Cell Co-cultuur Patterning gebruiken waterige tweefasensysteem Systems

Samenvatting

Waterige tweefasensysteem systemen werden gebruikt om gelijktijdig meerdere patroon populaties van cellen. Deze snelle en gemakkelijke methode voor patroonvorming cel maakt gebruik van de fasenscheiding van waterige oplossingen van dextran en polyethyleenglycol en de grensvlakspanning die tussen de twee polymeeroplossingen.

Samenvatting

Cell patronen technologieën die snel, makkelijk te gebruiken en betaalbaar zal zijn voor de toekomstige ontwikkeling van high-throughput cel assays, platforms voor het bestuderen van cel-cel interacties en weefselmanipulatieproducten systemen. Deze gedetailleerde protocol beschrijft een werkwijze voor het co-kweken van cellen met biocompatibele oplossingen van dextran (DEX) en polyethyleenglycol (PEG) die fase-gescheiden combinatie boven de drempel concentraties. Cellen kunnen worden patroon in verschillende configuraties met deze methode. Cell uitsluiting patroon kan worden uitgevoerd door het afdrukken druppels DEX op een substraat en ze te bedekken met een oplossing van PEG bevattende cellen. De grensvlakspanning gevormd tussen de twee polymeeroplossingen veroorzaakt cellen vallen rond de buitenkant van de DEX druppel en een cirkelvormige clearing die voor migratie assays vormen. Cell eilanden kunnen patroon door het afgeven van een cellenrijke DEX fase in een PEG oplossing of door het bedekken van DEXdruppeltje met een oplossing van PEG. Co-culturen direct gevormd worden door het combineren van cel uitsluiting met DEX eiland patronen. Deze methoden zijn compatibel met verschillende liquid handling benaderingen, waaronder handmatige micropipetting, en kan worden gebruikt met vrijwel alle aanhangend celtype.

Inleiding

Waterige tweefasensysteem systemen (ATPSs) vormen wanneer oplossingen van twee incompatibele polymeren worden gemengd in voldoende hoge concentraties. Fasescheiding wordt beïnvloed door een aantal factoren dat het molecuulgewicht en de polariteit van de polymeren, de temperatuur van de oplossingen, pH en ionische inhoud van het waterige oplosmiddel ^{1, 2} omvatten. Het punt waar de twee afzonderlijke polymeeroplossingen wordt bepaald door de fysisch-chemische eigenschappen van de gekozen fase systeem, maar gebeurt meestal bij lage polymeerconcentraties (minder dan 20% wt / wt) onder niet-denaturerende omstandigheden, waardoor ATPSs worden gebruikt voor biotechnologie toepassingen ^3-9.

Verreweg de meest uitgebreid bestudeerde ATPS is het polyethyleenglycol (PEG) / dextran (DEX) systeem. De ATPS gevormd door deze goedkoop en biocompatibele polymeren werd beschreven voor de zuivering van biomoleculen door middel van moleculaire verdeling ^{2, 10.} Partitionerenontstaat wanneer aanvullende moleculen of deeltjes die niet bijdragen aan het fasensysteem gemengd met PEG en DEX. Basis van hun relatieve affiniteiten voor zowel DEX of PEG, de moleculen of deeltjes bij voorkeur bevinden in een van de twee fasen of aan het grensvlak. Andere eigenschap van het PEG / DEX ATPS het bestaan ​​van grensvlakspanning tussen de twee fasen polymeer. ATPSs gevormd door PEG en DEX algemeen weergegeven grensvlak spanningen die veel lager zijn dan andere vloeistof-vloeistof tweefasen systemen zoals olie en water, maar de grensvlakspanning krachten nog effecten uitoefenen op kleine deeltjes zoals virussen, cellen en eiwitaggregaten ^{2 , 11-13.} Tot slot, aangezien hoger molecuulgewicht PEG en DEX gescheiden in lage concentraties (minder dan 5% wt / wt voor hoogmoleculaire polymeren soorten) in aanwezigheid van fysiologische zoutconcentraties, weinig of geen nadelige effecten op zoogdiercellen opgenomen in deze systemen^14-16.

