Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Voorbereiding van de Tumor antigenen opgeladen Mature dendritische cellen voor immunotherapie

17.9K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/50085

⸱

1 augustus 2013

 ,  ,  ,  ,  , 
1Cancer Institute, NYU Langone Medical Center, 2Infectious Diseases, NYU Langone Medical Center

In dit artikel

Samenvatting

De meest gebruikte methode voor het genereren van grote aantallen autologe dendritische cellen (DCs) voor gebruik bij tumor immunotherapie beschreven. De methode maakt gebruik van IL-4 en GM-CSF om DCs te onderscheiden van monocyten. De onrijpe DCs worden gestimuleerd om te rijpen en daarna beladen met antigenen voordat ze geïnjecteerd terug in de patiënt.

Samenvatting

Hoewel uit klinische studies hebben aangetoond dat antigeen-beladen DC vaccins veilig en veelbelovende therapie voor tumoren 1 zijn, blijft hun klinische werkzaamheid vast te stellen. De hieronder beschreven methode, opgesteld in overeenstemming met de Good Manufacturing Process (GMP) richtlijnen, is een optimalisatie van de meest voorkomende ex vivo bereidingswijze voor het genereren van grote aantallen DCs voor klinische studies 2.

Onze werkwijze gebruikt de synthetische TLR 3 agonist Polyinosinic-Polycytidylic zuur poly-L-lysine Carboxymethylcellulose (Poly-ICLC) bij de DC stimuleren. Onze eerdere studie aangetoond dat Poly-ICLC is de meest krachtige individuele rijping stimulans voor humane DCs zoals beoordeeld door een opregulatie van CD83 en CD86, inductie van interleukine-12 (IL-12), tumornecrosefactor (TNF), interferon gamma-geïnduceerde proteïne 10 (IP-10), interleukmin 1 (IL-1) en type I interferonen (IFN) en minimale interleukine 10 (IL-10) productie. DCs gedifferentieerd uit ingevroren perifeer bloed mononucleaire cellen (PBMC's) verkregen door leukaferese. PBMC's worden geïsoleerd door Ficoll gradiëntcentrifugatie en ingevroren in porties. Op dag 1 worden PBMC's ontdooid en uitgeplaat op weefselkweek kolven te selecteren op monocyten die na 1-2 uur incubatie bij 37 ° C in de weefselkweek incubator zich aan het plastic oppervlak. Na incubatie worden de lymfocyten afgewassen en hechtende monocyten gekweekt gedurende 5 dagen in de aanwezigheid van interleukine-4 (IL-4) en granulocyt macrofaag kolonie-stimulerende factor (GM-CSF) te differentiëren tot rijpe DCs. Op dag 6 worden onrijpe DC gepulst met keyhole limpet hemocyanine (KLH) eiwit dat dient als een controle voor de kwaliteit van het vaccin en kan de immunogeniciteit van het vaccin te verhogen 3. De DCs worden gestimuleerd om te rijpen, geladen met peptide-antigenen, en overnacht geïncubeerd. Op dag 7 werden de cellen gewassen en bevroren in hoeveelheden van 1 ml met4-20 x 10 6 cellen met behulp van een gecontroleerde-tarief vriezer. Veel vrijgave testen voor de partijen van DC's wordt uitgevoerd en moeten voldoen aan de minimale specificaties voordat ze geïnjecteerd in patiënten.

