Methodenartikel

Microfluïdische Picoliter Bioreactor voor Microbiële Eéncellige Analyse: Fabricage, Systeemopstelling en Werking

DOI:

10.3791/50560

⸱

6 december 2013

 ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Bio- and Geosciences, IBG-1: Biotechnology, Forschungszentrum Juelich GmbH

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In dit protocol wordt de fabricage, installatie en basisbediening van een microfluïdische picoliter bioreactor (PLBR) voor single-cel analyse van prokaryotische micro-organismen geïntroduceerd. Industrieel relevante micro-organismen werden geanalyseerd als bewijs van principe, waardoor inzichten in groeisnelheid, morfologie en fenotypische heterogeniteit over bepaalde tijdsperioden mogelijk werden, wat nauwelijks mogelijk is met conventionele methoden.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In dit protocol wordt de fabricage, experimentele opstelling en basiswerking van de recent geïntroduceerde microfluïdische picoliter bioreactor (PLBR) in detail beschreven. De PLBR kan worden gebruikt voor de analyse van enkele bacteriën en microkolonies om biotechnologie- en microbiologiegerelateerde vragen te onderzoeken, bijv. celgroei, morfologie, stressrespons en metaboliet- of eiwitproductie op enkelcellig niveau. Het apparaat biedt continue mediastroom waardoor constante omgevingsomstandigheden mogelijk zijn voor verstoringsstudies, maar biedt bovendien snelle mediumveranderingen en oscillerende omstandigheden om elke gewenste omgevingssituatie na te bootsen. Voor het vervaardigen van de eenmalige apparaten diende een siliciumwafer met submicrometer grootte SU-8 structuren als replicatievorm voor snelle polydimethylsiloxaan gietvorm. Chips werden gesneden, geassembleerd, aangesloten en opgezet op een hoge resolutie en volledig geautomatiseerde microscoop geschikt voor time-lapse beeldvorming, een krachtig hulpmiddel voor ruimtelijk-temporele celanalyse. Hier werd het biotechnologieplatformorganisme Corynebacterium glutamicum gezaaid in de PLBR en celgroei en intracellulaire fluorescentie werden gevolgd gedurende meerdere uren waardoor tijdsafhankelijke populatieheterogeniteit op enkelcellig niveau werd onthuld, niet mogelijk met conventionele analysemethoden zoals flowcytometrie. Naast inzichten in de fabricage van het apparaat, wordt bovendien de voorbereiding van de precultuur, het laden, het vangen van bacteriën en de PLBR-cultivatie van enkele cellen en kolonies gedemonstreerd. Deze apparaten zullen een nieuwe dimensie toevoegen in de microbiologische onderzoek om tijdsafhankelijke fenomenen van enkele bacteriën onder strakke omgevingscontrole te analyseren. Vanwege het eenvoudige en relatief korte fabricageproces kan de technologie gemakkelijk worden aangepast in elk microfluïdisch laboratorium en eenvoudig worden aangepast aan specifieke behoeften.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Time-lapse microscopie is een krachtig hulpmiddel voor het bestuderen van levende cellen in vivo1. Tegelijkertijd worden commercieel verkrijgbare volledig geautomatiseerde microscopieplatforms, inclusief compensatie van thermisch geïnduceerde focusdrift, vaak toegepast in biologisch onderzoek om tijdsafhankelijke fenomenen te bestuderen, variërend van kanker- en neuroncelonderzoek tot weefselengineering en dynamische studies met enkele gist- of bacteriecellen2-6.

Typisch worden transparante welplates, agar-pads of gewoon microscoopglazen gebruikt om celcultuuromgevingen te bieden tijdens time-lapse beeldvorming7. Hoewel geschikt voor bepaald onderzoek, hebben deze eenvoudige systemen zeer beperkte controle over omgevingsomstandigheden en laten ze geen complexere verstoringen of goed gedefinieerde en snelle mediumveranderingen toe. Wegwerpbare microfluïdische chipapparaten geproduceerd door massaproductie zijn recent op de markt gebracht, maar zijn meestal afgestemd op grotere eukaryotische celtypen4. Hoewel groei kan worden gevolgd, zijn goed gedefinieerde groeonderzoeken met betrekking tot, bijv. nauwkeurige celvang, koloniegrootte, groeirichting en de mogelijkheid voor celverwijdering beperkt. Microfluïdische habitats en reactoren, waarin bacteriecellen in 3D-omgevingen worden gekweekt, zijn ontwikkeld8-10, maar hebben nadelen bij het omgaan met kwantitatieve studies op enkelcelniveau. Hoewel de algehele populatieheterogeniteit kan worden geanalyseerd, kunnen veel celparameters niet nauwkeurig worden bepaald met enkelcelresolutie, omdat groei niet beperkt is tot monolagen.

