In dit protocol wordt de fabricage, installatie en basisbediening van een microfluïdische picoliter bioreactor (PLBR) voor single-cel analyse van prokaryotische micro-organismen geïntroduceerd. Industrieel relevante micro-organismen werden geanalyseerd als bewijs van principe, waardoor inzichten in groeisnelheid, morfologie en fenotypische heterogeniteit over bepaalde tijdsperioden mogelijk werden, wat nauwelijks mogelijk is met conventionele methoden.
Methodenartikel
Microfluïdische Picoliter Bioreactor voor Microbiële Eéncellige Analyse: Fabricage, Systeemopstelling en Werking
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
In dit protocol wordt de fabricage, experimentele opstelling en basiswerking van de recent geïntroduceerde microfluïdische picoliter bioreactor (PLBR) in detail beschreven. De PLBR kan worden gebruikt voor de analyse van enkele bacteriën en microkolonies om biotechnologie- en microbiologiegerelateerde vragen te onderzoeken, bijv. celgroei, morfologie, stressrespons en metaboliet- of eiwitproductie op enkelcellig niveau. Het apparaat biedt continue mediastroom waardoor constante omgevingsomstandigheden mogelijk zijn voor verstoringsstudies, maar biedt bovendien snelle mediumveranderingen en oscillerende omstandigheden om elke gewenste omgevingssituatie na te bootsen. Voor het vervaardigen van de eenmalige apparaten diende een siliciumwafer met submicrometer grootte SU-8 structuren als replicatievorm voor snelle polydimethylsiloxaan gietvorm. Chips werden gesneden, geassembleerd, aangesloten en opgezet op een hoge resolutie en volledig geautomatiseerde microscoop geschikt voor time-lapse beeldvorming, een krachtig hulpmiddel voor ruimtelijk-temporele celanalyse. Hier werd het biotechnologieplatformorganisme Corynebacterium glutamicum gezaaid in de PLBR en celgroei en intracellulaire fluorescentie werden gevolgd gedurende meerdere uren waardoor tijdsafhankelijke populatieheterogeniteit op enkelcellig niveau werd onthuld, niet mogelijk met conventionele analysemethoden zoals flowcytometrie. Naast inzichten in de fabricage van het apparaat, wordt bovendien de voorbereiding van de precultuur, het laden, het vangen van bacteriën en de PLBR-cultivatie van enkele cellen en kolonies gedemonstreerd. Deze apparaten zullen een nieuwe dimensie toevoegen in de microbiologische onderzoek om tijdsafhankelijke fenomenen van enkele bacteriën onder strakke omgevingscontrole te analyseren. Vanwege het eenvoudige en relatief korte fabricageproces kan de technologie gemakkelijk worden aangepast in elk microfluïdisch laboratorium en eenvoudig worden aangepast aan specifieke behoeften.
Inleiding
Time-lapse microscopie is een krachtig hulpmiddel voor het bestuderen van levende cellen in vivo1. Tegelijkertijd worden commercieel verkrijgbare volledig geautomatiseerde microscopieplatforms, inclusief compensatie van thermisch geïnduceerde focusdrift, vaak toegepast in biologisch onderzoek om tijdsafhankelijke fenomenen te bestuderen, variërend van kanker- en neuroncelonderzoek tot weefselengineering en dynamische studies met enkele gist- of bacteriecellen2-6.
Typisch worden transparante welplates, agar-pads of gewoon microscoopglazen gebruikt om celcultuuromgevingen te bieden tijdens time-lapse beeldvorming7. Hoewel geschikt voor bepaald onderzoek, hebben deze eenvoudige systemen zeer beperkte controle over omgevingsomstandigheden en laten ze geen complexere verstoringen of goed gedefinieerde en snelle mediumveranderingen toe. Wegwerpbare microfluïdische chipapparaten geproduceerd door massaproductie zijn recent op de markt gebracht, maar zijn meestal afgestemd op grotere eukaryotische celtypen4. Hoewel groei kan worden gevolgd, zijn goed gedefinieerde groeonderzoeken met betrekking tot, bijv. nauwkeurige celvang, koloniegrootte, groeirichting en de mogelijkheid voor celverwijdering beperkt. Microfluïdische habitats en reactoren, waarin bacteriecellen in 3D-omgevingen worden gekweekt, zijn ontwikkeld8-10, maar hebben nadelen bij het omgaan met kwantitatieve studies op enkelcelniveau. Hoewel de algehele populatieheterogeniteit kan worden geanalyseerd, kunnen veel celparameters niet nauwkeurig worden bepaald met enkelcelresolutie, omdat groei niet beperkt is tot monolagen.