Protocol

1. Isolatie en cryopreservatie van PBMC 4

  1. Aseptisch spike een van de toegangspoorten in de leukaferese zak met behulp van een plasma transferset. Met behulp van een 60 ml spuit, breng de leukaferese verkregen van patiënten in een steriele 500 ml fles.
  2. Het volume van de leukaferese zijn oorspronkelijke volume met kamertemperatuur RPMI 2x. Meng goed.
  3. Meng voorzichtig de fles Ficoll-Paque PLUS. Voeg 12 ml Ficoll-Paque PLUS in steriele 50 ml conische buis.
  4. Zachtjes laag 30 ml van het verdunde leukaferese product aan elke steriele 50 ml conische buis met Ficoll. Wees voorzichtig dat u de interface tussen de Ficoll en celsuspensie verstoren.
  5. Herhaal de stappen 1.3 en 1.4 totdat alle leukaferese is gelaagd.
  6. Centrifugeer de 50 ml conische buizen bij 1000 xg gedurende 20 min bij kamertemperatuur zonder rem.
  7. Oogsten zorgvuldig de bewolkte laag van PBMC van elke buis en Transfer om nieuwe steriele 50 ml buizen.
  8. Voeg RPMI aan elke buis tot een eindvolume van 50 ml. Meng voorzichtig door inversie.
  9. Centrifugeer de cellen bij 500 g gedurende 10 min bij 4 ° C met volledige rem.
  10. Verwijder de bovenstaande vloeistoffen van elke buis. Resuspendeer de celpellet van elke buis en voeg RPMI tot een eindvolume van 50 ml. Meng voorzichtig door inversie.
  11. Centrifugeer de cellen bij 500 g gedurende 6 minuten bij 4 ° C.
  12. Verwijder de bovenstaande vloeistoffen van elke buis. Resuspendeer en zwembad samen de cel suspensies in een 50 ml conische buis.
  13. Breng het volume van de samengevoegde PBMC aan met 50 ml RPMI meer. Meng voorzichtig door inversie.
  14. Centrifugeer de cellen bij 300 g gedurende 6 minuten bij 4 ° C.
  15. Verwijder het supernatant. Resuspendeer de celpellet in 50 ml RPMI. Meng voorzichtig om uniforme celsuspensie te garanderen.
  16. Tel het aantal cellen en levensvatbaarheid van de cellen te bepalen. Bereken het totale aantal levensvatbare cellen.
  17. Centrifugeer de cellen bij 300Xg gedurende 6 min bij 4 ° C. Bereid de bevriezing media. Bevriezing media bestaat uit 10% Dimethylsulfoxide (DMSO; Miltenyi Biotec) in menselijk AB-serum (Valley Biomedical).
  18. Verwijder het supernatant. Resuspendeer de cellen in een eindconcentratie van 2 x 10 8 cellen / ml in koude vriesmedium.
  19. Maak porties van 1 ml in 1,8 ml cryovials.
  20. Breng de cryovials in de gecontroleerde-tarief vriezer en beginnen met het invriezen run, Programma 1. Aan het einde van de run, dragen de bevroren cryovials onmiddellijk in de dampfase van vloeibare stikstof vriezer.

2. Dag 0: Differentiatie van dendritische cellen uit monocyten

  1. Voeg 30 ml van RPMI / 1% autoloog plasma naar een steriele 50 ml conische buis.
  2. Dooi porties van bevroren PBMCs door voorzichtig schudden in het 37 ° C waterbad. Toen helemaal ontdooid, breng de inhoud van de flesjes aan de steriele 50 ml conische buis. Meng goed.
  3. Centrifugeer de cellen gedurende 6 minbij 500 x g bij kamertemperatuur. Verwijder het supernatant en resuspendeer de gepelleteerde cellen in een klein volume van RPMI / 1% autoloog plasma. Voeg dan meer RPMI / 1% autoloog plasma op een eindvolume van 50 ml. Meng goed.
  4. Centrifugeer de cellen opnieuw gedurende 6 min bij 500 x g bij kamertemperatuur. Zuig het supernatant en resuspendeer de pellet in 50 ml RPMI / 1% autoloog plasma. Meng goed.
  5. Tel het aantal cellen en levensvatbaarheid van de cellen te bepalen. Bereken het totale aantal levensvatbare cellen.
  6. Plaat 1.40 x 10 8 cellen in 40 ml RPMI / 1% autoloog plasma op 225 cm 2 EasyFlask. Herhaal dit totdat alle cellen zijn bedekt.
  7. Incubeer de EasyFlasks plat op zijn zijkant 1-2 uur bij 37 ° C in de weefselkweek incubator met 5% CO2 om de monocyten te houden aan de kolf.
  8. Wanneer de incubatie is voltooid, verwijdert de EasyFlask uit de incubator en tweemaal spoelen aan de niet-hechtende cellen te verwijderen using 30 ml voorverwarmde RPMI.
  9. Na de tweede wasbeurt, voeg 40 ml van RPMI / 1% autoloog plasma met 400-1,000 IU / ml IL-4 en 100-1000 IU / ml GM-CSF 5-8. Voor dit protocol, gebruiken we 400 IU / ml IL-4 en 100 IU / ml GM-CSF.
  10. Incubeer de EasyFlasks gedurende 2 dagen bij 37 ° C in de weefselkweek incubator met 5% CO2.

