Methodenartikel

Zuivering van Afschriften en metabolieten van

24.6K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/50245

⸱

15 maart 2013

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Neurology, McKnight Brain Institute, University of Florida , 2Department of Entomology and Nematology, University of Florida , 3Genetics Institute, Department of Molecular Genetics and Microbiology, University of Florida , 4McKnight Brain Institute, Department of Neuroscience, Genetics Institute, Center for Translational Research on Neurodegenerative Diseases, and Center for Movement Disorders and Neurorestoration, University of Florida

In dit artikel

Samenvatting

We beschrijven hier de procedures voor de extractie en zuivering van mRNA en metabolieten uit Drosophila Hoofden. We zijn het toepassen van deze technieken om beter inzicht in de cellulaire verstoringen ten grondslag liggen aan de neuronale degeneratie. Deze methoden kunnen eenvoudig worden geschaald en aangepast voor andere "nomische" projecten.

Samenvatting

Voor de laatste tien jaar hebben we geprobeerd om de moleculaire en cellulaire mechanismen van neuronale degeneratie met behulp van Drosophila als modelorganisme te begrijpen. Hoewel fruitvliegen te bieden voor de hand liggende experimentele voordelen, heeft het onderzoek naar neurodegeneratieve ziekten vooral vertrouwd op de traditionele technieken, met inbegrip van genetische interactie, histologie, immunofluorescentie en eiwit biochemie. Deze technieken zijn effectief voor mechanistische, hypothese-gedreven studies, die leiden tot een gedetailleerd inzicht in de rol van de afzonderlijke genen in welbepaalde biologische problemen. Echter, neurodegeneratieve ziekten zijn zeer complex en beïnvloeden meervoudige cellulaire organellen en processen tijd. De komst van nieuwe technologieën en de omics leeftijd biedt een unieke kans om de mondiale cellulaire verstoringen ten grondslag ligt aan complexe ziekten te begrijpen. Flexibele modelorganismen zoals Drosophila zijn ideaal voor de aanpassing van deze nieuwe technologieën vanwege hun sterke annotatie en hoge handelbaarheid. Een probleem met deze kleine dieren is echter de zuivering van voldoende informatie moleculen (DNA, mRNA, eiwit, metabolieten) uit zeer relevante weefsels zoals hersenen fly. Andere uitdagingen zijn verzamelen grote aantallen vliegen voor experimentele duplo (belangrijk voor statistische robuustheid) en de uitwerking van samenhangende procedures voor de zuivering van hoogwaardige biologisch materiaal. Hier beschrijven we de procedures voor het verzamelen duizenden fly kop en de winning van transcripten en metabolieten te begrijpen hoe globale veranderingen in genexpressie en metabolisme bijdragen aan neurodegeneratieve ziekten. Deze procedures zijn gemakkelijk schaalbaar en kan worden toegepast op de studie van proteomische en epigenomisch bijdragen ziekte.

Inleiding

In de vorige eeuw, is Drosophila bewezen van onschatbare waarde laboratorium instrument voor het onderzoeken van diepgaande biologische vragen, met name in de ontwikkeling, celbiologie, genetica, en neurobiologie 1 zijn. De redenen voor dit succes is dat fruitvliegen zijn makkelijk te manipuleren, hebben een steeds groeiende gereedschapskist 18, 21, 31, en ​​beschikken over een relatief eenvoudige genoom met hoogwaardige annotatie 26. Deze technische voordelen, in combinatie met vindingrijkheid en voortdurende innovatie binnen de vlieg gemeenschap, hebben geleid tot een brede wetenschappelijke bijdragen, zoals wordt geïllustreerd door de toekenning van drie Nobelprijzen (1933, 1995, 2011). Meer recentelijk is gebleken Drosophila als relevant model voor het bestuderen van menselijke ziekten, vooral ontwikkelingsstoornissen, aangeboren immuniteit, kanker en neurodegeneratie 2. Wij zijn vooral geïnteresseerd in het blootleggen van de cellulaire en moleculaire basis van neurodegeneratieve ziekten. Deze complexe en diverse conditions zijn gekoppeld aan samenstellingen eventueel oplosbare oligomeren van abnormaal gevouwen eiwitten en derhalve gemakkelijk gemodelleerd in vliegen. Alle belangrijke neurodegeneratieve ziekten, zoals Alzheimer, Parkinson en Huntington's ziekte, amyotrofe laterale sclerose, verschillende ataxias, tauopathieën, prion ziekten en andere zeldzame aandoeningen, zijn gemodelleerd in vliegen in de laatste vijftien jaar 23. Fly laboratoria hebben bijgedragen aan het begrijpen van deze ziekten voornamelijk door het benutten van de dapperheid van Drosophila genetica om nieuwe genen die betrokken zijn bij de neurotoxiciteit van de pathogene eiwitten te identificeren. Zodra nieuwe genen die relevant zijn voor de neurotoxische cascade worden geïdentificeerd, worden hun effecten meestal geanalyseerd door traditionele benaderingen, met inbegrip van histologie na te gaan patronen van degeneratie, immunofluorescentie aan eiwit distributie en cellulaire pathologie vast te stellen, en biochemische analyses van de hoeveelheid en het type van abnormale eiwitten conformaties te beoordelen . Tenslotte gedragioral analyse dient als een functionele uitlezing van de ziekte uitkomsten. Deze gevestigde technieken benut om de bijdrage van een of enkele kandidaatgenen onderzocht het ziekteproces, inclusief oxidatieve stress en mitochondriale disfunctie 13 transcriptionele ontregeling 9, 27, 30, afwijkende axonale transport en synaptische activiteit 14, abnormale RNA biologie 9, ontregelde cell signaling 29 ER dyshomeostasis 6, gehinderde cellulaire proteostasis 33, en vele anderen 23. Het is echter niet duidelijk is hoe deze giftige eiwitten tegelijk kunnen interfereren met meerdere onderling verbonden paden, wat is de chronologische volgorde van deze wijzigingen, en wat is de relatieve bijdrage van elke pad naar pathogenese. Tientallen jaren van onderzoek gericht op enkel gen, zijn hypothese-gedreven benaderingen bij mensen en diermodellen leidde tot een onvolledige raadselachtige beeld van de cellulaire mechanismen die leidenneurodegeneratie. De huidige weinig inzicht in de exacte mechanismen waarmee deze samenstellingen veroorzaken toxische eiwit neuropathologie is een belangrijke beperking voor de ontwikkeling van ziekte-modificerende behandelingen.

We zijn nu geïnteresseerd in de toepassing van nieuwe benaderingen voor het begrip hoe deze pathogene eiwitten wereldwijde cellulaire verstoringen veroorzaken. De komst van de omics tijdperk maakt het mogelijk de diepe indringende van complexe biologische problemen met behulp van geavanceerde high-throughput technologieën, die kunnen resulteren in effectieve ziekte behandelingen in de nabije toekomst. Genexpressie (transcriptomics) studies werden ingesteld naar aanleiding van de voltooiing van meerdere genoomsequenties sinds hoogwaardige annotatie kunnen de meeste transcripties voorspellen. De recente toepassing van next-generation sequencing om transcript analyse (RNA-seq) heeft nieuwe voordelen en kansen in vergelijking met microarrays, met inbegrip van een onbevooroordeelde benadering, verbeterde kwantitatieve bereik en lagere kosten 32.We willen de voordelen van RNA-seq benutten om beter inzicht in de meest voorkomende vorm van dominant erfelijke ataxie, spinocerebellaire ataxie type 3 (SCA3) of Machado-Joseph ziekte. SCA3 een monogene, dominante ziekte vol penetrantie, veroorzaakt door een CAG trinucleotide expansie in de Ataxin3 gen (ATXN3) 16. Deze mutatie leidt tot de productie van Atxn3 eiwit met een lange polyglutamine (polyQ) track waarmee gevoelig te aggregeren. Het mutante Atxn3 de neurotoxische agent in SCA3 verantwoordelijk voor alle ziekte-gerelateerde storingen is dit een ideaal ziekte toepassing van deze nieuwe nomische benaderingen. Bovendien SCA3 was een van de eerste neurodegeneratieve ziekten gemodelleerd vliegen 34.