Deze beperking heeft de ontwikkeling van microsystemen geïnitieerd die het kweken van cellen in goed gedefinieerde kanalen en habitats mogelijk maken, met cellen die in vlakke monolagen met enkelcelresolutie groeien en met name strakke controle over mediumtoevoer en omgevingsomstandigheden6,11,12. Er zijn enkele voorbeelden van microfluïdische systemen voor het kweken van bacteriecellen aangetoond12-14. Bacteriën vertonen typisch zeer snelle groeisnelheden en vereisen microfluïdische structuren in de orde van enkele micrometers en daaronder, vooral wanneer celloenlagen gewenst zijn voor microscopie. Keymer et al. toonden groei en verspreiding van E. coli-stammen in microfabriceerde landschappen15,16. Omdat ze geïnteresseerd waren in populatiedynamica, onderzochten ze niet met enkelcelresolutie.
We hebben de picoliter bioreactor (PLBR)13 ontwikkeld, die momenteel wordt toegepast om verschillende biotechnologische prestatie-indicatoren zoals groei17 en fluorescentie gekoppelde productiviteitsanalyse op enkelcelniveau18,19 te onderzoeken. Het huidige microfluïdische apparaat staat omgevingsreactorcontrole toe bij een gedefinieerd kweekvolume van ongeveer één picoliter en continu enkelcelobservatie tegelijkertijd. In vergelijking met open monolaagboxsystemen11,14, waar één of twee zijden open zijn naar de mediatoevoerkanaal, staat de PLBR gecontroleerde vang en kweek toe. Het ontwerp maakt langdurige kweek van bacteriën mogelijk zonder het risico dat verschillende aangrenzende kolonies één grote populatie vormen. Verder bevat het systeem kweekgebieden van 1 µm hoogte (in de orde van de celdiameter) om bacteriegroei te beperken tot celloenlagen. In tegenstelling daarmee zijn de toevoerkanalen 10 keer dieper om hydraulische weerstand te minimaliseren.
In vergelijking met geminiaturiseerde batchkweeksystemen20 staat het huidige systeem de kweek toe met constante omgevingsparameters als gevolg van continue mediumstroom. Verder kunnen omgevingsparameters zoals mediumsamenstelling, temperatuur, stromingssnelheden en gasuitwisseling eenvoudig worden gecontroleerd en binnen seconden worden gewijzigd. Dit maakt specifiek onderzoek mogelijk naar cellulaire respons op omgevingsveranderingen met betrekking tot bijvoorbeeld nutriëntenbeschikbaarheid of stressstimuli. De vraag naar verminderde mediavolumes, namelijk in de orde van enkele microliters, stelt onderzoekers in staat om nieuwe onderzoeken uit te voeren, bijv. de verstoring van cellen tijdens time-lapse beeldvorming met supernatant van grootschalige experimenten die celrespons onder deze specifieke omgevingsomstandigheden onthullen17. De picoliter bioreactor biedt onderzoekers een robuust systeem dat biofysische omstandigheden nauwkeurig controleert en wordt bediend met behulp van hoge precisie spuitpompen en geautomatiseerde lichtveld en fluorescentiemicroscopie voor time-lapse beeldvorming. Hier rapporteren we een compleet protocol inclusief apparaatsontwerp, fabricage en voorbeeldtoepassingen.
Protocol
1. Wafer Fabrication
- Ontwerp het microfluïdische apparaat met inlaten, uitlaten, hoofdkanalen en de PLBR's (Figuur 1A) met behulp van CAD-software.
- Het ontwerp gepresenteerd in dit protocol (Figuur 2) bestaat uit twee zaai-inlaten, een gradiëntgenerator voor het mengen van twee verschillende substraten, een uitlaat en zes arrays van PLBR's. Elke array bevat 5 PLBR's, wat resulteert in 30 parallelle PLBR's in één microfluïdisch apparaat.
- Maak een litografie-fotomasker met de gewenste chip-lay-outs (Figuur 1B). De fotomasker werd in-house geproduceerd door middel van elektronenbundelschrijven met submicronresolutie. De gebruikte masker bestond uit een chroomlaag op een 5 inch2 glasplaat.
Opmerking: voer alle volgende stappen uit onder cleanroom klasse 100-condities of beter (een processtroomschema is weergegeven in Figuren 3A en 3B). - Reinig een 4 inch siliciumwafer met piranha (10:1-verhouding van zwavelzuur en waterstofperoxide) en waterstoffluoride gedurende enkele minuten (Let op: gevaarlijke chemicaliën). Spoel af met gedeïoniseerd (DI) water gedurende ongeveer 10 sec.
- Dehydreer de wafer gedurende 20 min bij 200 °C.
- Spuit 1 µm SU-8 2000.5 fotoresist op de wafer (1ste laag) (4 ml resist, draai 10 sec met v = 500 rpm en a = 100 rpm/sec, draai 30 sec met v = 1.000 rpm en a = 300 rpm/sec).
- Plaats de gecoate wafer op een hotplate bij 95 °C om overtollig oplosmiddel te verdrijven (1,5 min bij 65 °C, 1,5 min bij 95 °C en 1 min bij 65 °C; gebruik idealiter twee hotplates).
- Plaats de 1ste laag fotomasker (hier de vangstgebieden van de picoliterreactoren) en de wafer in de maskeraligner en belicht de wafer met 350-400 nm (vacuümcontact, 64 mJ/cm², t = 3 sec, I = 7 mW/cm²).