3. Dag 2: Het voeden van dendritische cellen met IL-4 en GM-CSF

  1. Voeg 4 ml RPMI / 1% autoloog plasma 400-1,000 IU / ml IL-4 en 100-1000 IU / ml GM-CSF aan elke EasyFlask. Meng door schudden en schommelen op zijn kant.
  2. Incubeer de EasyFlasks gedurende 3 dagen (tot dag 5) bij 37 ° C in de weefselkweek incubator met 5% CO2.

4. Dag 5: Het oogsten van onrijpe dendritische cellen

  1. Oogst de kweken door krachtig wervelen kolven en door pipetteren tot niet-hechtend en losjes hechtende cellen te resuspenderen. Breng degeoogste cellen om nieuwe 50 ml conische buizen.
  2. Centrifugeer de buizen bij 500 xg gedurende 6 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder het supernatant en resuspendeer de celpellet in 50 ml RPMI / 1% autoloog plasma. Meng goed.
  3. Tel het aantal cellen en levensvatbaarheid van de cellen te bepalen. Bereken het totale aantal levensvatbare cellen.
  4. Centrifugeer de buizen bij 500 xg gedurende 6 minuten bij kamertemperatuur. Plaat 1-2 x 10 6 cellen per putje in 3 ml RPMI / 1% autoloog plasma met 400 IU / ml IL-4 en 100 IU / ml GM-CSF in 6-well weefselkweekplaten.
  5. Incubeer de platen bij 37 ° C in de weefselkweek incubator met 5% CO 2 overnacht.

5. Dag 6: Rijping en Antigen Laden van dendritische cellen

  1. Voeg 10 ug / ml KLH tot 1/3 van de putjes in de 6 putjes. Swirl de platen te mixen. KLH wordt alleen toegevoegd aan 1/3 van de putjes omdat KLH wordt enkel gebruikt als eerste DC vaccin. Latere DC vaccins conTain alleen de tumor antigen peptiden.
  2. DCs kunnen worden gestimuleerd om te rijpen met verschillende stimuli. De meest voorkomende rijping stimuli die in klinische studies is een cocktail van cytokinen (IL-1 β, TNFa en IL-6) en prostaglandine E2 (PGE2) 9,10. Meer recent, hebben het gebruik van Toll-like receptor (TLR)-agonisten populariteit 11,12 gewonnen. In dit protocol, voeg 2 mg / ml Polyinosinic-Polycytidylic Acid-poly-L-lysine Carboxymethylcellulose (Poly-ICLC) aan de putjes en meng goed. Poly-ICLC is van klinische kwaliteit formulering van Poly-IC dat wordt gestabiliseerd met poly-L-*-lysine en carboxymethylcellulose (geproduceerd door Oncovir, Inc).
  3. Voeg 100 ug / ml lang peptide antigenen (NY-ESO-1 en / of Melan-A/MART-1) aan hun bestemde putjes, elk putje krijgen slechts een peptide om cross-concurrentie 13 voorkomen.
  4. Incubeer de platen bij 37 ° C in de weefselkweek incubator met 5% CO 2 O / N.

