitrogenA21244
LysoTracker Red DND-99InvitrogenL7528
anti-Lamp1DSHBH4A3
anti-CadherinCell Signaling#3195
SlowFade GoldInvitrogenS36936
35 mm poly-d-lysine gecoate glazen bodemplaatMatTekP35GC-1.5-1.4-C
Nr. 1, 22 mm dekglasCorning#2865-22
MicroscoopglaasjesGlobe Scientific1324G

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kim, R. H., Coates, J. M., Bowles, T. L., McNerney, G. P., Sutcliffe, J., Jung, J. U., Gandour-Edwards, R., Chuang, F. Y., Bold, R. J., Kung, H. J. Arginine deiminase as a novel therapy for prostate cancer induces autophagy and caspase-independent apoptosis. Cancer Res. 69 (2), 700-708 (2009).
  2. Miyazaki, K., Takaku, H., Umeda, M., et al. Potent growth inhibition of human tumor cells in culture by arginine deiminase purified from a culture medium of a Mycoplasma-infected cell line. Cancer Res. 50, 4522-4527 (1990).
  3. Takaku, H., Matsumoto, M., Misawa, S., Miyazaki, K. Anti-tumor activity of arginine deiminase from Mycoplasma argini and its growth-inhibitory mechanism. Jpn. J. Cancer Res. 86, 840-846 (1995).
  4. Levine, B., Klionsky, D. J. Development by self-digestion: molecular mechanisms and biological functions of autophagy. Dev. Cell. 6, 463-477 (2004).
  5. Mizushima, N., Levine, B., Cuervo, A. M., Klionsky, D. J. Autophagy fights disease through cellular self-digestion. Nature. 451, 1069-1075 (2008).
  6. Kabeya, Y., Mizushima, N., Ueno, T. LC3, a mammalian homologue of yeast Apg8p, is localized in autophagosome membranes after processing. EMBO J. 19, 5720-5728 (2000).
  7. Pattingre, S., Espert, L., Biard-Piechaczyk, M., Codogno, P. Regulation of macroautophagy by mTOR and Beclin 1 complexes. Biochimie. 90, 313-323 (2008).
  8. Maiuri, M. C., Criollo, A., Tasdemir, E., et al. BH3-only proteins and BH3mimetics induce autophagy by competitively disrupting the interaction between Beclin 1 and Bcl-2/Bcl-X(L). Autophagy. 3, 374-376 (2007).
  9. Crighton, D., Wilkinson, S., O'Prey, J., et al. DRAM, a p53-induced modulator of autophagy, is critical for apoptosis. Cell. 126, 121-134 (2008).
  10. Dillon, B. J., Prieto, V. G., Curley, S. A., et al. Incidence and distribution of argininosuccinate synthetase deficiency in human cancers: a method for identifying cancers sensitive to arginine deprivation. Cancer. 100, 826-833 (2004).
  11. Dale, B. M., McNerney, G. P., Thompson, D. L., et al. Cell-to-cell transfer of HIV-1 via virological synapses leads to endosomal virion maturation that activates viral membrane fusion. Cell Host & Microbe. 10 (6), 551-562 (2011).
  12. Cogger, V. C., McNerney, G. P., Nyunt, T., et al. Three-dimensional structured illumination microscopy of liver sinusoidal endothelial cell fenestrations. J. Struct. Biol. 171 (3), 382-388 (2010).
  13. York, A. G., Parekh, S. H., Nogare, D. D., et al. Resolution doubling in live, multicellular organisms via multifocal structured illumination microscopy. Nat. Methods. 9 (7), 749-754 (2012).
  14. Gustafsson, M. G. L. Surpassing the lateral resolution limit by factor of two using structured illumination microscopy. Journal of Microscopy. 198, 82-87 (2000).
  15. Shao, L., Kner, P., Rego, E. H., Gustaffson, M. G. Super-resolution 3D microscopy of live whole cells using structured illumination. Nat. Method. 8 (12), 1044-1046 (2011).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Autophagy Analysis3D Fluorescence MicroscopyProstate Cancer CellsFluorescence ImagingImage Analysis SoftwareWidefield DeconvolutionStructured IlluminationAutophagosome LysosomeQuantitative ImagingLive Cell Imaging

Related Articles