- Voer een post-expositie bak uit op een hotplate bij 95 °C om de polymerisatie van SU-8 te initiëren (1 min bij 65 °C, 1 min bij 95 °C en 1 min bij 65 °C). Opmerking: na deze stap zijn de structuren in de SU-8-laag zichtbaar.
- Plaats de wafer 1 min in een SU-8 developerbad en breng de wafer over naar een tweede container met verse SU-8 developer gedurende enkele seconden.
- Spoel de wafer in isopropanol om SU-8 developer te verwijderen en droog de wafer met behulp van stikstofstroom van de waferspinner.
- Hard bak de wafer gedurende 10 min bij 150 °C.
- Spuit 9 µm SU-8 2010 fotoresist op de wafer (2nde laag) (dispenser 4 ml resist, draai 10 sec met v = 500 rpm, a = 100 rpm/sec, en draai 30 s met v = 4.000 rpm, a = 300 rpm/sec).
- Plaats de wafer met SU-8 op een hotplate bij 95 °C om overtollig oplosmiddel te verdrijven (15 min bij 65 °C, 45-60 min bij 95 °C en 10 min bij 65 °C). Opmerking: er moet aandacht worden besteed aan rimpels en bellen. Als de wafer te snel wordt verwarmd tot 95 °C, kan verdampt oplosmiddel worden ingekapseld in kleine gasbellen.
- Plaats de fotomasker met het gewenste lay-out (hier hoofdkanalen voor voedingsstoftoevoer) en de wafer in de maskeraligner en belicht deze met 350-400 nm (hard contact, 64 mJ/cm², t = 10 sec, I = 7 mW/cm²)
- Voer een post-expositie bak uit op een hotplate bij 95 °C om de polymerisatie van SU-8 te voltooien (5 min bij 65 °C, 3:30 min bij 95 °C, 3 min bij 65 °C). Opmerking: na deze stap zijn de structuren in de SU-8-laag zichtbaar.
- Plaats de wafer gedurende 45 sec in een SU-8 developerbad, breng de wafer over naar een tweede container met verse SU-8 developer en ontwikkel gedurende 60 sec.
- Spoel de wafer 20 sec met isopropanol om eventuele SU-8 developer-resten te verwijderen en droog de wafer met behulp van geperste stikstof.
- Hard bak de wafer uiteindelijk bij 150 °C. Als resultaat wordt de uiteindelijke wafer (Figuur 1C) verkregen, die zal worden gebruikt als mastervorm voor PDMS-vorming.
- Voer profilometermetingen uit (Figuur 3C) om de SU-8 structuurhoogtes te valideren. Opmerking: onnauwkeurigheden in structuurhoogte kunnen resulteren in inefficiënte celvangst of celverlies tijdens de cultivatie.
2. Polydimethylsiloxane Chip Fabricage
Opmerking: Alle volgende stappen moeten idealiter worden uitgevoerd onder laminaire-stroomcondities om te voorkomen dat stofdeeltjes interfereren met de fabricageprocedure (een processtroomschema is weergegeven in Figuur 4).
- Bereid een mengsel van polydimethylsiloxaan (PDMS) basis en verhardingsmiddel in een 10:1-verhouding. Meng voorzichtig tot een homogene oplossing is verkregen die er ondoorzichtig uitziet. Bereid zoveel als nodig is voor de gewenste laaghoogte (hier 3 mm).
- Ontgast het PDMS-mengsel gedurende ongeveer 30 min onder lichte vacuüm totdat alle bubbels
Resultaten
Fabricage van het apparaat
Het microfluidische PLBR-systeem wordt gefabriceerd door een laag PDMS te hechten aan een dunne glazen chip die geschikt is voor microscopie met een hoge resolutie. De fabricage bestaat uit twee hoofstappen: eerst de vervaardiging van de replicatie-master (Figuren 1A, 1B, en 1C) en ten tweede de fabricage van de chip (Figuren 1D, 1E, en 1F). Volgens het protocol worden standaard fotolithografische microfabricagetechnieken gebruikt om de mastermatrijs te maken. Laboratoria zonder cleanroomfaciliteit kunnen commercieel verkrijgbare, op maat gemaakte SU-8 mastermatrijzen aanschaffen. Door middel van herhaaldelijke PDMS-gietvorming (Figuren 1A, 1B, en 1C) kunnen honderden wegwerppchips worden geproduceerd. PDMS-gieten en de assemblage van de chip kunnen in elk laboratorium worden uitgevoerd en vereisen geen cleanroomfaciliteiten, hoewel werkplekken met een laminaire luchtstroom aanbevolen worden.
Het proces begint met het ontwerp van het microfluïdische chip-systeem. Meestal wordt CAD-software gebruikt voor het ontwerpen van de microfluïdische chip (Figuur 1A). Na de CAD-fase wordt er door een e-beam writer (Figuur 1B) een masker gegenereerd met submicronresolutie. In de huidige studie is een chroommasker van 5 µm gemaakt, dat werd gebruikt voor de SU-8 wafer-lithografie. De uiteindelijke siliconen-SU-8 wafer wordt gebruikt voor PDMS-gieten (Figuur 1D). Na een uithardingsstap wordt de PDMS-plaat in chips gesneden, die onomkeerbaar op glazen objectglazen worden gebonden (Figuur 1E). Ten slotte worden de slangetjes aangesloten (Figuur 1F).