Terwijl de invoering van de procedures voor het verzamelen van grote aantallen vliegen hoofden voor RNA-seq, realiseerden we ons dat we konden hetzelfde materiaal te gebruiken voor het uitvoeren van wereldwijde studies van andere informatieve moleculen. Onder andere opkomende disciplijnen, proteomics, Epigenomics, en metabolomics toe het onderzoek van de cellulaire pathologie op een diepte die niet eerder bereikt, hoewel niet zonder uitdagingen. In tegenstelling tot mRNA, de catalogus van eiwitten en metabolieten vrij onvolledig op dit moment vanwege de toegenomen moeilijkheid in het voorspellen van alle mogelijke splicing varianten en de nog raadselachtige oorsprong van alle normale en pathogene metabolieten. Grote inspanningen zijn momenteel aan eiwitten catalogus in vele organismen en ziekten. Hiervoor wilden we focussen op de bijdrage van veranderde metabolieten te SCA3 pathogenese behulp van een eenvoudige organisme, zoals Drosophila. Dit is een relatief nieuwe en veelbelovende gebied, met name met de recente introductie van nucleaire magnetische resonantie (NMR), die hoge reproduceerbaarheid en voorziet niet vernietigen van de monsters 5, 24. Wij stellen voor dat metaboliet profilering kan bijdragen aan het identificeren van biomarkers en ziektemechanismen betrokken bij neurodegeneratiop.

Een belangrijke overweging bij deze nomische projecten is dat zij vereisen grote uniforme monsters (200 fly koppen) en zuiveringstechnieken nauwkeurige experimentele variatie te minimaliseren. We zijn begonnen met vliegen te verzamelen volgens de procedures die we eerder hadden gebruikt voor microarrays en onlangs ook gebruikt voor RNA-seq 12. Maar al snel geconfronteerd met een aantal problemen met betrekking tot misexpressing de SCA3 constructen. Eerst moesten we een Gal4 stuurprogramma te selecteren voor deze experimenten 4, waar het te onderzoeken weefsel voor analyse was de hersenen. De voor de hand liggende keuze zou een pan-neurale bestuurder zijn, aangezien SCA3 is een ziekte van de hersenen. Echter, aangezien we van plan om mRNA en metabolieten uit hele kroppen te verzamelen, zou deze optie gemengde materiaal produceren van weefsels die als niet-uiting van de constructen. Om homogene monsters waar alle cellen brengen de constructen te genereren, hebben we besloten om een zwakke, maar alomtegenwoordige coureurs, daughterless (da)-Gal4 gebruiken. Interestingly, meerdere genen betrokken bij neurodegeneratieve ziekten, waaronder ATXN3 20, een brede verdeling, waardoor de keuze van alomtegenwoordige expressie geschikt. Daarna kwamen we een tweede probleem: universele expressie van pathogene Atxn3-78Q veroorzaakt letaliteit tijdens de ontwikkeling. Om dit te omzeilen dodelijkheid, we opgenomen Gal80 ts naar de tijdelijke activering van Gal4 19 te controleren. Dit liet ons toe om de experimentele vliegen, de leeftijd te verzamelen voor maximaal 20 dagen, te bevriezen, en hun gevriesdroogd hoofd te verwerken voor een van beide RNA (TRIzol) of metaboliet (methanol-chloroform) extractie (Figuur 1). We hebben al gebruik gemaakt van deze protocol voor het verkrijgen van monsters voor transcriptoom-en metabolomics analyse, maar er zijn andere voor de hand liggende toepassingen voor deze techniek (bijvoorbeeld proteomics of neuro-peptidomic analyses).

Experimentele overzicht: De algemene doelstelling van deze protocollen is de ondersteuning van het verzamelen van Consistent monsters van vliegen hoofden voor de extractie van transcripties en metabolieten. Het specifieke doel van deze procedures is het verkrijgen vliegen expressie Atxn3-27Q en 78Q Atxn3-(niet-pathogene en pathogene experimentele constructen) en LacZ (controle construct), wanneer een enkel monster bestaat uit 200 fly koppen. Hoewel de huidige technologie maakt het mogelijk de analyse van zeer kleine monsters, met inbegrip van enkele cellen 28, we gebundeld 200 hoofden tot experimentele, biologische en technische variatie te elimineren, waardoor we de cellulaire veranderingen die gepaard gaan met de ziekte proces met een hoge statistische betrouwbaarheid te identificeren. Deze aanpak is bedoeld om alleen die veranderingen in genexpressie die consistent zijn in de bevolking, om ons in de richting van de meest kritieke paden rijden degeneratie te detecteren. Omdat we geïnteresseerd zijn in leeftijdsafhankelijke veranderingen in de hoofden van deze vliegen, werd elk genotype verkregen bij 1, 10, en 20 dagen oud.

Een fundamenteel aspect van dezeglobale analyses is de productie van biologische replica die ondersteuning een robuuste statistische analyse. Onze eerdere ervaringen met microarrays en RNA-seq suggereert dat analyse van biologische monsters in drievoud zijn sterke statistische significantie van de data 11, 12. We beschrijven in hoofdstuk 1) hoe je een enkele biologische herhaling (Rep 1) voor elk genotype en het tijdstip te genereren. Deze procedures kunnen worden herhaald om Reps 2 en 3 genereert, of parallel uitgevoerd, zolang elke Rep goed geïdentificeerd. Hoewel drie Reps is het doel, het instellen van een vierde (of zelfs vijfde) Rep is sterk aanbevolen om kwesties in verband met lage opbrengst, verlies van vliegen tijdens het ouder worden, of onbedoeld verlies van materiaal (vliegen, hoofden, of RNA) te dekken in een of meer monsters.

We vonden dat tien kruisen (flessen aangeduid door letters AJ) voldoende nakomelingen tot 200 koppen / genotype / tijdstip te verkrijgen geproduceerd. Men moet uiterst voorzichtig worden toegepast om verwarring te voorkomen, omdat een groot aantal flessen peropnieuw nodig is om een ​​Rep (10 flessen x 3 genotypen x 3 tijdstippen = 90 flessen) te verkrijgen. Hiervoor maken we aangewezen elke fles met behulp van genotype, tijdstip, en de fles brief. Bijvoorbeeld SCA3-27Q 20E betreft de vijfde fles (tien) vliegen expressie Atxn3-27Q verouderd 20 dagen. Zodra de nakomelingen Eclose zijn de vliegen gehandhaafd in afzonderlijke flesjes voorzien van de unieke identificator.

We behielden de aantallen vliegen verkregen voor elk monster, fles, en verzamelpunt ('s ochtends en' s avonds) in een Excel-spreadsheet. We herzien het aantal vliegen per flesje voor het invriezen rekening te houden letaliteit en ontsnapte. Van die laatste telt, kan flacons toevoegen van 200 vliegen gemakkelijk te vinden voor het openen van de vriezer, en aldus bijdragen tot het behoud van de monsters. Omdat vliegen verzameld uit een fles kan alleen worden gebruikt in een Rep, we gemaximeerd hun bijdrage per biologische herhaling, hoewel alle Reps die vliegen vanaf meerdere flessen. We reserveerdende vliegen van flessen niet in de geprogrammeerde Rep andere Reps als vervanging samples, of andere experimenten (western blot, qPCR).

Protocol

1. Het genereren van een repliceren en bevriezen van de Flies (LET OP, vloeibare stikstof)

Doelstellingen: Verzamel tenminste 200 vrouwen per genotype / tijdstip, en flash-vries.