Deze beperking heeft de ontwikkeling van microsystemen geïnitieerd die het kweken van cellen in goed gedefinieerde kanalen en habitats mogelijk maken, met cellen die in vlakke monolagen met enkelcelresolutie groeien en met name strakke controle over mediumtoevoer en omgevingsomstandigheden6,11,12. Er zijn enkele voorbeelden van microfluïdische systemen voor het kweken van bacteriecellen aangetoond12-14. Bacteriën vertonen typisch zeer snelle groeisnelheden en vereisen microfluïdische structuren in de orde van enkele micrometers en daaronder, vooral wanneer celloenlagen gewenst zijn voor microscopie. Keymer et al. toonden groei en verspreiding van E. coli-stammen in microfabriceerde landschappen15,16. Omdat ze geïnteresseerd waren in populatiedynamica, onderzochten ze niet met enkelcelresolutie.

We hebben de picoliter bioreactor (PLBR)13 ontwikkeld, die momenteel wordt toegepast om verschillende biotechnologische prestatie-indicatoren zoals groei17 en fluorescentie gekoppelde productiviteitsanalyse op enkelcelniveau18,19 te onderzoeken. Het huidige microfluïdische apparaat staat omgevingsreactorcontrole toe bij een gedefinieerd kweekvolume van ongeveer één picoliter en continu enkelcelobservatie tegelijkertijd. In vergelijking met open monolaagboxsystemen11,14, waar één of twee zijden open zijn naar de mediatoevoerkanaal, staat de PLBR gecontroleerde vang en kweek toe. Het ontwerp maakt langdurige kweek van bacteriën mogelijk zonder het risico dat verschillende aangrenzende kolonies één grote populatie vormen. Verder bevat het systeem kweekgebieden van 1 µm hoogte (in de orde van de celdiameter) om bacteriegroei te beperken tot celloenlagen. In tegenstelling daarmee zijn de toevoerkanalen 10 keer dieper om hydraulische weerstand te minimaliseren.

In vergelijking met geminiaturiseerde batchkweeksystemen20  staat het huidige systeem de kweek toe met constante omgevingsparameters als gevolg van continue mediumstroom. Verder kunnen omgevingsparameters zoals mediumsamenstelling, temperatuur, stromingssnelheden en gasuitwisseling eenvoudig worden gecontroleerd en binnen seconden worden gewijzigd. Dit maakt specifiek onderzoek mogelijk naar cellulaire respons op omgevingsveranderingen met betrekking tot bijvoorbeeld nutriëntenbeschikbaarheid of stressstimuli. De vraag naar verminderde mediavolumes, namelijk in de orde van enkele microliters, stelt onderzoekers in staat om nieuwe onderzoeken uit te voeren, bijv. de verstoring van cellen tijdens time-lapse beeldvorming met supernatant van grootschalige experimenten die celrespons onder deze specifieke omgevingsomstandigheden onthullen17. De picoliter bioreactor biedt onderzoekers een robuust systeem dat biofysische omstandigheden nauwkeurig controleert en wordt bediend met behulp van hoge precisie spuitpompen en geautomatiseerde lichtveld en fluorescentiemicroscopie voor time-lapse beeldvorming. Hier rapporteren we een compleet protocol inclusief apparaatsontwerp, fabricage en voorbeeldtoepassingen.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Wafer Fabrication