Figuur 2 toont het ontwerp van het microfluidische systeem in detail. Het bestaat uit twee inlaatpoorten voor het zaaien, een gradiëntgenerator voor het mengen van verschillende substraten of media en één uitlaatpoort. De hoofdkanalen hebben een afmeting van 50 µm x 10 µm (B x H). Elk apparaat bestaat uit zes arrays van PLBR's, die elk 5 PLBR's bevatten. Dit resulteert in 30 geparallelliseerde reactoren binnen één microfluidisch apparaat.
Figuur 3 illustreert de productie van de replicatiemaster. Zoals in detail beschreven in het protocol, wordt een eerste SU-8 laag vervaardigd via SU-8 lithografie (Figuur 3A). Een soortgelijke procedure wordt toegepast voor de tweede laag (Figuur 3B). Om de kanaalgeometrie te controleren, hebben we de hoogte van de PLBR's en de hoofdkanalen onderzocht met een profilometer. In het voorbeeld getoond in Figuur 3C is de eerste laag (de cultivatielaag) gemeten. Hier vertoont de laag een consistente hoogte van 1.200 nm, wat geschikt is voor de cultivatie van C. glutamicum in BHI-medium.
Figuur 4 illustreert de PDMS-gietprocedure, beginnend met het mengen van PDMS (Figuur 4A), gevolgd door het gietproces (Figuur 4B) en tenslotte de hechtingsstap (Figuur 4C). Figuur 4D toont de uiteindelijke microfluïdische chip met de 170 µm dikke glasplaat, de PDMS-chip (3 mm hoog) met in- en uitlaten en stalen naalden die verbonden zijn met slangetjes. Na het experiment kan de chip worden weggegooid en is er geen uitgebreide reiniging nodig. Bovendien is deze eenvoudig te assembleren en te hanteren. Er is geen complexe of moeilijke vullingsprocedure vereist.
Werkingsprincipe van het apparaat
Figuur 5 laat het werkingsprincipe van het reactorsysteem zien. Cellen worden in het microfluidische apparaat geïnfundeerd en individuele cellen blijven in de PLBR gevangen door eenvoudige celwandinteracties. Vanwege het verschil in hydrodynamische weerstand tussen het kanaal en de PLBR vindt er slechts een minimale stroming plaats binnen de PLBR. Na het zaaien van de PLBR (Figuur 5A) wordt de groeifase en observatiefase gestart door de bacterie-oplossing te vervangen door groeimedium (Figuur 5B). Zodra de PLBR's zijn overgroeid (Figuur 5C), wordt het experiment doorgaans beëindigd en kunnen de time-lapse beelden worden geanalyseerd. Voor meer details over de vangmechanismen en het stromingsprofiel binnen de PLBR wordt de lezer verwezen naar Grünberger et al.13 .
Analyse van de groeisnelheid
Het huidige systeem kan worden toegepast om verschillende bacteriële soorten te bestuderen met betrekking tot diverse biologische parameters, zoals groei, morfologie of een fluorescent signaal. In een eerste voorbeeld werd C. glutamicum, een industrieel relevant productieorganisme, gekweekt onder standaard kweekcondities (T=30 °C, CGXII-medium21). Figuur 6A toont de groeicurves afgeleid van drie isogene microkolonies. Exponentiële groei wordt gehandhaafd totdat de PLBR's gevuld zijn, wat aangeeft dat er geen nutriëntenbeperking optreedt. Figuur 6B toont vier DIC time-lapse microscopiebeelden van een groeiende C. glutamicum kolonie.
Fluorescenceanalyse
Voor fluorescentiemicroscopie op enkelcelniveau maken onderzoekers vaak gebruik van specifieke fluorescente eiwitten, zoals GFP of derivaten daarvan, om een specifiek fenotype van belang te koppelen aan een meetbare output (een fluorescentiesignaal). Om de toepasbaarheid van de PBLR voor tijdreeksstudies op basis van fluorescentie aan te tonen, hebben we de fluorescentie-emissie onderzocht van een C. glutamicum-stam die een plasmid-gecodeerd YFP-TetR fusie-eiwit produceert onder controle van de Ptac-promotor (pEKEx2-yfp-tetR)18,22. Bij lage concentraties van de inducer (IPTG) staat het bekend dat expressie vanuit Ptac leidt tot significante cel-tot-cel variatie in isogene bacteriële populaties. Uitgaande van één precultuur werden de groei en de fluorescentie van enkelcellen gevolgd voor meerdere isogene microkolonies. Zoals te zien is in Figuur 7, observeerden we fenotypische heterogeniteit tussen verschillende microkolonies en heterogeniteit op enkelcelniveau binnen kolonies die voortkwamen uit één moedercel. Eén kolonie (Figuur 7B, PLBR 1) vertoonde vrijwel geen fluorescentie-emissie, terwijl cellen van PLBR 2 een lage fluorescentie-emissie vertoonden als gevolg van basale yfp-tetR-expressie vanuit de Ptac-promotor. In PLBR 3 was de fluorescentie-emissie aanzienlijk sterk vergeleken met de andere kolonies en werd een brede distributie van de populatie waargenomen. Dit voorbeeld demonstreert de toepasbaarheid van de PBLR voor tijdreeksstudies met fluorescentiemicroscopie. In vergelijking met flowcytometrie, waarbij de fluorescentie van enkelcellen op één tijdstip kan worden bepaald, maakt het huidige systeem het mogelijk om cellen te volgen en de fluorescentie van enkelcellen in real-time over vele generaties te bestuderen.