  1. Genotypes: Gal80 ts, da-Gal4, stam voor alomtegenwoordige expressie van Gal4 onder controle van de regulerende gebied daughterless en temperatuurgevoelige Gal80. Als controle lijn we UAS-LacZ, die eerder is aangetoond dat het geen schadelijke effecten induceren. UAS-Atxn3-27Q en UAS-Atxn3-78Q, niet-pathogene en pathogene experimentele constructen, respectievelijk. (De Y, hs-Hid constructie is eerder gebruikt voor een efficiëntere inzameling van maagdelijke vrouwtjes, maar we besloten tegen het vanwege de extra tijd die nodig is om Y, hs-Hid voeren met Gal80 ts, da-Gal4 op chromosomen II en III.)
  2. Alles uitklappen voorraden door het combineren van 10 teefjes en 5 reutjes in fless om te voorkomen dat overbevolking. Alle experimenten werden uitgevoerd in Jazz Mix fly media, die gemakkelijk te bereiden en bevordert een snelle groei en lage Drosophila besmetting met mijten.
  3. Verzamel 50 Gal80 ts, da-Gal4 mannen en 100 UAS-Atxn3-78Q maagden (een UAS lijn wordt als voorbeeld) voor elk tijdstip.
  4. Maak tien kruisjes per genotype / tijdstip. Verdoof de mannen en vrouwen op de kooldioxide (CO 2) slaper / pad. Plaats tien maagd UAS-Atxn3-78Q vliegen (niet ouder dan vijf dagen) en vijf mannelijke Gal80 ts, da-Gal4 in elke grote fles verrijkt met gist pasta (gerehydrateerd droge gist). Label de flessen met genotypes, tijdstippen, en de fles identifiers (letters AJ), en plaats ze bij 25 ° C.
  5. Na 2 dagen, schakelt de volwassenen uit de flessen, voeg een snufje droge gist en een scheutje water om een ​​optimale larvale groei te stimuleren, en plaats de flessen bij 18 ° C (Gal80 actief,Gal4 onderdrukte). Kopieer niet de kruisen, want dit kan experimentele variabiliteit introduceren nakomelingen die zijn verkregen uit bevruchte versus maagdelijke vrouwtjes. Ook de nakomelingen van elke fles vertegenwoordigt onafhankelijke biologische replicaten (elke fles produceert unieke nakomelingen), maar overgedragen kruisen (kopieën) zou technische repliceert (extra nakomelingen met dezelfde genetische constitutie).
  6. Wanneer de nakomelingen ecloses bij 18 ° C, verdoven de CO 2 sleeper / pad, verzamelen maagden van de gewenste genotypes en ze in kleine flesjes plaatsen met (twee tot twaalf vliegen per flesje). Label injectieflacons met de fles id. Niet pool vliegt uit verschillende flessen. Plaats de flesjes bij 18 ° C gedurende 24 uur. Om nakomelingen te maximaliseren, gaan met het verzamelen op opeenvolgende ochtenden en avonden.
  7. Wanneer elke flacon 24 uur voltooid bij 18 ° C, verschuiven ze tot 29 ° C (Gal80 inactief Gal4 actief). Dit is dag 0, het startpunt van het experiment, toen thij transgenen starten hun expressie.
  8. Breng de vliegen om flesjes te reinigen om de 2 dagen tot het bereiken van dag 10 en 20.
  9. Wanneer de vliegen de gewenste leeftijd (1, 10, 20 dagen) bereiken, tellen en overbrengen van de voedselindustrie flacons in gelabelde cryovials met een kleine trechter. Niet verdoven de vliegen. Omkeren van de flesjes op de bank.
  10. Wacht 30 min om de vliegen te herstellen van de overdracht (stress), dan flash-bevriezen van de flesjes door onderdompeling in vloeibare stikstof en bewaar ze op een pre-gelabeld, pre-gekoelde vrieskist Vergeet niet:. Freeze de vliegen in dezelfde volgorde zij werden overgebracht naar de Cryovial, het maken van de tijd doorgebracht in de Cryovial uniform over monsters.

2. Verzameling en Vriesdrogen van Fly Heads (Voer in Cold kamer, Pre-chill Alle apparatuur, LET OP, vloeibare stikstof en droogijs)

Doelstelling: Snelle scheiding, inzameling, en vriesdrogen van weefsel.

  1. AssemBLE de zeef (mesh grootste in de bovenste kamer naar lichamen verzamelen, na grootste onderste compartiment naar koppen verzamelen deksel op de bodem van kleine onderdelen verzamelen) en pre-chill bij -80 ° C gedurende ten minste 30 minuten.
  2. Verzamel 200 vliegen van cryovials door het maximaliseren van de bijdrage van vliegen is ontstaan ​​uit dezelfde fles. Om te compenseren voor verschillen tussen vliegen op de ochtend of 's avonds, ervoor te zorgen dat elk monster een identieke ochtend / avond-ratio (wij gebruikten 47%' s ochtends / 's avonds 53%) maakt gebruik van. Opmerking: de resulterende RNA van twee 100-head monsters kunnen worden gecombineerd later het equivalent van 200 vliegen in een herhaalde genereren.
  3. Chill een stuk parafilm (~ 9 x 14 cm) op droog ijs gedurende 5 minuten.
  4. Leeg de cryovials met de volledige vliegen op de parafilm, een paar tegelijk, tellen vliegt met behulp van penseel, en op te slaan in een andere Cryovial op droog ijs tot aan 100 vliegen.
  5. Dompel de zeef in de vloeibare stikstof, voeg 100 vliegen naar de bovenste chamber. Schud de zeef gedurende 1 minuut. Dompel het in de vloeibare stikstof weer, en schud gedurende 1 minuut.
  6. Open de zeef halen koppen uit de onderste kamer in een microtube en plaats bij -80 ° C.
  7. Open de microbuisjes, wikkel de tops in parafilm, en maak kleine gaatjes.
  8. Plaats de monsters in de vriesdroger minimaal 2 dagen.

3. Totaal RNA-extractie en mRNA Purification (Behandel alle oppervlakken met RNaseZap; vaak veranderen Handschoenen)

Doelstelling: Meng weefsel om opbrengst te maximaliseren, uitpakken totaal RNA, en te zuiveren mRNA.

  1. Verwijder de monsters uit de vriesdroger en voeg drie kleine steriele stalen kogels elke microbuis. Plaats in de Geno / Grinder; draaien op 1.500 slagen / min gedurende 1 minuut.
  2. Open de tubes, voeg 1 ml TRIzol, en sluit de buizen met parafilm. Grind 1 min; tik op de buizen ondersteboven aan de stalen kogels los te maken indien nodig. Grind 1 min.
  3. Nietcentrifugeer de buis op dit punt (de buis wordt bros). Breng het mengsel (met uitzondering van de stalen ballen) naar een nieuw RNase-vrij microbuisjes. Pellet de cellulaire resten in een tafelblad microcentrifuge bij 4 ° C gedurende 10 min bij 12.000 x g.
  4. Breng het supernatant naar een nieuwe microbuis. Voeg 0,1 volumes 1-broom-3-chloorpropaan (BCP) schud krachtig gedurende 15 sec. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 3 min. Draaien in een microcentrifuge bij 4 ° C gedurende 15 min bij 12.000 x g Opmerking: vele RNA-extractie protocollen chloroform in dit stadium BCP dient ter RNA te maximaliseren door de efficiëntie van fasenscheiding.. Houd de monsters bij 4 ° C gedurende de centrifugatiestap ook de efficiëntie van fasescheiding en beperking van verontreiniging van eiwit en genomisch DNA in de waterfase.
  5. Breng de bovenste waterlaag naar een nieuw microbuisjes. Precipiteren RNA door toevoeging van 0,5 volumes ijskoude isopropanol, invert zes keer mix. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten. Draaien in een microcentrifuge bij 4 ° C gedurende 10 min bij 12.000 x g.

Opmerking: Naast herstellen RNA, eiwitten kunnen ook worden geëxtraheerd uit de organische laag en interfase van TRIzol, zodat zowel proteomics en transcriptomics analyses kunnen uitgevoerd op dezelfde monsters. Hoewel we hier niet uitvoeren van deze stap in onze analyses, TRIzol uitmaling uitstekende vertegenwoordiging van oplosbare eiwitten en grotere vertegenwoordiging van membraan-en nucleaire eiwitten dan de meeste buffer / detergent extracties. Lee en Lo 17 beschrijven een werkwijze om eiwitten met TRIzol geschikt voor proteomics analyses, waaronder 2-D gel en LC-MS/MS extraheren.

