Genetische Modificatie en recombinatie van speekselklier Orgel culturen

Samenvatting

Een techniek om genetisch te manipuleren epitheelcellen binnen het gehele Ex vivo Gekweekte embryonale muis submandibulaire klieren (SMG) met behulp van virale gen-overdracht wordt beschreven. Deze methode maakt gebruik van het aangeboren vermogen van SMG epitheel en mesenchym spontaan recombineren na scheiding en infectie van epitheliale rudiments met adenovirale vectoren.

Samenvatting

Vertakkende morfogenese optreedt tijdens de ontwikkeling van vele organen en de muis embryonale submandibulaire klier (SMG) is een klassieke model voor de studie van vertakking morfogenese. In ontwikkelingslanden SMG impliceert dit proces iteratieve stappen van epitheliale knop en kanaal vorming uiteindelijk leiden tot een complex netwerk van vertakte acini en leidingen, die dienen te produceren wijzigen en / transporteren speeksel, respectievelijk in de mondholte ^{1 - 3.} De epitheel-geassocieerde basaalmembraan en aspecten van de mesenchymale compartiment zoals de mesenchymcellen, groeifactoren en extracellulaire matrix, geproduceerd door deze cellen zijn essentieel voor de vertakking mechanisme, hoewel hoe de cellulaire en moleculaire gebeurtenissen worden gecoördineerd echter niet goed begrepen ⁴ . De studie van de moleculaire mechanismen die epitheliale morfogenese ons begrip van ontwikkelingsmechanismen en geeft inzicht in mogelijke geregenereerdtieve geneeskunde benaderingen. Deze studies door het ontbreken van effectieve methoden voor genetische manipulatie van de speekselklieren epitheel belemmerd. Momenteel adenovirale transductie de meest effectieve methode voor het richten epitheelcellen in volwassen klieren in vivo ^5. Echter in embryonale explantaten, dichte mesenchym en de kelder membraan rond de epitheelcellen belemmert virale toegang tot de epitheelcellen. Als het mesenchym wordt verwijderd, kan het epitheel worden getransfecteerd met adenovirussen en epitheliale beginselen kunnen hervatten vertakking morfogenese in aanwezigheid van Matrigel of laminine-111 ^6,7. Mesenchym-vrij epitheliale rudiment groei vereist ook extra suppletie met oplosbare groeifactoren en niet volledig herhalen vertakking morfogenese als het zich voordoet in intacte klieren ^8. Hier beschrijven we een techniek die adenovirale transductie van epitheelcellen en cultuur van de getransfecteerde e vergemakkelijktpithelium met bijbehorende mesenchym. Na microdissectie van de embryonale SMG, verwijdering van het mesenchym en virale infectie van het epitheel met een GFP-bevattende adenovirus, aangetoond dat het epitheel spontaan recombineert met ongeïnfecteerde mesenchym met vermelding intact SMG glandulaire structuur en vertakking morfogenese. De genetisch gemodificeerde epitheliale celpopulatie kan eenvoudig worden gecontroleerd met standaard fluorescentiemicroscopiemethodes als fluorescent-gemerkte adenovirale constructen gebruikt. Het weefsel recombinatie hier beschreven methode is momenteel de meest efficiënte en toegankelijke methode voor transfectie van epitheelcellen met een wild-type of mutant vector in een complex 3D weefsel construct dat niet nodig genereren van transgene dieren.

Protocol

Het protocol bestaat uit vier stappen, zoals afgebeeld in figuur 1. Alle stappen worden beschreven in detail. Adenovirus constructie en virale zuivering te worden uitgevoerd vóór de orgaanroof voor gebruik in de genetische transductie van epitheliale rudiments ontleed. Alle standaard BSL-2 veiligheidsmaatregelen moeten worden gevolgd bij het werken met adenovirussen.