Figuur 1. Overzicht van het PLBR-chip productieproces. Fabricage van de mastermal: beginnend met (A) Ontwerp, (B) Fabricage van het lithografiemasker en (C) Waferproductie. Productie van PDMS-glaschips: beginnend met (D) PDMS-gieten, gevolgd door (E) hechting van glas en PDMS en (F) uiteindelijke chipassemblage.
Figuur 2. Ontwerp van de PLBR-chip. (A) CAD-tekening van de volledige microfluïdische chip; (B) Vergroting van geselecteerde lay-outposities: De lay-out bevat twee medium-inletten (a1), een gradiëntgenerator met mengkanalen (a2) en 6 parallelle PLBR-arrays (b1). b2 toont één PLBR, die is ingebed in een vloeistofkanaal met een breedte van 100 µm. De PLBR heeft een binnendiameter van 40 µm en nutriëntenkanalen met een breedte van 2 µm. De seeding-inlet heeft een lengte van 40 µm. De roze kleur stelt de eerste laag voor (vangst- en cultivatiedomein) en de blauwe kleur stelt de tweede laag voor (vloeistoffransport).
Figuur 3. Illustratie van het fabricatieproces van een wafer met twee lagen. (A) Fabricage van de eerste laag die de vangkstructuren bevat; (B) Fabricage van de tweede laag die de vloeistofkanalen, in- en uitlaten bevat; (C) Representatieve oppervlakteprofielen van de eerste laag. In dit geval was de hoogte van de eerste laag 1.200 nm en wordt deze gebruikt voor de cultivatie van C. glutamicum in complex medium.
Figuur 4. Fabricage van het apparaat en representatieve chip. Illustratie van het PDMS-gietproces: (A) mengen en ontgassen van PDMS; (B) gieten van PDMS; (C) lossen uit de mal, snijden en hechten van de chip. Definitieve chip (gereproduceerd met toestemming van de Royal Society of Chemistry13): (D) foto van de PDMS-chip met 2 in- en 1 uitlaat; (E) CAD-afbeelding van zes parallelle arrays die elk 5 PLBR's bevatten; (F) SEM-afbeelding van één PLBR.
Figuur 5. Werkingsprincipe van het PLBR-systeem. (A) Inzaaifase; (B) Groeifase van de bacteriële microkolonies; (C) Overloopfase. Gereproduceerd met toestemming van de Royal Society of Chemistry13. http://dx.doi.org/10.1039/C2LC40156H.
Figuur 6. Bepaling van de groeisnelheid van C. glutamicum WT-microkolonies. (A) Groeigrafiek van drie PLBR-cultivaties en de resulterende exponentiële curves (delen gereproduceerd met toestemming van de Royal Society of Chemistry)13. http://dx.doi.org/10.1039/C2LC40156H. (B) Time-lapsebeelden van een groeiende C. glutamicum-kolonie.
Figuur 7. PBLR-gebaseerde analyse van populatieheterogeniteit. Afgebeeld is C. glutamicum dat een yfp-tetR-fusie tot expressie brengt onder controle van de Ptac-promotor (pEKEx2-yfp-tetR) in afwezigheid van de induceerder IPTG. (A) Experimentele workflow; (B) Drie isogene microkolonies die kolonie-tot-kolonie heterogeniteit en cel-tot-cel heterogeniteit vertonen; (C) Distributie van fluorescentie van individuele cellen binnen de respectievelijke microkolonies.
Figuur 8. Scanning-elektronenmicroscopie-beelden van verschillende PLBR's. SEM-beelden die de zaaipunten tonen voor de optimalisatie van de vangstefficiëntie. (A) Lagere zaaipunten (B) Kleinere zaaipunten (C) Grotere "open" zaaipunten (D) Twee zaaipunten.