  1. Ontwerp het microfluïdische apparaat met inlaten, uitlaten, hoofdkanalen en de PLBR's (Figuur 1A) met behulp van CAD-software.
  2. Het ontwerp gepresenteerd in dit protocol (Figuur 2) bestaat uit twee zaai-inlaten, een gradiëntgenerator voor het mengen van twee verschillende substraten, een uitlaat en zes arrays van PLBR's. Elke array bevat 5 PLBR's, wat resulteert in 30 parallelle PLBR's in één microfluïdisch apparaat.
  3. Maak een litografie-fotomasker met de gewenste chip-lay-outs (Figuur 1B). De fotomasker werd in-house geproduceerd door middel van elektronenbundelschrijven met submicronresolutie. De gebruikte masker bestond uit een chroomlaag op een 5 inch2 glasplaat.
    Opmerking: voer alle volgende stappen uit onder cleanroom klasse 100-condities of beter (een processtroomschema is weergegeven in Figuren 3A en 3B).
  4. Reinig een 4 inch siliciumwafer met piranha (10:1-verhouding van zwavelzuur en waterstofperoxide) en waterstoffluoride gedurende enkele minuten (Let op: gevaarlijke chemicaliën). Spoel af met gedeïoniseerd (DI) water gedurende ongeveer 10 sec.
  5. Dehydreer de wafer gedurende 20 min bij 200 °C.
  6. Spuit 1 µm SU-8 2000.5 fotoresist op de wafer (1ste laag) (4 ml resist, draai 10 sec met v = 500 rpm en a = 100 rpm/sec, draai 30 sec met v = 1.000 rpm en a = 300 rpm/sec).
  7. Plaats de gecoate wafer op een hotplate bij 95 °C om overtollig oplosmiddel te verdrijven (1,5 min bij 65 °C, 1,5 min bij 95 °C en 1 min bij 65 °C; gebruik idealiter twee hotplates).
  8. Plaats de 1ste laag fotomasker (hier de vangstgebieden van de picoliterreactoren) en de wafer in de maskeraligner en belicht de wafer met 350-400 nm (vacuümcontact, 64 mJ/cm², t = 3 sec, I = 7 mW/cm²).
  9. Voer een post-expositie bak uit op een hotplate bij 95 °C om de polymerisatie van SU-8 te initiëren (1 min bij 65 °C, 1 min bij 95 °C en 1 min bij 65 °C). Opmerking: na deze stap zijn de structuren in de SU-8-laag zichtbaar.
  10. Plaats de wafer 1 min in een SU-8 developerbad en breng de wafer over naar een tweede container met verse SU-8 developer gedurende enkele seconden.
  11. Spoel de wafer in isopropanol om SU-8 developer te verwijderen en droog de wafer met behulp van stikstofstroom van de waferspinner.
  12. Hard bak de wafer gedurende 10 min bij 150 °C.
  13. Spuit 9 µm SU-8 2010 fotoresist op de wafer (2nde laag) (dispenser 4 ml resist, draai 10 sec met v = 500 rpm, a = 100 rpm/sec, en draai 30 s met v = 4.000 rpm, a = 300 rpm/sec).
  14. Plaats de wafer met SU-8 op een hotplate bij 95 °C om overtollig oplosmiddel te verdrijven (15 min bij 65 °C, 45-60 min bij 95 °C en 10 min bij 65 °C). Opmerking: er moet aandacht worden besteed aan rimpels en bellen. Als de wafer te snel wordt verwarmd tot 95 °C, kan verdampt oplosmiddel worden ingekapseld in kleine gasbellen.
  15. Plaats de fotomasker met het gewenste lay-out (hier hoofdkanalen voor voedingsstoftoevoer) en de wafer in de maskeraligner en belicht deze met 350-400 nm (hard contact, 64 mJ/cm², t = 10 sec, I = 7 mW/cm²)
  16. Voer een post-expositie bak uit op een hotplate bij 95 °C om de polymerisatie van SU-8 te voltooien (5 min bij 65 °C, 3:30 min bij 95 °C, 3 min bij 65 °C). Opmerking: na deze stap zijn de structuren in de SU-8-laag zichtbaar.
  17. Plaats de wafer gedurende 45 sec in een SU-8 developerbad, breng de wafer over naar een tweede container met verse SU-8 developer en ontwikkel gedurende 60 sec.
  18. Spoel de wafer 20 sec met isopropanol om eventuele SU-8 developer-resten te verwijderen en droog de wafer met behulp van geperste stikstof.
  19. Hard bak de wafer uiteindelijk bij 150 °C. Als resultaat wordt de uiteindelijke wafer (Figuur 1C) verkregen, die zal worden gebruikt als mastervorm voor PDMS-vorming.
  20. Voer profilometermetingen uit (Figuur 3C) om de SU-8 structuurhoogtes te valideren. Opmerking: onnauwkeurigheden in structuurhoogte kunnen resulteren in inefficiënte celvangst of celverlies tijdens de cultivatie.

2. Polydimethylsiloxane Chip Fabricage

Opmerking: Alle volgende stappen moeten idealiter worden uitgevoerd onder laminaire-stroomcondities om te voorkomen dat stofdeeltjes interfereren met de fabricageprocedure (een processtroomschema is weergegeven in Figuur 4).