1. Muis embryonale Submandibulaire Gland (SMG) Oogst en Microdissection

1. Euthanaseren timed-zwangere vrouwelijke muizen (outbred stam CD-1 of ICR) met behulp van CO ₂ narcose, gevolgd door cervicale dislocatie en oogst snaren van de muis embryo's op embryonale dag 13 (E13, 3-5 epitheliale knoppen) volgende procedures zijn goedgekeurd door de institutionele IACUC commissie. De dag van vaginale plug ontdekking wordt aangewezen als E0. Speekselklieren kunnen worden geoogst en gekweekt in de E12 stadium wanneer er een primaire knop en steel met spleten beginnendete starten. SMG voorafgaand aan deze fase vereisen verschillende kweekomstandigheden dan hier aangegeven.
2. Breng embryo strings in steriele 10 cm weefselkweekschalen gevuld met 25 ml DMEM / Ham 's F12 Medium (F12) zonder fenolrood (Life Technologies), aangevuld met 100 U / ml penicilline en 100 ug / ml streptomycine (pen-strep, Life Technologies).
3. Met een steriel scalpel (# 11 bladen) en tang (# 5, Fine Science Tools, 11252-20), verwijder de embryo's van de zakjes in een aparte 10 cm schotel met 25 ml DMEM/F12 + pen-strep.
4. Sever het embryo hoofden met een schuine snede net onder de onderkaak.
5. Isoleer de onderste kaken van de hoofden onder een stereo dissectiemicroscoop met een doorvallend licht-basis (Nikon SMZ645 of gelijkwaardig) met een snee onder de bovenkaak. Plaats de weefsels boven op een extra stuk glas in plaats van direct op het glas component van de microscoop base.
6. Verzamel de onderste kaken in 3 ml van DMEM/F12 + pen-strep in een steriele 35 mm weefselkweek schotel.
7. Plaats een onderkaak slice op de dissectiemicroscoop fase zodat de tong aan de onderzijde van de plak, maar wijst naar de 12:00 uur positie.
8. Met behulp van een kant van twee gekruiste tang in een scharende beweging, te verwijderen en gooi het onderste 1/3 ^e van de onderkaak slice.
9. Draai het segment 90 ° naar rechts (als rechts) en via een scharende cut met de tang, snij het bovenste gedeelte van de onderkaak slice (zonder dat de tong) halverwege het segment.
10. Schil de overtollige weefsel weg en verwijder deze om de SMG eronder blootlegt. Er zal aan weerszijden nabij de basis van de tong.
11. Met behulp van een pincet ingedrukt te houden het weefsel door de tong, gebruik dan de andere tang om de SMG los te maken uit de tong. Herhaal dit voor de andere klier.
12. Verzamel de gemicrodissecteerde speekselklieren in 3 ml DMEM/F12 + pen-strep in een nieuwe steriele 35 mm weefselcultuur schotel. Let op: de grotere submandibulaire klieren (3-5 epitheliale knoppen), samen met de aangesloten kleinere sublinguale klier (1 knop) kan worden intact gekweekt door het overslaan van stap 4 en het uitvoeren van de stappen 4.1, 4.3, en 4.4, zoals eerder beschreven ^2,8.

2. SMG Epitheliale rudiment Scheiding

1. Place 5 (of meer) speekselklieren in een glazen bodem, 50 mm diameter microwell schaal (MatTek Corporation, P50G-1.5-14-F) met 200 pl gebalanceerde zoutoplossing Hank's (HBSS ontbreekt Ca ^{+ +} of Mg ^{+ +,} Life Technologies) bevattende 0,4% (v / v) dispase (Life Technologies, cat.. 17,105-041) en gedurende 15 min geïncubeerd bij 37 ° C.
2. Na de incubatie met een steriele pipet 200 pi voorzichtig zuigen de dispase oplossing zonder de klieren. Onmiddellijk voeg 200 ul DMEM/F12 medium dat 5% (w / v) BSA (DMEM/F12-BSA, vooraf gesteriliseerde met een 0,22 urn filter) de dispase neutraliseren.
3. Onder een dissectiemicroscoop, met behulp van een pincet met fijne tips (# 5 Dumostar, Fine Science Tools, 11295-20), voorzichtig scheiden de losgemaakte mesenchym van rond de SMG epitheliale knoppen en kanalen, en zorg te vertrekken, het epitheel intact .
4. Pre-nat een steriele 200 ul pipet tip met DMEM/F12-BSA media en voorzichtig pipetteren uit de epitheliale rudiments in een nieuwe diameter van 50 mm microwell schotel met 200 ul van DMEM/F12 + pen-strep. Gebruik een hoge kwaliteit 200 ul pipet tip met een gladde rand.
5. In het gerecht dat het mesenchym stukken bevat, moet u alle niet-mesenchymale weefsels waaronder de sublinguale klieren en eventuele vrijstaande glandula submandibularis knoppen.