| Stap | Probleem | Mogelijke oorzaak | Oplossing |
| Waferfabricage | Ingesloten luchtbellen in SU-8 tijdens het zacht bakken (soft bake) | Temperatuurstijging was te snel | Meerdere malen bakken bij 95 °C en 65 °C |
| Waferfabricage | Verdwijnende en gebroken SU-8 structuren | Niet optimale fabricageprocedure; mechanische spanning in SU-8 structuren | Optimaliseer parameters zoals baktijd en belichtingstijd |
| Waferfabricage | SU-8 lagen te laag, te hoog of ongelijkmatige laagdikte | Probleem tijdens het spincoaten | Controleer de parameters van de spincoater en de wafer-chuck |
| Chipbonding en assemblage | Instortende PLBR's | PDMS-bondingparameters niet optimaal | Pas het vermogen, de plasma-belichtingstijd en de baktijd na bonding aan |
| Chipbonding en assemblage | Vervuilde structuren en deeltjes in de PLBR's | Chip was niet correct gereinigd | Gebruik schilderstape voor oppervlaktereiniging |
| Chipbonding en assemblage | Onvoldoende PDMS-glasbonding | Bondingparameters niet optimaal of onvoldoende reiniging | Controleer de instellingen van het zuurstofplasma |
| Microfluïdisch experiment | Vloeistoflekkage | Inlaat-/uitlaatgat was niet correct geponst | Optimaliseer het proces van het ponsen van de gaten |
| Microfluïdisch experiment | Veel kleine PDMS-deeltjes tijdens het vullen | Gat was niet correct geponst | Optimaliseer het proces van het ponsen van de gaten |
| Microfluïdisch experiment, biologisch aspect | Geen celgroei | Oplosmiddelresiduen van de reinigingsprocedure | Spoel de chip grondiger door vóór het laden van de cellen of laat het oplosmiddel verdampen vóór bonding |
| Microfluïdisch experiment, biologisch aspect | Veranderende groeisnelheden | Diverse redenen | Controleer de precultuur en de temperatuur |
| Microfluïdisch experiment, biologisch aspect | Veranderingen in celmorfologie tijdens cultivatie | Voedingsbeperkingen of temperatuurverschuiving | Controleer de incubator en de flow |
| Microfluïdisch experiment, technisch aspect | Positiedrift tijdens time-lapse microscopie | Temperatuurschommelingen | Controleer het temperatuurprofiel vóór de experimenten tot er geen oscillatie meer is |
| Microfluïdisch experiment, technisch aspect | Verlies van cellen tijdens cultivatie | Reactorhoogte iets te hoog | Optimaliseer de reactorhoogte |
| Microfluïdisch experiment, technisch aspect | Geen trapping | Reactorhoogte te laag | Optimaliseer de reactorhoogte |
Tabel 1. Probleemoplossing. Deze tabel vat kritieke aspecten, veelvoorkomende fouten en mogelijke oplossingen tijdens het experimentele werk samen.
Discussie
We hebben de fabricage, experimentele opstelling en bijbehorende bedieningsprocedures beschreven van een microfluïdische PDMS-apparaat dat meerdere (PLBR's) bevat voor single-cell analyse van bacteriën.
Microfabricage met behulp van zachte litografietechnieken maakt snelle aanpassingen van apparaatopmetingen mogelijk voor verschillende maten en bacteriemorfologieën. Momenteel optimaliseren we de picoliter bioreactor met betrekking tot de cultivatie van verschillende microbiële organismen en de productieopbrengst. Om de vanggeefficiëntie te verhogen, wordt ook de reactorgeometrie geoptimaliseerd. Figuur 8 toont vier nieuwe PLBR-apparaten die momenteel worden gevalideerd. In alle figuren is het zaaikanaletje herontworpen met betrekking tot breedte en vorm. In de praktijk lijkt dit een effect te hebben op het aantal cellen dat wordt vastgehouden, maar dit moet verder worden onderzocht. Aanzienlijke verbeteringen met betrekking tot de vanggeefficiëntie werden ook bereikt door de opname van extra overloopkanalen die leiden tot hogere convectiefloei door de reactor en meer cellen die worden vastgehouden. Tegelijkertijd neemt echter het risico toe om cellen tijdens de cultivatie weg te spoelen.
Het apparaat is een interessante alternatief voor macrocultivatiemten die al decennia worden gebruikt om groei- en productieprocessen op single-cell niveau te onderzoeken. Het heeft echter enkele belangrijke vereisten: voor parallelle bewaking van meerdere picoliter bioreactoren is een hoogwaardige en volledig gemotoriseerde microscopische opstelling met focusdriftcompensatie verplicht. Bovendien is een incubatiesysteem nodig om de gewenste cultivatietemperatuur constant te houden gedurende de metingen.
We bereiken een succespercentage van 95% bij het fabriceren van het apparaat. De belangrijkste problemen hebben betrekking op inefficiënte PDMS-glasbinding, instorting van het PDMS-dak of vloeistoflek (zie Tabel 1 voor probleemoplossing van de meest voorkomende problemen). Hoewel het experimentele werk gedeeltelijk onder niet-steriele omstandigheden wordt uitgevoerd, zien we zelden besmetting tijdens experimenten, vanwege het gesloten vloeistofsysteem. PDMS-microfluïdische apparaten zijn optisch transparant en kunnen daarom worden gebruikt voor hoogwaardige in vivo beeldvorming. Hoewel PDMS perfect lijkt te zijn voor de toepassing, heeft het een hoge affiniteit voor hydrofobe moleculen, waardoor het gebruik van oplosmiddelen die veel worden gebruikt in biokatalytische processen met hele cellen beperkt is. Er zijn echter geschikte coatings beschikbaar om het protocol aan te passen aan dit soort toepassingen.