6. Dag 7: cryopreservatie van dendritische cellen

  1. Bereid DC Freezing Solution met behulp van autoloog plasma en 10% DMSO. Centrifugeer de DC Freezing Solution bij 2000 xg gedurende 20 min bij 4 ° C aan een deeltjesvormig materiaal te verwijderen. Overdragen supernatant naar een nieuwe gelabelde 15 ml conische buis. Bewaar bij 4 ° C tot gebruik.
  2. Wanneer de nacht incubatie is voltooid, oogst en het zwembad alle putjes met DC's gepulst met de peptiden in 50 ml conische buizen.
  3. Centrifugeer de buizen bij 500 x g gedurende 6 minuten. Verwijder het supernatant. Resuspendeer de celpellet in 5 ml RPMI / 1% autoloog plasma. Breng het totale volume tot met RPMI / 1% autoloog plasma 50 ml. Meng goed.
  4. Tel het aantal cellen en levensvatbaarheid van de cellen te bepalen. Bereken totaal aantal levensvatbare cellen.
  5. Centrifugeer de buizen bij 500 xg gedurende 6 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder de bovenstaande vloeistoffen en resuspendeer elke pellet in 5 ml sterile 0,9% NaCl, USP en transfer naar nieuwe 15 ml conische buizen. Breng elke celsuspensie tot 14 ml met meer steriele 0,9% NaCl, USP. Cap en meng door omkeren.
  6. Herhaal de vorige stap tweemaal. Na de laatste centrifugatie, de supernatanten te verwijderen, zo dicht mogelijk bij de celpellets zonder de pellets te verstoren.
  7. Resuspendeer de celpellets in DC Freezing Solution bij 4-20 x 10 6 cellen / ml en 1 ml aliquot elk 1,8 ml cryobuis flacon.
  8. Gebruik de gecontroleerde-tarief vriezer, Programma 1, te bevriezen onderaan de fracties van DC vaccins en breng onmiddellijk in de dampfase van een vloeibare stikstof vriezer voor opslag op lange termijn.

7. Lot release Testen

  1. Elke batch DC vaccin worden getest en voldoen aan specifieke lot-criteria (Tabel 1) en voordat het voor injectie in patiënten in de studie, typisch 5 tot 6 weken na vaccinpreparaat.
  2. Levensvatbaarheid:Evalueer levensvatbaarheid van de DC-vaccin met behulp van een geautomatiseerde cel teller. De minimaal aanvaardbare levensvatbaarheid specificatie is> 70%.
  3. Identiteit: Evalueer de identiteit van het rijpe DCs (CD11c + CD14-CD83 +) door flowcytometrie. Het percentage CD11c + cellen moet> 50%. Het percentage CD11c + en CD14 + cellen moet <30% en het percentage van CD 11 c +, CD14-en CD83 + cellen moet> 50%.
  4. Steriliteit: Test het DC vaccin voor de aanwezigheid van anaërobe en aërobe bacteriën en schimmels door directe cultuur en Gramkleuringen. Evalueer de aanwezigheid van mycoplasma met een rechtstreekse kweeksysteem en DNA fluorochroom kleuring Assay met indicator cellijn. Daarvoor moet de minimale specificatie set is dat geen groei waargenomen uit alle culturen.
  5. Endotoxine: Evalueer het endotoxine inhoud met behulp van de Kinetic-QCL kinetische chromogene LAL-assay en het moet <50 EU / ml zijn de minimumeisen voldoen.
  6. Functie: Evalueer DC functie in een gemengde lymfocyt reactie door incubatie met allogene T-cellen. De aanwezigheid van proliferatie in vergelijking met ongestimuleerde DC gerapporteerd (figuur 3).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Tussen 10 - 20% van het starten PBMCs differentiëren in dendritische eind van de kweekperiode. Mature DCs zijn CD11c +, CD14-, CD83 +, CD40 +, en CCR7 + (figuur 1). Ze drukken hoge niveaus van MHC klasse I en II moleculen en co-stimulerende moleculen CD80 en CD86. Poly-ICLC induceerde ook lagere PDL-1 in vergelijking tot andere TLR-agonisten 14. Bovendien, deze Poly-IC-gerijpte DC scheiden grote hoeveelheden IL-12 (figuur 2 en 15,16) en induceren de proliferatie va...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Fase I en II klinische proeven van monocyt-afgeleide DCs gebleken dat zij immuunresponsen induceren bij patiënten echter klinisch succes was beperkt 1. Dit kan deels te wijten aan het gebrek aan consensus over hoe de optimale DC's voor tumor immunotherapeutische gebruik genereren. Hoewel er tal van manieren van klinische kwaliteit DCs genereren deze werkwijzen verschillen wat betreft het gebruik van cytokines die de monocyten, stimuli gebruikt om rijping te induceren en werkwijzen antigen loading differen...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben financiële steun ontvangen van de volgende: NIH (AI061684, AI071078, AI044628 en K08 AI084578 (Miller)), de Bill en Melinda Gates Foundation, Doris Duke Charitable Foundation, Cancer Research Institute, Alliantie voor Lupus Research, en de Emerald stichting. Nina Bhardwaj is een coinventor op octrooien met betrekking tot de voorbereiding en het gebruik van dendritische cellen om de immuniteit te manipuleren. De auteurs hebben geen andere relevante voorkeuren of financiële betrokkenheid bij een organisatie of entiteit met een financieel belang in of financiële strijd zijn met de leerstof of materialen besproken in het manuscript, afgezien van die welke beschreven.