3. Adenovirale infectie van epitheliale Rudiments

1. Maak 200 ul virale infectie media door verdunning van het adenovirus plaats in DMEM/F12 + pen-strep in een microcentrifugebuis zodat de titer van de resulterende oplossing 1x10 ⁸ -10 ⁹ PFUs. Deoptimale titer nodig is voor verschillende virussen kunnen variëren. Het is belangrijk om cesium chloride (CsCl)-gezuiverde virale preparaten voor optimale opname efficiëntie.
2. Verwijder de media uit het schaaltje met de vijf epitheliale rudiments. Voeg snel 200 ul van de media infectie, waarbij de beginselen natte allen tijde. Neem de nodige voorzorgsmaatregelen bij het hanteren van het virus en de verwijdering van verontreinigde pipet tips. Desinfecteer enig virus-besmette oppervlakken met 10% bleekwater oplossing.
3. Verplaats de epitheliale rudiments ver van elkaar forceps om te voorkomen dat aan elkaar kleven en ze naar de bodem van de plaat mogelijk te maken. Incubeer rudiments in virale media gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Tijdens de incubatie scheiden rudiments, als ze zich dicht bij elkaar. Overmatige schommelstoel of beweging zal de klieren samen te klonteren.
4. Na incubatie, verwijdert u de virale-bevattende media en gooi de juiste, zorg ervoor dat u de r verstorenudiments. Voeg 200 ul van DMEM/F12 + pen-strep. Herhaal deze wash minstens twee keer en vervangen door 200 ui DMEM/F12 + pen-strep media. Deze wasbeurten zijn essentieel voor een virus dat niet sterk aan het epitheel verwijderen en infectie van het mesenchym voorkomen.
5. Incubeer epitheliale rudiments met 200 ml DMEM/F12 die 2% (v / v) Matrigel (BD Biosciences, 356231) gedurende 20 minuten. We vinden dat dit korte incubatie in Matrigel de regressie van bestaande spleten minimaliseert tijdens de eerste kweekperiode, maar deze stap kan worden afgezien als blootstelling aan Matrigel niet gewenst.

4. Ex vivo cultuur van gerecombineerde SMG

1. Plaats elke rudiment, een voor een, met behulp van een pre-wet 200 ul pipetpunt, op een inkeping (sneetje) 13 mm, 0,1 urn Nuclepore Track-Etch membraanfilter (Whatman) zwevend boven 200 pl kweekmedium ( 5 rudiments / filter) in een glazen bodem microwell plaat. De cultuur mediais: DMEM/F12 + pen-strep dat 50 ug / ml transferrine en 150 ug / ml ascorbinezuur, zoals eerder beschreven ^2,8. Transferrine is bekend dat het voortbestaan ​​te stimuleren en vertakking morfogenese van speekselklier en andere organen explantaten ^9. Toevoeging van ascorbinezuur is aangetoond dat SMG vertakking stimuleren. ¹⁰ Het is bekend om als een cofactor in talrijke hydroxylering reacties van metabolisme (zoals proline hydroxylering in collageenvezelvorming ¹¹⁾ en stimuleert fibronectine en laminine productie in andere orgaansystemen explantaten ^12.
2. Verwijder zoveel media bovenop de filter mogelijk na het toevoegen van elk epitheliale rudiment. Teveel media bovenop de filter kan de filter te zinken, terwijl minder media maakt plaatsing van de beginselen en mesenchym veel gemakkelijker. Overmaat media kan worden verwijderd met een pipet of door forceps van de media tussen de tips grijpen.
3. Plaats mesenchym stukken weer afgeleidm drie tot vier klieren geplaatst en / of rond elk epitheliale rudiment. Verwijder eventuele extra media die rond de klieren om beweging van de mesenchym voorkomen uit de buurt van de eerste beginselen. Mesenchym uit meer klieren niet voordelig maar minder schadelijk kunnen zijn voor epitheliale rudiment groei.
4. Incubeer gerecombineerde SMG in een bevochtigde incubator (95% lucht / _5% CO2) bij 37 ° C gedurende 48 -72 uur, zoals gewenst.
5. Verwerven helderveld en / of fluorescerende beelden van levende klieren bij 0 uur (indien gewenst), 2 uur na recombinatie en elke 24 uur daarna op een omgekeerde, rechtop of stereo licht microscoop uitgerust met een digitale camera met een 4X of 5X vergroting doelstelling vangen de hele gerecombineerde klier in een enkel frame gezien. Beelden van de speekselklier tonen de beste contrast met behulp van de helderveld of plaats het juiste fase-ring geplaatst gedeeltelijk in het lichtpad (wat niet mogelijk is op volledig geautomatiseerde microscopen). Standard fasecontrast geent nodig, omdat de klier is dik en zorgt voor contrast.
6. Op de gewenste tijdstippen kan gerecombineerde SMG vast gedurende 20 minuten met fixatief oplossing gemaakt van 2% paraformaldehyde (PFA) in 1X PBS bevattende 5% (w / v) sucrose (interne celstructuur beter in stand houden van de cellen in een isosmotic staat). In tegenstelling tot 4% PFA, 2% PFA slaat een aanzienlijke hoeveelheid van het GFP signaal als het fixeermiddel volledig verwijderd na fixatie. Klieren worden bewaard tot 1 week in 1X PBS in het donker bij 4 ° C totdat whole mount immunocytochemie en confocale beeldvorming wordt uitgevoerd, zoals eerder ^3,6,13-15. Idealiter immunocytochemie en imaging snel worden uitgevoerd na bevestiging aan de beste beeldkwaliteit te verkrijgen. Klieren worden gelyseerd in RIPA buffer voor SDS-PAGE gevolgd door Western blot analyse.