De voorgestelde PLBR is goed geschikt voor ruimte-tijdelijke analyse van cellulaire en zelfs subcellulaire gebeurtenissen van verschillende soorten bacteriën. Een belangrijk voordeel van de huidige aanpak is de mogelijkheid om microkoloniegroei direct te kwantificeren in tegenstelling tot conventionele methoden. Bovendien maakt de PLBR cultivatie mogelijk onder gedefinieerde en constante omstandigheden. Omdat het systeem het gebruik van kleine hoeveelheden reagentia of materialen mogelijk maakt, heeft het de voordelen van goedkoopheid, aanpasbaarheid en geschiktheid voor hoge doorvoer. Bij traditionele methoden worden gemiddelde waarden van de hele populatie overwogen bij het analyseren van microbiële cultivatie. Bovendien hebben bestaande methoden handmatig monsteronderzoek nodig, wat kan leiden tot degradatie van monsters en dus tot fouten in de meting. De PLBR biedt nieuwe perspectieven voor bioprocesontwikkeling en populatieheterogeniteitsanalyse in de microbiologie. De PLBR is een veelbelovend hulpmiddel voor verschillende toepassingen binnen bioprocesontwikkeling en kan worden toegepast in verschillende onderzoeksgebieden, bijv. analyse van cel-tot-cel heterogeniteit, analyse van specifieke celclusters binnen cellijnen, screening van microbiële productiestammen en real-time onderzoek van celfenotypen.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
De auteurs willen de technicus Agnes Müller-Schröer bedanken voor haar waardevolle bijdrage. Dit werk werd gedeeltelijk uitgevoerd bij Helmholtz Nanoelectronic Facility (HNF) bij Forschungszentrum Jülich GmbH. De auteurs zijn dankbaar voor de genereuze hulp en ondersteuning.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Silicon wafer 100 mm diameter, P/BOR <100> | Si-MAT, Silicon Materials, Germany | ||
| Photoresist SU-8 2000.5 | Micro Resist Technology GmbH, Germany | ||
| Photoresist SU-8 2010 | Micro Resist Technology GmbH, Germany | ||
| SU-8 Developer mr DEV- 600 | Micro Resist Technology GmbH, Germany | ||
| Polydimethylsiloxane (PDMS) Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning; Farnell GmbH, Germany | ||
| Dispensing needles Precision Tips 27 G; ID = 0.2 mm, OD = 0.42 mm | Nordson EFD Deutschland, Germany | ||
| Glass plates D263 T eco, 30 mm x 25 mm x 0.17 mm | Schott AG, Germany | ||
| Hole puncher AKA 5130-B-90 | Harris Uni-Core | ||
| Tubing Tygon S-54-HL, ID = 0.25 mm, OD = 0.76 mm | Saint Gobain; VWR International GmbH, Germany | ||
| Disposable Syringes – Omnifix Spritzen BRAUN Omnifix 40 Duo, 1 ml | B. Braun Melsungen AG, Germany | 552-183143 | |
| Syringes, 1 ml sterile glass syringes | INNOVATIVE LABOR SYSTEME GMBH (ILS), Germany | ||
| Chemicals | |||
| (NH4)2SO4 | Carl Roth GmbH + Co. KG, Germany | ||
| Urea | Carl Roth GmbH + Co. KG, Germany | ||
| KH2PO4 | Carl Roth GmbH + Co. KG, Germany | ||
| K2HPO4 | Carl Roth GmbH + Co. KG, Germany | ||
| MgSO4•7H2O | Carl Roth GmbH + Co. KG, Germany | ||
| MOPS | Carl Roth GmbH + Co. KG, Germany | ||
| FeSO4•7H2O | Carl Roth GmbH + Co. KG, Germany | ||
| MnSO4•H2O | Carl Roth GmbH + Co. KG, Germany | ||
| ZnSO4•7H2O | Carl Roth GmbH + Co. KG, Germany | ||
| CuSO4 | Carl Roth GmbH + Co. KG, Germany | ||
| NiCl2•6H2O | Carl Roth GmbH + Co. KG, Germany | ||
| CaCl2 | Carl Roth GmbH + Co. KG, Germany | ||
| Biotin | Carl Roth GmbH + Co. KG, Germany | ||
| Procatechuic acid | Carl Roth GmbH + Co. KG, Germany | ||
| Glucose-Monohydrate | Carl Roth GmbH + Co. KG, Germany | ||
| BHI | Becton, Dickinson | ||
| Cells | |||
| Corynebacterium glutamicum ATTC 13032 | DSMZ; Leibniz-Institut DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Germany | ||
| Escherichia coli MG 1655 | DSMZ; Leibniz-Institut DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Germany | ||
| Equipment | |||
| Wafer Cleaner SSEC 3300 | Solid State Equipment LLC | ||
| Spin Coater SPIN150 -NPP | SPS Europe B.V. | ||
| Mask Aligner MA-6 | Karl Suess | ||
| Hot Plate HP30A - 2 | Torrey Pines Scientific | ||
| Laboratory oven Memmert UN 200 | Memmert | ||
| Plasma Cleaner FEMTO | Diener Electronics, Germany | ||
| neMESYS syringe pumps | Cetoni GmbH, Germany | ||
| Magnetic stirrer CB 162 | Stuart | VWR 442-0304 | |
| Microscope Nikon Eclipse Ti | Nikon Microscopy | ||
| Microscope incubuator | Pecon GmbH, Germany | ||
| Centrifuge minispin plus “black line” | Eppendorf | 9776501 | |
| Photometer BioPhotometer plus | Eppendorf | 6132000008 | |
| Shake flask shaker/incubator 3031 | GFL - Gesellschaft für Labortechnik mbH, Germany | ||
| Profilometer, Dektak 150 Stylus Profiler | Veeco |
Referenties
- Muzzey, D., van Oudenaarden, A. Quantitative Time-Lapse Fluorescence Microscopy in Single Cells. Ann. Rev. Cell Dev. Biol. 25, 301-327 (2009).