Dankbetuigingen

De auteurs willen graag Andres Salazar (Oncovir, Inc) danken voor de gave van de Poly-ICLC.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
RPMI-1640 medium met L-glutamineBioWhittaker12-702F
1M HEPES gebufferde zoutoplossingBioWhittaker17-737E
Fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS)BioWhittaker17-516F
Humane albumine, 25% oplossing USPAventis Behring
Ficoll-Hypaque PREMIUMGE Healthcare17-5442-03
Human AB serumValley BiomedicalHP1022
Steriele zoutoplossing USPHospira
CryoMACS DMSO Miltenyi Biotec170-076-303
Leukine GM-CSF, 0,5 mg/mlBerlexA02266
MACS GMP IL-4Miltenyi Biotec170-076-101
Hiltonol, Poly-ICLC, 2 mg/mlOncovirNA
VACMUNE KLHBiosyn
225 vierkante cm EasyFlasksNalgene Nunc159934
Falcon 6-well weefselkweekplatenBecton Dickinson353046
1,8 ml CryoTube flaconsNalgene Nunc377267
Controlled Rate FreezerThermoCryoMed

Referenties

  1. Lesterhuis, W. J., et al. Dendritic cell vaccines in melanoma: from promise to proof. Crit. Rev. Oncol. Hematol. 66, 118-134 (2008).
  2. Sabado, R. L., Bhardwaj, N. Directing dendritic cell immunotherapy towards successful cancer treatment. Immunotherapy. 2, 37-56 (2010).
  3. Schumacher, K. Keyhole limpet hemocyanin (KLH) conjugate vaccines as novel therapeutic tools in malignant disorders. J. Cancer. Res. Clin. Oncol. 127, Suppl 2. 1-2 (2001).
  4. Jaatinen, T., Laine, J. Isolation of mononuclear cells from human cord blood by Ficoll-Paque density gradient. Curr. Protoc. Stem Cell Biol. Chapter 2, Unit 2A 1(2007).
  5. Eichler, H., et al. Multicenter study on in vitro characterization of dendritic cells. Cytotherapy. 10, 21-29 (2008).
  6. Feuerstein, B., et al. A method for the production of cryopreserved aliquots of antigen-preloaded, mature dendritic cells ready for clinical use. J. Immunol. Methods. 245, 15-29 (2000).
  7. O'Neill, D., Bhardwaj, N. Generation of autologous peptide- and protein-pulsed dendritic cells for patient-specific immunotherapy. Methods Mol. Med. 109, 97-112 (2005).
  8. de Vries, I. J., et al. Phenotypical and functional characterization of clinical grade dendritic cells. J. Immunother. 25, 429-438 (2002).
  9. Jonuleit, H., et al. Pro-inflammatory cytokines and prostaglandins induce maturation of potent immunostimulatory dendritic cells under fetal calf serum-free conditions. Eur. J. Immunol. 27, 3135-3142 (1997).
  10. Lee, A. W., et al. A clinical grade cocktail of cytokines and PGE2 results in uniform maturation of human monocyte-derived dendritic cells: implications for immunotherapy. Vaccine. 20, Suppl 4. A8-A22 (2002).
  11. Bhardwaj, N. Harnessing the immune system to treat cancer. J. Clin. Invest. 117, 1130-1136 (2007).
  12. Gnjatic, S., Sawhney, N. B., Bhardwaj, N. Toll-like receptor agonists: are they good adjuvants? Cancer J. 16, 382-391 (2010).