  1. Verwijder het supernatant. Was de RNA door toevoeging van 1 ml ijskoude 70% ethanol (met DEPC behandeld water), en meng met een korte vortex. Draaien in een microcentrifuge bij 4 ° C gedurende 5 min bij 12.000 x g.
  2. Verwijder het supernatant. Lucht drogen de pellet voor eent minste 15 minuten. Voeg 80 pl DEPC-water aan het RNA pellet en plaats het op 55 ° C gedurende 10 minuten. Reactie bij 4 ° C overnacht.
  3. Bepaal de RNA concentratie met de NanoDrop spectrofotometer. De verhouding van de absorptie bij 260 nm/280 nm moet tussen 1,8 en 2,1, met 2,1 optimaal is.
  4. Neem 30 ug RNA bulk wordt 4 U DNase I, 60 U RNasin, 10 pl 10x reactiebuffer en DEPC-behandeld water op het totale volume tot 100 pl. Incubeer bij 37 ° C gedurende 20 minuten.
  5. Zuiver het RNA met de RNeasy Mini kit. Volg de instructies van de fabrikant, met uitzondering van voer alle centrifugeren gedurende 30 sec en omvatten "facultatief" stappen.
  6. Bepaal de RNA-concentratie met behulp van de NanoDrop, en beoordeel de RNA kwaliteit met behulp van de "totale RNA pico" test op een Bioanalyzer.
  7. Voor mRNA zuivering dragen 30 pl Dynabeads een RNase-vrij microfugebuis.
  8. Plaats de buis op een magneet voor 1-2 min en verwijder supernatant. Resuspendeer de kralen in15 ul bindingsbuffer. Herhalen.
  9. Beginnend met 5 ug totaal RNA, het volume tot 15 pi met DEPC water. Warmte bij 65 ° C gedurende 2 minuten en op ijs.
  10. Voeg 15 ul van totaal RNA van de 15 pl voorgewassen kralen. Meng door pipetteren elke 5 min gedurende 30 min aan het RNA hybridiseren aan de korrels. Plaats op de magneet voor 1-2 min en verwijder alle van de bovenstaande.
  11. Voeg 35 ul van wasbuffer B. Mix van zorgvuldige pipetteren. Plaats op de magneet en verwijder het supernatant. Herhaal de wash tweemaal.
  12. Elueer het mRNA door toevoegen van 15 pi koude 10 mM Tris-HCl (pH 7,5) en verwarmen tot 80 ° C gedurende 2 minuten. Plaats de buis direct op de magneet, Breng de bovenste een RNase-vrij tube en bevriezen bij -80 ° C. Kwantificeren zoals in 3.8). Opbrengstpercentages ~ 1-5% van de totale RNA.

Voor metaboloom analyses uit te voeren protocollen 1 en 2), en ga verder met 4) hieronder:

4. Methanol-chloroform Extractie van metabolieten

Doelstelling: Aparte polaire en niet-polaire metabolieten.

  1. Voeg de antioxidant gebutyleerd hydroxytolueen (BHT) de chloroform bij een concentratie van 0,1 mg / ml tot auto-oxidatie van lipiden te voorkomen tijdens extractie. Gebruik deze BHT-chloroform voor alle volgende stappen.
  2. Transfer 200 koppen in gekoelde, vooraf gewogen conische schroefdop polypropyleenbuisjes, invriezen bij -80 ° C en lyofiliseren. Bepaal het droge gewicht.
  3. Zet 5-7 zirconia kralen in de buizen en homogeniseren in een bead beater-twee cycli van elk 20 sec bij 800 Hz.
  4. Gebaseerd op het droge gewicht van de zwaarste monster, voeg water, methanol en chloroform in de volgende verhoudingen: 11,74 x methanol; 10,59 x water, 11,74 x chloroform, waarbij x het gewicht van het zwaarste monster in gram en het product wordt de volume in ml. Voeg alle berekende methanol en 45% van de totale water bead beater de buis met het gevriesdroogde koppen.
  5. HomogeniZE in de bead beater-voor twee cycli van elk 20 sec.
  6. Combineer de hoeveelheden chloroform (100%) en de rest van het water (55%) in een conische glazen flacon op ijs. Dan overgebracht het weefsel mengsel (met kralen) om het glazen flesje. Schud 10 min. Incubeer gedurende 10 minuten op ijs.
  7. Draaien in een centrifuge bij 4 ° C gedurende 5 min bij 2.000 x g. Verwijder de polaire (bovenste) fase met een Pasteur pipet (vermijd plastic) en doe dit in een tweede microcentrifugebuis.
  8. Sla de niet-polaire (onderste) fase in een klein glazen flesje en invriezen bij -80 ° C. Drogen onder een stroom van stikstofgas, ervoor zorgen dat de buis vanaf de stikstoftank is hoogzuivere Tygon aan weekmakers in het extract te vermijden.
  9. Hydrateren de niet-polaire fase met 620 pi gedeutereerd chloroform. Breng 600 pi in gelabelde buizen NMR. Bewaren in een explosieveilige -80 ° C vriezer.
  10. Plaats polaire fase in de Centrivap en lopen tot de buis volledig droog bij 30 ° C (~ 7 uur).
  11. Rehydrate de polaire fase met 620 ui 0,1 M natriumfosfaatbuffer (pH 7,3) in deuteriumoxide met 1 mM TMSP [3 - (trimethylsilyl) propionzuur-2 ,2,3,3-d4-zuur] als interne standaard. Vortex gedurende 30 sec. Draaien in een microcentrifuge bij 4 ° C gedurende 5 min bij 10.000 rpm te precipiteren pigmenten en andere grote moleculen die interfereren met de NMR spectra. Breng 600 pi van het supernatant aan gemerkt NMR buizen.

Resultaten

De letaliteit geïnduceerd door alomtegenwoordige expressie van geëxpandeerde Atxn3 onder besturing van da-Gal4 omzeilen, introduceerden we tijdelijke regulering van Gal4 met Gal80 ts. Maar voordat u verder gaat met de inzameling en het invriezen van grote aantallen vliegen, wilden we de uitdrukking dynamiek van onze transgen te bepalen onder de controle van Gal80 ts en da-Gal4. Hiertoe we gegenereerde kruisen, links de nakomelingen bij 18 ° C, verzameld de volwassen vliegen en onderhouden ze gedurende 24 uur bij 18 ° C. Daarna we de vliegen geplaatst bij de restrictieve temperatuur (29 ° C) en geïncubeerd ze 0, 6, 12, 24, 36, 48 en 72 uur. Vervolgens ontdekten we de accumulatie van de uitgebreide polyQ allel door western blot uit een vliegen volgens gepubliceerde protocollen 10. Expressie werd eerst ontdekt, maar zwakke 6 uur na temperatuurverandering en bleef stijgen tot 48 uur, wanneer het verzadigd niveaus (Figuur 2A). Interestingly een hoog molecuulgewicht band van onoplosbare polyQ verscheen na 48 uur werd aangegeven dat de tijd die het eiwit te vormen grote aggregaten. Ook ontleed the fly hersenen op elk tijdstip de verdeling van de geëxpandeerde polyQ allel met immunofluorescentie (Figuur 2B) te bepalen. Het eiwit werd voor het eerst 24 uur na de temperatuurverandering, hoewel ongelijke verdeling. Tussen 24 en 48 uur de niveaus van eiwit bleven stijgen, waardoor verschillende hersencentra duidelijk zichtbaar, zoals de antennelid lobben en de paddestoel lichaam uitsteeksels (Figuur 2B). Tussen 48 en 72 uur de expressie van de uitgebreide polyQ allel bereikt maximale niveaus suggereert dat het systeem volledig Gal4 werd geactiveerd op dit moment. Gebaseerd op deze resultaten is gekozen voor 24 uur nadat de temperatuur shift als de eerste tijdstip (dag 1) voor verdere experimenten. De collecties van vliegen 10 en 20 dagen oud werden ook gemeten vanaf de temperatuur shift (time 0), dat het moment waarop het experiment begint met de nieuwe expressie van pathogene en controle transgenen.