- Wei, P., et al. Bacterial virulence proteins as tools to rewire kinase pathways in yeast and immune cells. Nature. 488, 384-388 (2012).
- Park, S., et al. Influence of topology on bacterial social interaction. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 13910-13915 (1073).
- Lee, P. J., Helman, N. C., Lim, W. A., Hung, P. J. A microfluidic system for dynamic yeast cell imaging. BioTechniques. 44, 91-95 (2008).
- Kobel, S. A., et al. Automated analysis of single stem cells in microfluidic traps. Lab Chip. 12, 2843-2849 (2012).
- Carlo, D. D., Wu, L. Y., Lee, L. P. Dynamic single cell culture array. Lab Chip. 6, 1445-1449 (2006).
- Locke, J. C. W., Young, J. W., Fontes, M., Jimenez, M. J. H., Elowitz, M. B. Stochastic Pulse Regulation in Bacterial Stress Response. Science. 334, 366-369 (2011).
- Boedicker, J. Q., Li, L., Kline, T. R., Ismagilov, R. F. Detecting bacteria and determining their susceptibility to antibiotics by stochastic confinement in nanoliter droplets using plug-based microfluidics. Lab Chip. 8, 1265-1272 (2008).
- Fritzsch, F. S. O., et al. Picoliter nDEP traps enable time-resolved contactless single bacterial cell analysis in controlled microenvironments. Lab Chip. 13, 397-408 (2013).
- Groisman, A., et al. A microfluidic chemostat for experiments with bacterial and yeast cells. Nat. Methods. 2, 685-689 (2005).
- Mather, W., Mondragon-Palomino, O., Danino, T., Hasty, J., Tsimring, L. S. Streaming Instability in Growing Cell Populations. Phys. Rev. Lett. 104, (2010).
- Wang, P., et al. Robust growth of Escherichia coli. Curr. Biol. 20, 1099-1103 (2010).
- Grunberger, A., et al. A disposable picolitre bioreactor for cultivation and investigation of industrially relevant bacteria on the single cell level. Lab Chip. 12, 2060-2068 (2012).
- Walden, M., Elf, J. Studying transcriptional interactions in single cells at sufficient resolution. Curr. Opin. Biotech. 22, 81-86 (2011).
- Keymer, J. E., Galajda, P., Lambert, G., Liao, D., Austin, R. H. Computation of mutual fitness by competing bacteria. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 20269-20273 (2008).
- Keymer, J. E., Galajda, P., Muldoon, C., Park, S., Austin, R. H. Bacterial metapopulations in nanofabricated landscapes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 17290-17295 (2006).
- Grunberger, A., et al. Beyond growth rate 0.6: Corynebacterium glutamicum cultivated in highly diluted environments. Biotechnol. Bioeng. 110, 220-228 (2013).
- Binder, S., et al. A high-throughput approach to identify genomic variants of bacterial metabolite producers at the single-cell level. Genome Biol. 13, (2012).
- Mustafi, N., Grunberger, A., Kohlheyer, D., Bott, M., Frunzke, J. The development and application of a single-cell biosensor for the detection of L-methionine and branched-chain amino acids. Metab. Eng. 14, 449-457 (2012).
- Huber, R., et al. Robo-Lector - a novel platform for automated high-throughput cultivations in microtiter plates with high information content. Microb. Cell Fact. 8, (2009).
- Keilhauer, C., Eggeling, L., Sahm, H. Isoleucine synthesis in Corynebacterium glutamicum: molecular analysis of the ilvB-ilvN-ilvC operon. J. Bacteriol. 175, 5595-5603 (1993).
- Frunzke, J., Bramkamp, M., Schweitzer, J. E., Bott, M. Population Heterogeneity in Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 caused by prophage CGP3. J. Bacteriol. 190, 5111-5119 (2008).
Herprints en machtigingen