Onlangs hebben de grensvlak eigenschappen en partitioneren effecten van ATPSs toegepast door ons lab voor cel patronen ^{14, 16-20.} Dit werd bereikt door een dichter micropatterning DEX oplossing op celculturen substraten in aanwezigheid van PEG. Wanneer cellen worden opgenomen in de PEG fase, worden ze niet deelnemen aan de DEX druppeltjes door PEG / DEX grensvlakspanning ^20. Wanneer cellen worden gevormd in de DEX fase zijn zij gehouden op het oppervlak van het substraat door celkweek grensvlakspanning en verdeling ^{16, 17, 19.}

In tegenstelling tot andere methoden voor cel patronen, ATPS cel patroon is eenvoudig te leren en vraagt ​​slechts rudimentaire kennis van de polymeren zelf, en de mogelijkheid om celkweek uitvoeren en een micropipettor. Andere methoden voor cel patronen vaak sprake van gespecialiseerde apparatuur en opleiding die niet eenvoudig kunnen worden vertaald naar ee life sciences. Bijvoorbeeld, sommige methoden (microcontact afdrukken of inkjet) patroon cellen indirect door toepassing van cel lijm patronen biomoleculen aan een cultuur substraat die vervolgens dienen als plaatsen voor celhechting ^{21, 22.} Hoewel indirect benaderingen zijn bruikbaar voor sommige celtypen, ze vereisen een hoge graad van vaardigheid en user gespecialiseerde apparatuur voor de patroon gereedschap fabriceren en kunnen missen specificiteit afhankelijk van de specifieke celtype / biomolecule patroon. Als alternatief kunnen cellen worden gedeponeerd bij een hoge specificiteit patroon door middel van een directe patronen benaderingen die laminaire stroming patronen, sjabloneren en inkjet printing ^23-26 op te nemen. Deze technieken zijn echter ook gebruiker vereist deskundigheid en gespecialiseerde apparatuur en kunnen cellen beschadigen tijdens het drukproces. Hoewel deze benaderingen produceren in het algemeen nauwkeurige patronen van cellen, voor cel patronen een nuttig instrument in de life sciences zijn, moet het rendabel zijn eennd eenvoudig te implementeren.

Hier rapporteren we een gedetailleerd protocol voor het genereren van een patroon celculturen met behulp van de ATPSs beschreven in ons eerder gepubliceerde aanvragen. Met alleen micropipettors, kunnen gebruikers cel uitsluiting zones of cel eilanden voor migratie assays. Dit wordt bereikt door middel van PEG / DEX grensvlakspanning die ofwel cellen behouden in de DEX fase of uitsluit cellen gedeponeerd in de PEG fase van DEX. Door kammen deze twee fundamentele patronen technieken is het mogelijk om spoedig co-celkweken zoals lever-fibroblast cell co-culturen. Patronen methoden, ATPS parameters en verwachte resultaten worden beschreven in detail.

Protocol

1. Fase Systeem Karakterisering: Het bepalen van Drempels voor fasescheiding

1. Bereid oplossingen die PEG en DEX in de gewenste buffer of celkweekmedium zoals getoond in Figuur 1 (paarse stippen) in 15 ml of 50 ml conische buizen. Hierna zal PEG en DEX zie 35 kDa PEG en 500 kDa DEX, maar kritische concentraties verandert afhankelijk van de gebruikte twee polymeren. Noteer de massa van PEG en DEX in elke oplossing. Hoge concentratie polymeer oplossingen kan enkele uren duren om op te lossen. Vortex kan worden gebruikt voor serum-vrije oplossingen. Voor media met eiwitten of serum, plaats de buisjes op een rockende podium totdat beide polymeren worden volledig is opgelost. Noteer het gewicht van de media gebruikt om de polymeren op te lossen en kennis te nemen van de oorspronkelijke concentraties.
2. Zodra de polymeren zijn volledig opgelost, dienen de oplossingen lijkt troebel. Dit is de eerste aanwijzing dat fasescheiding is opgetreden. Om dit te bevestigen, zodat depolymeeroplossingen te rusten in een verticale positie bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten. Centrifugeren bij 1000 xg kan worden gebruikt om de fasescheiding versnellen. De dichtere onderste fase zal DEX-rijk en de bovenste fase wordt PEG-rijk.
3. Voeg langzaam aanvullende buffer of media aan de buizen. Kleine stappen moeten worden gebruikt niet wordt overschreden fasescheiding punt.
4. Wanneer de oplossing helder wordt en niet langer fase scheidt na centrifugeren werd de drempel voor fasescheiding is bereikt. Noteer de uiteindelijke gewicht van de buis.
5. Met de eerder opgenomen gewichten voor de polymeren, met het eindgewicht na toevoeging media, bepalen% wt / wt van elk van de twee polymeren waarbij fasescheiding niet meer optreedt.
6. Plotten deze waarden in% w / w PEG op de y-as en% gew / gew DEX op de x-as. Deze curve zogenaamde binodaal curve kan worden gebruikt om de drempelwaarde voor fasescheiding voor verschillende concentrati bepalenons van PEG / DEX in een specifieke celkweekmedium.