Nadat we vastgesteld dat Atxn3 werd gedetecteerd na 24 uur onder de controle van Gal80 ts en da-Gal4 bij 29 ° C, we ons af of deze vliegen zou tekenen van neurodegeneratie vertonen dan 20 dagen. Aangezien deze vliegen te beginnen de uiting van de pathogene eiwitten als volwassenen, we vreesden dat ze misschien een lange incubatietijd nodig hebt om neurodegeneratieve fenotypes zien. Om de toxiciteit van Atxn3-78Q in deze omstandigheden te bepalen, hebben we verzameld vliegen uitdrukken LacZ, Atxn3-27Q, en Atxn3-78Q, en legde hun levensduur. Overwegende dat de vliegen uitdrukken LacZ en Atxn3-27Q weergegeven dan 90% levensvatbaarheid na 20 dagen, vliegt uitdrukken Atxn3-78Q toonde lage overleving op dag 20 (30%) (figuur 3). In feite Atxn3-78Q vliegen begonnen te sterven op dag 10 (7% sterfte) en dag 15 was het verlies significant (20%), die versneld in de laatste vijf degen. Zo, deze resultaten gaven aan dat volwassen expressie van een pathogeen gen resulteerde in verkorte levensduur, een belangrijke teken van de neurodegeneratieve fenotypes veroorzaakt door Atxn3-78Q.

Een van de belangrijkste aspecten van het protocol is de behandeling en het behoud van specimens na bevriezen van de kwaliteit van het geëxtraheerde materiaal te waarborgen. We geëxtraheerd tussen 15-80 ug totaal RNA per 200 koppen (afhankelijk van leeftijd en genotype) voor DNase behandeling volgens NanoDrop. Ongeveer een derde (6-25 ug) werden teruggewonnen als zeer zuiver RNA na DNase behandeling door de verhouding van de absorptie bij 260 nm/280 nm. We vonden echter dat de beste manier om de kwaliteit van RNA bepalen voor de bereiding van cDNA bibliotheken voor RNA-seq was totaal RNA analyseren op Bioanalyzer. Gelukkig werd slechts een kleine hoeveelheid RNA (5 ng) die op de Bioanalyzer, zodat het niet van invloed op de mogelijkheid om meerdere bibliotheken per monster. Als voorbeeld, we hadden twee monsters van de totaleRNA voor DNase behandeling op Bioanalyzer chip, waarvan vermoed wordt afgebroken (figuur 4A-C). De kwaliteit RNA (monster 1) die drie scherpe RNA banden, twee net onder 2000 nucleotiden (nt) in grootte en een kleinere band dan 200 nt, die de ribosomale RNA's (Figuur 4A). De twee banden ongeveer 2.000 nt overeen met de 18S rRNA (kleinere piek) en twee fragmenten van de 28S rRNA (grotere piek), een uniek aspect van rRNA biologie in Drosophila (zie figuur 4B). Deze eigenschappen werden ook waargenomen in de sporen Bioanalyzer (Figuur 4B). Daarentegen heeft een defecte RNA monster (monster 2) niet de scherpe pieken van de ribosomale RNA's en geaccumuleerde meerdere banden van minder dan 500 nt (Figuur 4A). Deze grootteverdeling is gemakkelijk te onderscheiden in de Bioanalyzer sporen (figuur 4C), waarin brede pieken kortere grootte werden opgemerkt. Ook belangrijk om te w merkenals het verschil in de eenheden van de y-as tussen de twee RNA-monsters, waaruit bleek dat het gedegradeerde RNA monster minder had. Alleen RNA weergeven maximum kwaliteit (NanoDrop verhouding van absorptie bij 260 nm/280 nm tussen 1,8 en 2,1, met 2,1 optimaal is, zie protocol stap 3.8) wordt gebruikt voor het genereren van bibliotheken.

Voor de extractie van metabolieten, volgden wij een klassieke water / methanol / chloroform (2.0:2.0:1.8) extractie procedure 3 gesplitst in twee stappen extractie van zowel polaire als niet-polaire metabolieten 35 maximaliseren. Na scheiden van de polaire en niet-polaire fase, we gereconstitueerd ze in gedeutereerd water of gedeutereerde chloroform, respectievelijk, en interne standaarden voor analyse toegevoegd door NMR. NMR-spectra verkregen met behulp van deze extractie methode werden goed opgelost met platte baselines en smalle lijnen (figuur 5), met vermelding van de zuivering van hoogwaardige extracten, geschikt voor zowel metabool profiel van eend de identificatie van grote aantallen metabolieten. Figuur 5 toont de identificatie van een paar prominente pieken die overeenkomen met zeer overvloedig metabolieten zoals glucose en sucrose, en twee belangrijke metabolische zuren, lactaat en acetaat volgens chemische verschuivingen in de literatuur 7. De chemische verschuiving (in ppm) vertegenwoordigt de elektromagnetische afscherming van een molecuul opzichte van een standaard molecule (TMS, eerste piek van rechts). Meer shieldedmolecules hogere elektronendichtheid rond de kern en verschijnt rechts van het spectrum, zoals alkyls. Deshielded moleculen zoals amide en aromatische waterstof verschijnt aan de linkerkant van het spectrum. De drukke middelste gedeelte (3-4 ppm) is verrijkt voor suiker moleculen.

figure-results-1
Figuur 1. Experimentele workflow. Ten eerste, we kruisen om vliegen van de gewenste genotypen (bovenste rij) te verzamelen. Vervolgens verschuiven we maagden tot 29 ° C om genexpressie, leeftijd ze 1, 10, en 20 dagen activeren en flash-bevriezen (tweede rij). We volgende verzamelen bevroren hoofden met behulp van een microzeef (derde rij). De koppen zijn gevriesdroogd, gemalen en behandeld voor de extractie van RNA (vierde rij) of metabolieten (onderste rij).

figure-results-2
Figuur 2. Expression kinetiek (A) Western blot met Atxn3-78Q expressie (Gal80 ts, da-Gal4 / UAS-Atxn3-78Q). Vliegen in geïncubeerd bij 29 ° C van 0 tot 72 uur. Een zwakke band wordt eerst gedetecteerd op 6 uur en verzadiging bereikt door 48 uur na inductie. (B) Immunofluorescentie van hele hersenen in dezelfde vliegen. Hersenen werden uitgesneden, gefixeerd, eend gekleurd met een antilichaam dat de geëxpandeerde polyQ eiwit herkent. Het eiwit wordt eerst gedetecteerd in de paddestoel lichaam (MB) projecties en de antennaal lobben (AL). Tussen 48 en 72 uur, de uitdrukking bereikt maximumgehalten en is goed zichtbaar in de hersenen centra met een overvloed aan innervatie. Het expressieniveau per neuron is zwak zichtbaar in de optische kwab (OL), met uitzondering van enkele grote neuronen van de OL en de centrale hersenen.

figure-results-3
Figuur 3. Atxn3-78Q vermindert levensduur Flies uiten LacZ, Atxn3-27Q, en Atxn3-78Q alomtegenwoordig in volwassen stadia (Gal80 ts; da-Gal4). Werden gecontroleerd op hun lange levensduur bij 29 ° C. Vliegen uitdrukken LacZ (blauw) en Atxn3-27Q (groen) lage sterfte bleek bij dag 20. In tegenstelling, vliegt uitdrukken Atxn3-78Q (rood) weergegeveneen uitgesproken mortaliteit vanaf dag 10. Door dag 15 toonden ze een 20% vermindering van de levensvatbaarheid, die versneld in de komende vijf dagen, het bereiken van een 70% mortaliteit op dag 20.

figure-results-4
Figuur 4. RNA kwaliteitsbeoordeling. RNA van hoge kwaliteit en afgebroken monsters werd uitgevoerd op een Bioanalyzer chip. (A) Bioanalyzer uitgevoerd met een hoge kwaliteit RNA (monster 1) en een afgebroken RNA (monster 2) naast een grootte marker (links voorsorteren). Let op de drie scherpe pieken die overeenkomen met ribosomaal RNA in de middelste baan. (B) Bioanalyzer tracering voor monster 1 met twee kenmerkende sterke pieken net onder 2000 nt en een beneden 200. (C) Bioanalyzer tracering voor monster 2, dat bestaat voornamelijk afgebroken RNA. Merk het verschil in eenheden op de y-as tussen panels B en C.

figure-results-5
Figuur 5. Vertegenwoordiger 1D NMR spectra van polaire metabolieten. Vertegenwoordiger 1D proton-NMR-spectrum van polaire metabolieten van Drosophila en complementaire 2D COSY (correlatie spectroscopie) en HSQC (heteronucleaire enkele quantum correlatie) experimenten voor piek opdracht. Metabolieten geïdentificeerd op basis van bekende chemische verschuivingen-1: Sucrose, 2: Glucose, 3: Beta-alanine; 4: Acetaat, 5: Lactaat.