Resultaten

De stroom van de belangrijkste experimentele stappen wordt geschetst in figuur 1. Een voorbeeld van een intact SMG, een geïsoleerde epitheliale rudiment en de bijbehorende mesenchym zijn weergegeven in figuur 2. Helderveld beelden van gerecombineerde SMG, die nog steeds ondergaan vertakkende morfogenese indien gekweekt ex vivo gedurende de aangegeven tijden, worden getoond in Figuur 3. Gerecombineerde klieren gekweekt gedurende 48 uur tot expressie epitheliale ...

Discussie

De ex vivo epitheliale-mesenchymale recombinatie techniek werd voor het eerst gepubliceerd voor submandibulaire speekselklieren in 1981 ^16. In dit protocol, we breiden de oorspronkelijke methode, met behulp van adenovirale infectie aan epitheliale cellen genexpressie te manipuleren in het kader van een gerecombineerde klier. Aangetoond dat het percentage van de epitheliale cellen geïnfecteerd met het adenovirus, dat het percentage cellen die zijn geïnfecteerd afhankelijk van de eigenschappen van de v...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Naam van de Reagens	Vennootschap	Catalogusnummer	Reacties
DMEM / Ham 's F12-medium zonder fenolrood	Life Technologies	21041-025
Penicilline en streptomycine	Life Technologies	15070-163	10X voorraad
Dispase	Life Technologies	17105-041	Bevriezen eenmalig gebruik monsters bij-20C
BSA	Sigma	A2934-100G	Fractie V, lage endotoxine
Adeno-X-GFP	BD Biosciences	8,138-1	Moet een hoge titer (1x10 10 pfu / ml) zijn. CsCl gezuiverde virussen effectiever zijn dan een kolom gezuiverd virus in deze assay.
16% Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15710	Verdund tot 2% in PBS met 5% sucrose (w / v)
1X fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS)	Life Technologies	70011-044	Bereid uit 10X voorraad
Balanced Salt Hank's oplossing	Life Technologies	14175095	no Calcium, geen magnesium, geen fenolrood
Transferrine	Sigma	T8158	25 mg / ml voorraadoplossing in DMEM/F12 media. Bevriezen eenmalig gebruik monsters bij-20C
L-ascorbinezuur (vitamine C)	Sigma	A4403	75 mg / ml voorraadoplossing in DMEM/F12 media.Freeze eenmalig gebruik monsters bij-20C
			Tabel 1. Lijst van reagentia die voor SMG recombinatie protocol.
10 cm steriel plastic schaaltjes	Corning	430167	Niet weefselkweek behandelde platen kunnen ook worden gebruikt.
Stereo ontleden microscoop met doorvallend licht-basis	Nikon	SMZ645	Eventuele stereo-dissectiemicroscoop kan worden gebruikt dat is voorzien van een doorvallend licht-basis.
35 mm weefselkweekplaten	Valk	353001	Niet weefselkweek behandelde platen kunnen ook worden gebruikt.
Diameter van 50 mm microwell gerechten	MatTek Corporation	P50-G-1.5-14F
Nuclepore Track-Etch membraanfilters	Whatman papier	110405	13 mm diameter, 0,1 mm poriegrootte
Widefield fluorescentiemicroscoop	Carl Zeiss, USA	Axio Observer Z1	Elke fluorescentie microscoop (rechtop, inverted of stereo dissectiemicroscoop) kan worden gebruikt om GFP expressie controleren bij een lage vergroting met een aangesloten digitale camera.
Confocale microscoop	Leica Microsystems	TCS SP5	Confocale microscopie is nodig om gedetailleerde celstructuren te zien. Elke confocale microscoop kunnen worden gebruikt.
Timed-zwangere vrouwelijke muizen, stam CD-1 of ICR	Charles River Labs		Embryo's geoogst op dag 13 (dag met plug ontdekking aangeduid als dag 0).
Scalpel # 11	Fine Science Tools	10.011-00
Scalpelhouder # 3	Fine Science Tools	10.003-12
Dumont # 5 tang inox-legering, 0.05mm X 0.02mm	Fine Science Tools	11.252-20	Ideaal voor het oogsten van klieren uit embryo's
Dumont # 5 pincet dumostar legering, 0.05mm X 0.01mm	Fine Science Tools	11.295-20	Fine tips zijn nodig voor het verwijderen van epitheel mesenchym. Tungsten naalden kunnen ook worden gebruikt.
			Tabel 2. Apparatuur gebruikt in de SMG recombinatie protocol.