2. Configuratie 1: Uitsluiting Patterning (96-well plaat formaat)

1. Bereid afzonderlijke oplossingen van 5,0% wt / wt PEG en 12,8% w / w DEX in celkweekmedium. Gebruik ATPS oplossingen ten minste tweemaal de kritische punt te zorgen dat een ATPS overblijft na de polymeren evenwicht ten opzichte van elkaar. Er is een kleine hoeveelheid flux van DEX in de PEG-fase en vice versa derhalve werkzaam te dicht bij de kritische concentratie kan leiden tot verlies van de fase systeem concentraties vallen onder de kritische punt. Evenzo kan de overdracht van de celkweekschaal met een vochtigheid-en temperatuur-beheerste incubator weg tweefasige eigenschappen en maken de twee oplossingen mengbaar. Opmerking: Sommige cellen kunnen beter presteren met andere ATPS formuleringen. Aanvaardbare formuleringen worden geselecteerd op basis van de binodaal curves uit deel 1.
2. Oogst de cellen worden gebruikt voor uitsluiting patterning. Bepaal het aantal / concentratie van cellen beschikbaar. Optioneel: labelen van de cellen met CellTracker of andere niet-cytotoxische labels voor fluorescentiemicroscopie.
3. Pelleteren van de cellen en resuspendeer de pellet in een geschikt volume van 5,0% PEG om het gewenste aantal cellen bereiken voor uitsluiting. Bijvoorbeeld een putje van een 96-well plaat heeft 37.500 fibroblast cellen worden geresuspendeerd in 200 pi PEG tot confluentie produceren volgende dag. Schaal deze nummers zo nodig voor andere celtypes en cultuur substraat maten.
4. Met behulp van een micropipettor, afzien 0,5 pi druppeltjes van DEX op een droge celkweek substraat. Groter volume druppels produceren grotere uitsluiting zones. Druppeltjes variërend in grootte 0,1 tot 1 ul aanbevolen voor uitsluiting micropatterning. Optioneel: DEX druppeltjes worden afgezet 24 uur van tevoren en mag drogen bij kamertemperatuur. Dit kan leiden tot schonere patronen.
5. Doseer 200 pl PEG celsuspensie in thij goed op de DEX druppels te dekken.
6. In een bevochtigde incubator gedurende 12 uur bij 37 ° C, _5% CO2. Zorg ervoor dat de antenne niet gekanteld tijdens hantering en dat het op een vlakke plank incubator te voorkomen dat de patronen.
7. Verwijder de PEG oplossing en was driemaal met 200 pl kweekmedium.
8. Voeg vers kweekmedium en terug te keren naar de incubator.
9. Regelmatig te monitoren, de culturen naar cel beweging te observeren in de verboden zone.

3. Configuratie 2: Island Patterning (96-well plaat formaat)

1. Bereid oplossingen van 5,0% wt / wt PEG en 12,8% w / w DEX in celkweekmedium, zoals hierboven.
2. Oogst de cellen worden gebruikt voor eiland patroon. Bepaal het aantal / concentratie van cellen beschikbaar.
3. Pellet en resuspendeer de cellen in een geschikt volume van 12,8% DEX de gewenste concentratie van cellen voor eiland patroonvorming te bereiken. Concentraties van 5.000 ceLLS / ul of minder worden aanbevolen voor sterk klevende celtypes. Voor cellen die moeilijkheden verbonden of cellen die losjes hechten hebben concentraties tot 10.000 cellen / ul worden overwogen.
4. Snel werken om uitdroging te voorkomen, pipet 0,5 pl druppels van DEX op een droge ondergrond celkweek, zoals hierboven beschreven. Niet mogelijk druppels drogen. Optioneel: 200 pl PEG oplossing wordt toegevoegd aan de goed van tevoren. DEX druppels kunnen vervolgens worden gestort in de PEG-oplossing waar ze naar de bodem zinken en contact kweekoppervlak. Dit kan leiden tot schonere eiland patronen.
5. Bedek de DEX druppeltjes met 200 pl PEG.
6. In een bevochtigde incubator gedurende 12 uur bij 37 ° C, _5% CO2. Zorg ervoor dat de antenne niet gekanteld tijdens hantering en dat het op een vlakke plank incubator te voorkomen dat de patronen.
7. Verwijder de PEG oplossing en was driemaal met 200 pl kweekmedium.
8. Voeg verse cultuurmedium en terug te keren naar de incubator.
9. Regelmatig te monitoren, de culturen naar cel beweging en proliferatie naar buiten van de eilanden te observeren.