Discussie

Voortbouwend op onze eerdere ervaringen in transcriptomics 11, 12, metabolisme 15, en neurodegeneratieve ziekten 6, 8, presenteren we hier een nieuw protocol voor het verzamelen van duizenden vliegen hoofden met volwassen-specifieke expressie van pathogene genen, en het zuiveren van mRNA en metabolieten voor RNA- seq en NMR spectroscopie, respectievelijk. De aard van deze experimenten vereist de opname van verschillende innovaties vóór de fly collectie, inclusief de selectie van een alomtegenwoordige Gal4 lijn en het gebruik van temporele regulering van de genexpressie. Wat Gal4, alomtegenwoordige expressie van de transgenen was cruciaal om twee redenen. Eerst een groot aantal genen betrokken bij neurodegeneratieve ziekten, waaronder ATXN3, Huntingtine, Amyloid precursor eiwit en Superoxide dismutase 1 oa komen algemeen voor in neuronale en gliale cellen als in andere celtypen buiten het zenuwstelsel. We wildencorrect modelleren dit aspect van de biologie van deze pathogene genen door het analyseren van de gevolgen van de alomtegenwoordige expressie in plaats van zich uitsluitend te richten op neurale expressie. Ten tweede, is het niet haalbaar om te vliegen hersenen te verzamelen in grote aantallen, maar we kunnen dit doen met fly koppen (meer dan 200 in drievoud per conditie) 11, 12. Sinds homogenisering van hele kroppen mengt neurale en niet-neurale weefsels, alomtegenwoordige transgenexpressie wordt van cruciaal belang voor het verkrijgen van een uniforme RNA en metabolieten van populaties van cellen die dezelfde transgenen. Het is belangrijk op te merken dat da-Gal4 werd gekozen vanwege de relatief gelijkmatige verdeling niet, vanwege de hoge expressie, hoewel een recent verslag concludeerde dat da-Gal4 niet helemaal alomtegenwoordig 25. We hadden eerder overwogen andere alomtegenwoordige Gal4 lijnen, met inbegrip van arm-, bad-, en wet-GA4, maar ze hebben allemaal complexe expressiepatronen toonde in de volwassen CZS en de spieren, waardoor ze minder eendequate voor deze studie. In feite is de immunofluorescentie in volwassen hersenen bleek dat da-Gal4 algemeen, maar zwakke expressie die alleen geaccumuleerd op hoge niveaus in hersenkernen uit enkele duizenden axonen en in enkele grote neuronen (Figuur 2) induceert. Hoewel de expressie van de constructen waren laag, deze omstandigheden drastisch verminderd overleving in een polyQ-afhankelijke manier. Deze uitdrukking dynamiek voldeed aan onze behoeften terwijl expressie niveaus laag zijn, wat belangrijk was voor het waarnemen van de langzame, progressieve cellulaire veranderingen veroorzaakt door neurotoxische eiwitten.

Een voorspelbare consequentie induceren alomtegenwoordige expressie van neurotoxische eiwitten was dat letaliteit voor volwassen verpopping veroorzaakt. Gelukkig deze complicatie was omzeild met het gebruik van Gal80 ts. Zoals hierboven besproken, genexpressie maximale bereikte ongeveer 48 uur na de temperatuurverandering, die goed past bij de tijd frame van het experiment. Een extra voordeel van het gebruik Gal80 ts was dat, in tegenstelling tot de experimenten waarbij neurotoxische eiwitten constitutief zijn pan-neuraal expressie was er geen expressie tijdens de ontwikkeling van het zenuwstelsel. Daarom wordt het gebruik van Gal80 ts ook een "schoon" achtergrond waar het zenuwstelsel niet de toxische activiteit van deze eiwitten blootgesteld neurotoxische tijdens gevoelige ontwikkelingsstadia. In onze mening activatie van genexpressie bij volwassenen geleid tot een beter model voor deze klasse van volwassen pathologieën. Echter Gal80 ts tevens een aantal complicaties geassocieerd met de temperatuur verandert. Was dat de toename vliegen bij lage temperaturen (18-20 ° C) de levenscyclus vertraagd, waardoor de experimenten significant langer. Ook is het bekend dat groeit vliegen bij hoge temperaturen (29-31 ° C) hun metabolisme, zoals blijkt uit de verkorte levensduur vergeleken met vliegen verouderd bij 25 ° C. versnelt SiNCE de transcriptionele en metabole studies zullen worden uitgevoerd in vliegen leeftijd bij hoge temperatuur, kunnen we verwachten belangrijke veranderingen in cellulaire stress wegen en energiemetabolisme te zien. Dit is waarom het zo cruciaal om twee controles in te voeren om het experiment, een met de niet-pathogene Atnx3-27Q en een niet-verbonden controle uiten LacZ. Deze controles zullen een basis voor genexpressie en metabole veranderingen die gepaard gaan met een hoge temperatuur, zodat we kunnen identificeren die veranderingen direct verband houden met de uitdrukking van giftige Atxn3. Algemeen, hebben we een aantal aanpassingen aan het verzamelen van vliegen die tal van voordelen bieden - en een paar nadelen (temperatuur kwesties en volgende paragraaf) - voor het bestuderen van ouderdomsdiabetes, progressieve ziekten.

Hoewel de tijdelijke regeling met Gal80 ts was een nuttige toevoeging is, het ingevoerd een onverwachte complicatie. Terwijl het genereren van de vliegen die zowel Gal80 ts eennd da-Gal4 constructies in een stabiele voorraad, merkten we dat vliegt dubbel homozygoot zijn voor beide constructen waren levensvatbaar is, maar steriel. Sinds homozygote Gal80 ts en da-Gal4 stammen waren levensvatbaar en vruchtbaar zelf, is het niet duidelijk waarom de combinatie lage vruchtbaarheid weergegeven. Het is al enige tijd bekend dat Gal4 is licht toxisch voor Drosophila weefsels 22. Het is mogelijk dan dat de heterologe expressie van de gist transcriptionele repressor Gal80 bijgedragen tot de toxiciteit van Gal4 door te interfereren in potentie de endogene transcriptieapparaat. Deze toxiciteit kan worden versterkt door de alomtegenwoordige verdeling van Gal4 onder controle van da, een gen dat een sleutelrol speelt in de vroege ontwikkeling en seksuele bepalen. Ongeacht de onderliggende oorzaken van de steriliteit, breidden we de Gal80 ts, da-Gal4 vliegen door het handhaven van een balancer chromosoom over da-Gal4 terwijl de homozygosity voor Gal80 t s, suggereert dat Gal4 een kritischer bijdrage aan de steriliteit. Deze oplossing was belangrijk omdat we honderden van deze mannen elke week te kruisen met elk van de UAS transgenen. Echter, kruist het dragen van een balancer gemaakt meerwerk bij de selectie van de juiste nageslacht. Slechts een vierde (25%) van het nageslacht werd verzameld (vrouwen niet balancer) die toegevoegd selectie tijd verminderde de opbrengst per fles, en verhoogde het aantal flessen nodig om ten minste 200 vliegen per genotype verkrijgen / / tijd repliceren punt. Al met al het verzamelen van vliegen werd tijdrovend vanwege de benodigde grote sets, zijn we ervan overtuigd dat het bestuderen van cellulaire veranderingen slechts een paar uur na het inschakelen van de expressie van pathogene genen alomtegenwoordig zal nieuwe en interessante processen die betrokken zijn bij progressieve neuronale verlies te identificeren.

Zodra de genetische ontwerp was op zijn plaats, we speciale aandacht besteed aan deexperimentele manipulaties die biologische variabiliteit zou kunnen introduceren. Eerst hebben we alleen verzameld virgin vrouwtjes de homogeniteit van de monsters te verzekeren, hoewel dit betekende weggooien mannetjes en controleren op nageslacht tweemaal daags. Tijdens veroudering, werden niet meer dan 12 vliegen bewaard in dezelfde flacon om overbevolking en stress te vermijden. Ook voor het invriezen, werden vliegen overgebracht naar cryovials zonder verdoving en mochten om te herstellen van de overdracht gedurende 30 minuten. Deze schijnbaar triviale factoren van invloed kunnen zijn genexpressie en het metabolisme, de invoering van de variabiliteit in de uiteindelijke analyse die niet relevant zijn voor het experiment.