  13. Kedl, R. M., Kappler, J. W., Marrack, P. Epitope dominance, competition and T cell affinity maturation. Curr. Opin. Immunol. 15, 120-127 (2003).
  14. Bogunovic, D., et al. TLR4 engagement during TLR3-induced proinflammatory signaling in dendritic cells promotes IL-10-mediated suppression of antitumor immunity. Cancer Research. 71, 5467-5476 (2011).
  15. Verdijk, R. M., et al. Polyriboinosinic polyribocytidylic acid (poly(I:C)) induces stable maturation of functionally active human dendritic cells. J. Immunol. 163, 57-61 (1999).
  16. Rouas, R., et al. Poly(I:C) used for human dendritic cell maturation preserves their ability to secondarily secrete bioactive IL-12. Int. Immunol. 16, 767-773 (2004).
  17. Jongmans, W., Tiemessen, D. M., van Vlodrop, I. J., Mulders, P. F., Oosterwijk, E. Th1-polarizing capacity of clinical-grade dendritic cells is triggered by Ribomunyl but is compromised by PGE2: the importance of maturation cocktails. J. Immunother. 28, 480-487 (2005).
  18. Krause, P., et al. Prostaglandin E2 is a key factor for monocyte-derived dendritic cell maturation: enhanced T cell stimulatory capacity despite IDO. J. Leukoc. Biol. 82, 1106-1114 (2007).
  19. Morelli, A. E., Thomson, A. W. Dendritic cells under the spell of prostaglandins. Trends Immunol. 24, 108-111 (2003).
  20. Adams, M., et al. Dendritic cell (DC) based therapy for cervical cancer: use of DC pulsed with tumour lysate and matured with a novel synthetic clinically non-toxic double stranded RNA analogue poly [I]:poly [C(12)U] (Ampligen R). Vaccine. 21 (12), 787-790 (2003).
  21. Colombo, M. P., Trinchieri, G. Interleukin-12 in anti-tumor immunity and immunotherapy. Cytokine Growth Factor Rev. 13, 155-168 (2002).
  22. Mayordomo, J. I., et al. Bone marrow-derived dendritic cells pulsed with synthetic tumour peptides elicit protective and therapeutic antitumour immunity. Nat Med. 1, 1297-1302 (1995).
  23. Dhodapkar, M. V., et al. Rapid generation of broad T-cell immunity in humans after a single injection of mature dendritic cells. J. Clin. Invest. 104, 173-180 (1999).
  24. Schuler-Thurner, B., et al. Rapid induction of tumor-specific type 1 T helper cells in metastatic melanoma patients by vaccination with mature, cryopreserved, peptide-loaded monocyte-derived dendritic cells. J. Exp. Med. 195, 1279-1288 (2002).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Preparatie van dendritische cellenmononucleaire cellen uit perifeer bloeddifferentiatie van monocytenPoly ICLC stimulatieladen van peptideantigenengecontroleerd vriesprocesmaturatie van dendritische cellenproductie van immunotherapeutische vaccinsverwerking van leukafereseanalyse van cytokinesectie
Voorbereiding van de Tumor antigenen opgeladen Mature dendritische cellen voor immunotherapie
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.