4. Configuratie 3: Uitsluiting Co-culturen (96-well plaat formaat)

1. Bereid oplossingen van 5,0% wt / wt PEG en 12,8% w / w DEX in celkweekmedium, zoals hierboven.
2. Oogst de cellen worden gebruikt voor uitsluiting en eiland patronen. Bepaal het aantal / concentratie van cellen voor elk celtype. Optioneel: Sommige mobiele koppelingen kunnen worden weergegeven dramatisch anders proliferatie indices. De uitgesloten cellen voorkomen overpopulating het eiland patroon cellen (vooral voor kweken op lange termijn), behandelen cellen voor uitsluiting met mitomycine C gedurende 2 uur bestralen of ze voor de oogst. Dit voorkomt proliferatie. Fluorescerende CellTracker kleurstoffen kunnen worden gebruikt om de twee celpopulaties onderscheiden indien nodig.
3. Pellet de cellen en resuspendeer de pellet voor exclusion patroonvorming in een geschikt volume van 5,0% PEG om het gewenste aantal cellen bereiken, zoals hierboven. Resuspendeer de pellet voor eiland patroonvorming in een geschikt volume van 12,8% DEX om de gewenste concentratie van cellen te bereiken, zoals hierboven.
4. Met een micropipettor, afgezien 0,5 pl druppels DEX celsuspensie op een droge ondergrond celkweek. Niet mogelijk druppels drogen.
5. Bedek de DEX druppeltjes met 200 pl PEG celsuspensie.
6. In een bevochtigde incubator gedurende 12 uur bij 37 ° C, _5% CO2. Zorg ervoor dat de antenne niet gekanteld tijdens hantering en dat het op een vlakke plank incubator te voorkomen dat de patronen.
7. Verwijder de PEG oplossing en was driemaal in 200 pl kweekmedium.
8. Voeg vers kweekmedium en terug te keren naar de incubator.
9. Bewaken van de co-culturen van de wisselwerking tussen celpopulaties te observeren. Optioneel: Controles kunnen worden bereid door het uitvoeren van uitsluiting of eiland patronen individually door co-cultuur cellen die niet reageren of blokkering wegen plaats in een of beide celpopulaties voor of na patroonvorming.

Resultaten

Het selecteren van een geschikte combinatie van PEG en DEX voor cel patroon is belangrijk om de binodaal curve. Deze curve schetst de punten waar een ATPS kan vormen en kan variëren voor een gegeven set van polymeren op basis van temperatuur, pH en ionische inhoud. Voor het kweken van cellen die aangepast medium formuleringen nodig kan het nodig om experimenteel bepalen binodaal curve. Dit wordt bereikt door het genereren van een reeks ATPSs die ver van de binodaal en variërend in de PEG en DEX inhoud (figuur 1<...

Discussie

De ATPS cel micropatterning methode vereist zeer weinig expertise buiten vaardigheid in celkweek technieken en kan snel worden beheerst. De voordelen van deze benadering zijn dat het goedkoop, snel en compatibel met verschillende celtypes en cultuur formaten. Om deze redenen moeten ons protocol gemakkelijk worden overgenomen door het leven wetenschappers, met name degenen die een studie cel proliferatie, migratie en chemotaxis, en de invloed van juxtacrine en paracriene interacties tussen celpopulaties. De assays hier g...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Reagens	Fabrikant
Dextran 500.000 kDa	Pharmacosmos, Denemarken
Polyethyleenglycol 35000 kDa	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO
Hela	ATCC, Manassas, VA
HepG2 C3A	ATCC, Manassas, VA
NIH 3T3	ATCC, Manassas, VA
Cell Tracker	Invitrogen, Carlsbad, CA
DMEM	Gibco, Carlsbad, CA
RPMI	Gibco, Carlsbad, CA
F12	Gibco, Carlsbad, CA
Fetal Bovine Serum	Gibco, Carlsbad, CA