Om de kwaliteit van de bevroren materialen (koppen, RNA en metabolieten) te garanderen, hebben we speciale aandacht besteed aan elk detail dat kan bijdragen aan weefsel degradatie. Omdat vliegen worden overgebracht naar cryovials in kleine aantallen (tot 12 vliegen per flacon), moesten we veel flesjes halen voor het verzamelen van 200 hoofden. Deze manipulaties werden deen uiterst zorgvuldig in een koude kamer met droogijs en vloeibare stikstof. Het verzamelen van vliegen, scheiding van koppen en zuivering van informatie moleculen te tijdrovend om te ontdekken dat het materiaal was afgebroken eind dit lange proces. Naast zorgen dat het materiaal de kwaliteit behoudt dit protocol beschrijft verschillende stappen die de opbrengst van RNA en metabolieten zoals vriesdrogen en kralen slaan maximaliseren. Deze stappen zijn niet nodig voor normale extracties voor RT-PCR of kwantitatieve PCR van gehele vliegen, maar ze zijn kritisch voor consistente zuivering van kleine monsters zoals fly koppen. We hebben vastgesteld dat andere stappen de opbrengst van RNA beïnvloeden. Bijvoorbeeld oudere vliegen aanzienlijk minder dan jongere RNA vliegen, ongeacht het genotype. Deze waarneming suggereerde dat veroudering bij hoge temperatuur dramatische veranderingen induceert. Ook, het extraheren van RNA van 100 hoofden was eigenlijk efficiënter dan van 200 hoofden, dus gingen we naar zuiveren in twee batches van 100 per monster, alleen om ze te combineren na controle van kwaliteit met de Bioanalyzer. Ook kolommen voor zuivering mRNA leek eenvoudig verzadigen, zodat de totale hoeveelheid RNA die per kolom worden geoptimaliseerd.

Metabolieten zijn een mix van kleine moleculen, dus kwaliteitscontrole moeilijker dan met DNA, RNA of eiwitten. Helaas is er geen volledige catalogus van metabolieten een dier model op dit moment, iets dat kan in de komende jaren te veranderen door de toepassing van verschillende technologische innovaties, zoals NMR spectroscopie en het uitgebreide gebruik van vloeibare chromatografie - massaspectrometrie ( LC-MS). Hoewel de NMR is minder gevoelig dan MS, toont veelbelovende voordelen, waaronder geen vernietiging van monsters geen analytische procedures bias (LC) in te voeren en hoge reproduceerbaarheid dat statistische vergelijking van Reps en verschillende experimentele omstandigheden 24 maakt. Aldus kan de steekproefopnieuw getest om vaststellingen te verifiëren of opnieuw geanalyseerd met LC-MS aan NMR-gegevens te valideren. Hier toonden we voorlopige NMR-gegevens van vliegen die we gebruiken om een catalogus van metabolieten in Drosophila samen te stellen. Deze informatie zal van cruciaal belang zijn om te bepalen hoe de expressie van pathogene genen normale stofwisseling verandert, het openen van een nieuw venster op het verder begrijpen van de cellulaire mechanismen die ten grondslag liggen aan neurodegeneratieve ziekten.

Nieuw opkomende nomische technologieën bieden de beste kans om neurodegeneratieve ziekten studeren aan een mate van detail die niet eerder bereikt. Misschien wel het grootste obstakel te overwinnen in deze high-throughput studies is de trouwe verzameling van reproduceerbare monsters dat kan worden geanalyseerd met zeer gevoelige methoden. De procedures die hier een manier om deze consistentie te bereiken, en zal leiden tot resultaten die eenvoudig kunnen worden vergeleken over datasets. Hoewel onze primair onderzoek betrokken belangen onderzoekt veranderingen van gen tot expressieion en metabolieten kunnen gegenereerde vliegen eveneens aan proteomische of epigenomisch analyse. Proteomische en epigenomisch veranderingen die zich in de loop van neurodegeneratie zijn waarschijnlijk ook van het grootste belang om de ziekte-proces. Wanneer de wetenschappelijke gemeenschap uiteindelijk het volledige spectrum van moleculaire veranderingen invloed het ziekteproces identificeert, een ware systeemniveau begrip van de ziekte mogelijk. Op dit niveau zal disease-modifying therapieën uiteindelijk naar voren als een realiteit.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen.

Dankbetuigingen

Wij zijn dankbaar voor Janice Santiago, Gabriel Figueroa, en Jose Herrera voor technische bijstand en de Bloomington Drosophila Stock Center aan de Universiteit van Indiana voor vlieg voorraden. DH en CW werden ondersteund door fondsen van NSF-IOS-1051890. PF-F en LMM werden ondersteund door een Opportunity Seed Fund van de Universiteit van Florida.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Reagens Vennootschap Cat. Aantal Reacties
Jazz mix Drosophila voedsel Fisher Scientific AS-153
Cryogene Vials Corning, Inc 430658
Microbuisjes Axygen MCT-175-CS
RNaseZap Ambion AM9786 Behandel alle oppervlakken
5/32 "maalkogels, RVS OPS Diagnostics GSS 156-5000-01
TRIzol Ambion 15596018
1-broom-3-chloorpropaan Sigma B9673-200ML
Isopropropanol Fisher Scientific A416-500
DEPC-behandeld water Fisher Scientific BP561-1
DNase I Promega M6101
RNasin ribonucleaseremmer Promega N2111
RNeasy Mini Kit Qiagen 74104
Dynabeads mRNA Purification kit Invitrogen 610-06
Conische Schroefvaatjes Fisher Scientific 02-681-344
Schroefdoppen w / O-ringen Fisher Scientific 02-681-364
2,0 mm Zirconia kralen Biospec Producten 11079124zx
Methaanol, HPLC-kwaliteit Fisher Scientific A4524
Chloroform, HPLC-kwaliteit Acros Organics AC39076
Drosophila Voorraden
da-Gal4 Bloomington Stock Center 5460
Gal80 [ts] Bloomington Stock Center 7108
UAS-MJD-27Q Bloomington Stock Center 8149
UAS-MJD-78Q Bloomington Stock Center 8150
UAS-LacZ Bloomington Stock Center 8529
Uitrusting
Injecteer + Matic Sleeper INJECT + MATIC
Microzeef Set Fisher Scientific 3410531 Gebruik twee grootste mazen
Geno / Grinder 2000 SPEX Sample Prep SP2100-115
Sorvall Legend Microcentrifuge ThermoScientific 75002436
FreeZone Plus 2,5 L Cascade Freeze Dry System Labconco 7670041
Bioanalyzer v. 2.6 Agilent 2100
DynaMag-2 Magneet Invitrogen 123-21D
NanoDrop spectrofotometer ThermoScientific
Snel Prep kraal-beater ThermoScientific FP120
Centrivap Vacufuge Plus Labconco 022820001

Referenties

  1. Bellen, H. J., Tong, C., Tsuda, H. 100 years of Drosophila research and its impact on vertebrate neuroscience: a history lesson for the future. Nat. Rev. Neurosci. 11, 514-522 (2010).
  2. Bier, E. Drosophila, the golden bug, emerges as a tool for human genetics. Nat. Rev. Genet. 6, 9-23 (2005).
  3. Bligh, E. G., Dyer, W. J. A rapid method of total lipid extraction and purification. Can. J. Biochem. Physiol. 37, 911-917 (1959).
  4. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
  5. Bundy, J. G., Papp, B., Harmston, R., Browne, R. A., Clayson, E. M., Burton, N., Reece, R. J., Oliver, S. G., Brindle, K. M. Evaluation of predicted network modules in yeast metabolism using NMR-based metabolite profiling. Genome Res. 17, 510-519 (2007).
  6. Casas-Tinto, S., Zhang, Y., Sanchez-Garcia, J., Gomez-Velazquez, M., Rincon-Limas, D. E., Fernandez-Funez, P. The ER stress factor XBP1s prevents amyloid-beta neurotoxicity. Hum. Mol. Genet. 20, 2144-2160 (2011).
  7. Fan, T. W. M. Metabolite Profiling by One and Two-Dimensional NMR Analysis of Complex Mixtures. Proress in Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy. 28, 161-219 (1996).
  8. Fernandez-Funez, P., Casas-Tinto, S., Zhang, Y., Gomez-Velazquez, M., Morales-Garza, M. A., Cepeda-Nieto, A. C., Castilla, J., Soto, C., Rincon-Limas, D. E. In vivo generation of neurotoxic prion protein: role for hsp70 in accumulation of misfolded isoforms. PLoS Genet. 5, e1000507(2009).
  9. Fernandez-Funez, P., Nino-Rosales, M. L., de Gouyon, B., She, W. C., Luchak, J. M., Martinez, P., Turiegano, E., Benito, J., Capovilla, M., Skinner, P. J., McCall, A., Canal, I., Orr, H. T., Zoghbi, H. Y., Botas, J. Identification of genes that modify ataxin-1-induced neurodegeneration. Nature. 408, 101-106 (2000).
  10. Fernandez-Funez, P., Zhang, Y., Casas-Tinto, S., Xiao, X., Zou, W. Q., Rincon-Limas, D. E. Sequence-dependent prion protein misfolding and neurotoxicity. J. Biol. Chem. 285, 36897-36908 (2010).
  11. Graze, R. M., McIntyre, L. M., Main, B. J., Wayne, M. L., Nuzhdin, S. V. Regulatory divergence in Drosophila melanogaster and D. simulans, a genomewide analysis of allele-specific expression. Genetics. 183, 547-561 (2009).
  12. Graze, R. M., Novelo, L. L., Amin, V., Fear, J. M., Casella, G., Nuzhdin, S. V., McIntyre, L. M. Allelic imbalance in Drosophila hybrid heads: exons, isoforms, and evolution. Mol. Biol. Evol. 29, 1521-1532 (2012).
  13. Greene, J. C., Whitworth, A. J., Kuo, I., Andrews, L. A., Feany, M. B., Pallanck, L. J. Mitochondrial pathology and apoptotic muscle degeneration in Drosophila parkin mutants. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 4078-4083 (2003).
  14. Gunawardena, S., Goldstein, L. S. Disruption of axonal transport and neuronal viability by amyloid precursor protein mutations in Drosophila. Neuron. 32, 389-401 (2001).
  15. Hahn, D. A., Denlinger, D. L. Energetics of insect diapause. Annu. Rev. Entomol. 56, 103-121 (2011).
  16. Kawaguchi, Y., Okamoto, T., Taniwaki, M., Aizawa, M., Inoue, M., Katayama, S., Kawakami, H., Nakamura, S., Nishimura, M., Akiguchi, I., et al. CAG expansions in a novel gene for Machado-Joseph disease at chromosome 14q32.1. Nat. Genet. 8, 221-228 (1994).
  17. Lee, F. W., Akiguchi, S. C. The use of Trizol reagent (phenol/guanidine isothiocyanate) for producing high quality two-dimensional gel electrophoretograms (2-DE) of dinoflagellates. J. Microbiol. Methods. 73, 26-32 (2008).
  18. Matthews, K. A., Kaufman, T. C., Gelbart, W. M. Research resources for Drosophila: the expanding universe. Nat. Rev. Genet. 6, 179-193 (2005).
  19. McGuire, S. E., Le, P. T., Osborn, A. J., Matsumoto, K., Davis, R. L. Spatiotemporal rescue of memory dysfunction in Drosophila. Science. 302, 1765-1768 (2003).
  20. Paulson, H. L., Das, S. S., Crino, P. B., Perez, M. K., Patel, S. C., Gotsdiner, D., Fischbeck, K. H., Pittman, R. N. Machado-Joseph disease gene product is a cytoplasmic protein widely expressed in brain. Ann. Neurol. 41, 453-462 (1997).
  21. Pfeiffer, B. D., Ngo, T. T., Hibbard, K. L., Murphy, C., Jenett, A., Truman, J. W., Rubin, G. M. Refinement of tools for targeted gene expression in Drosophila. Genetics. , 186-735 (2010).
  22. Rezaval, C., Werbajh, S., Ceriani, M. F. Neuronal death in Drosophila triggered by GAL4 accumulation. Eur. J. Neurosci. 25, 683-694 (2007).
  23. Rincon-Limas, D., Jensen, K., Fernandez Funez, A. Drosophila models of proteinopathies: the little fly that could. Curr. Pharm. Des. 18, 1108-1122 (2012).
  24. Robinette, S. L., Ajredini, R., Rasheed, H., Zeinomar, A., Schroeder, F. C., Dossey, A. T., Edison, A. S. Hierarchical Alignment and Full Resolution Pattern Recognition of 2D NMR Spectra: Application to Nematode Chemical Ecology. Anal. Chem. , (2011).
  25. Simon, A. F., Daniels, R., Romero-Calderon, R., Grygoruk, A., Chang, H. Y., Najibi, R., Shamouelian, D., Salazar, E., Solomon, M., Ackerson, L. C., Maidment, N. T., Diantonio, A., Krantz, D. E. Drosophila vesicular monoamine transporter mutants can adapt to reduced or eliminated vesicular stores of dopamine and serotonin. Genetics. 181, 525-541 (2009).
  26. Smith, C. D., Shu, S., Mungall, C. J., Karpen, G. H. The Release 5.1 annotation of Drosophila melanogaster heterochromatin. Science. 316, 1586-1591 (2007).
  27. Steffan, J. S., Bodai, L., Pallos, J., Poelman, M., McCampbell, A., Apostol, B. L., Kazantsev, A., Schmidt, E., Zhu, Y. Z., Greenwald, M., Kurokawa, R., Housman, D. E., Jackson, G. R., Marsh, J. L., Thompson, L. M. Histone deacetylase inhibitors arrest polyglutamine-dependent neurodegeneration in Drosophila. Nature. 413, 739-743 (2001).
  28. Tang, F., Barbacioru, C., Nordman, E., Li, B., Xu, N., Bashkirov, V. I., Lao, K., Surani, M. A. RNA-Seq analysis to capture the transcriptome landscape of a single cell. Nat. Protoc. 5, 516-535 (2010).
  29. Tare, M., Modi, R. M., Nainaparampil, J. J., Puli, O. R., Bedi, S., Fernandez-Funez, P., Kango-Singh, M., Singh, A. Activation of JNK signaling mediates amyloid-ss-dependent cell death. PLoS One. 6, e24361(2011).
  30. Taylor, J. P., Taye, A. A., Campbell, C., Kazemi-Esfarjani, P., Fischbeck, K. H., Min, K. T. Aberrant histone acetylation, altered transcription, and retinal degeneration in a Drosophila model of polyglutamine disease are rescued by CREB-binding protein. Genes Dev. 17, 1463-1468 (2003).
  31. Venken, K. J., Bellen, H. J. Transgenesis upgrades for Drosophila melanogaster. Development. , 134-3571 (2007).
  32. Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat. Rev. Genet. 10, 57-63 (2009).
  33. Warrick, J. M., Chan, H. Y., Gray-Board, G. L., Chai, Y., Paulson, H. L., Bonini, N. M. Suppression of polyglutamine-mediated neurodegeneration in Drosophila by the molecular chaperone HSP70. Nat. Genet. 23, 425-428 (1999).
  34. Warrick, J. M., Paulson, H. L., Gray-Board, G. L., Bui, Q. T., Fischbeck, K. H., Pittman, R. N., Bonini, N. M. Expanded polyglutamine protein forms nuclear inclusions and causes neural degeneration in Drosophila. Cell. 93, 939-949 (1998).
  35. Wu, H., Southam, A. D., Hines, A., Viant, M. R. High-throughput tissue extraction protocol for NMR- and MS-based metabolomics. Anal. Biochem. 372, 204-212 (2008).

Herprints en machtigingen

Tags

Transcriptextractiemetabolietzuiveringverzamelen van vliegenkoppenlyofilisatie van weefselRNA-isolatiechloroformextractieBioanalyzer-analyseNMR-analyseweefselvermaling
Zuivering van Afschriften en metabolieten van
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.