  1. Bereid een mengsel van polydimethylsiloxaan (PDMS) basis en verhardingsmiddel in een 10:1-verhouding. Meng voorzichtig tot een homogene oplossing is verkregen die er ondoorzichtig uitziet. Bereid zoveel als nodig is voor de gewenste laaghoogte (hier 3 mm).
  2. Ontgast het PDMS-mengsel gedurende ongeveer 30 min onder lichte vacuüm totdat alle bubbels

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Apparaatfabricage

Het microfluïdische PLBR-systeem wordt gemaakt door een laag PDMS op een dunne glazen chip te hechten die geschikt is voor hoogwaardige microscopie. De fabricage bestaat uit twee hoofdstappen: ten eerste de fabricage van de replicatiemaster (Figuren 1A, 1B, en 1C) en ten tweede de chipfabricage (Figuren 1D, 1E, en 1F). Volgens het protocol worden standaard fotolithografische microfabricagetechnieken gebruikt om de mastermal te maken. Laboratoria zonder schone ruimte kunnen commercieel verkrijgbare aangepaste SU-8 mastermalen aanschaffen. Met behulp van herhaalde PDMS-malvorming (Figuren 1A, 1B, en 1C) kunnen honderden wegwerpchips worden geproduceerd. PDMS-malvorming en chipassemblage kunnen in elk lab worden gedaan en vereisen geen schone ruimtefaciliteiten, maar laminaire werkplekken met luchtstroom zijn gunstig.

Het proces begint met het ontwerpen van het microfluïdische chipsysteem. Typisch wordt CAD-software gebruikt om het microfluïdische chip (Figuur 1A) te ontwerpen. Na CAD wordt een masker gegenereerd door een e-straalschrijver (Figuur 1B) met submicronresolutie. In het huidige onderzoek werd een 5-inch chromiummasker gemaakt dat werd gebruikt voor de SU-8-waferlithografie. De uiteindelijke silicium-SU-8-wafer wordt gebruikt voor PDMS-malvorming (Figuur 1D). Na een bakstap wordt de PDMS-plak in chips gesneden die onomkeerbaar worden gebonden aan de glasplaten (Figuur 1E). Ten slotte wordt de buis aangesloten (Figuur 1F).

Figuur 2 toont het ontwerp van het microfluïdische systeem in detail. Het bestaat uit twee zaadinlaatopeningen, een gradiëntgenerator voor het mengen van verschillende substraten of media en één uitlaat. De hoofdkanalen hebben een afmeting van 50 µm x 10 µm (B x H). Elk apparaat bestaat uit zes arrays van PLBR's, elk met 5 PLBR's. Dit resulteert in 30 parallelle reactoren binnen één microfluïdisch apparaat.

Figuur 3 illustreert de productie van de replicatiemaster. Zoals in detail in het protocol wordt beschreven, wordt een eerste SU-8-laag gemaakt door SU-8-lithografie (Figuur 3A). Een soortgelijke procedure wordt toegepast voor de tweede laag (Figuur 3B). Om de kanaalgeometrie te controleren, hebben we de hoogte van de PLBR's en hoofdkanalen onderzocht met behulp van een profilometer. In het voorbeeld dat wordt getoond in Figuur 3C, werd de eerste laag (de kweeklaag) gemeten. Hier vertoont de laag een consistente hoogte van 1.200 nm, geschikt voor de kweek van C. glutamicum in BHI-medium.

Figuur 4 illustreert de PDMS-malvormingsprocedure, beginnend met PDMS-menging (Figuur 4A) gevolgd door het malvormingsproces (Figuur 4B) en ten slotte de bindingsstap (Figuur 4C). Figuur 4D toont de uiteindelijke microfluïdische chip met de 170 µm dikke glazen plaat, PDMS-chip (3 mm hoog) met in- en uitlaatopeningen en stalen naalden verbonden met buisjes. Na het experiment kan de chip worden weggegooid en is er geen uitgebreide reiniging nodig. Bovendien is het gemakkelijk te monteren en te hanteren. Er is geen complexe en moeilijke vulprocedure nodig.

Apparaatprincipe

Figuur 5 toont het werkingsprincipe van het reactorsysteem. Cellen worden in het microfluïdische apparaat geïnfuseerd en individuele cellen blijven eenvoudig vastgehouden in de PLBR door celwandinteracties. Vanwege het verschil in hydrodynamische weerstand van het kanaal en de PLBR, treedt er slechts minimaal stromen op binnen de PLBR. Na het zaaien van de PLBR (Figuur 5A) wordt de groei- en observatiefase geïnitieerd met een verandering van bacteriënoplossing naar groeimedium (Figuur 5B). Nadat de PLBR's zijn overgegroeid (Figuur 5C) wordt het experiment typisch gestopt en kunnen tijd-reeksbeelden worden geanalyseerd. Voor de vasthoudmechanismen en het stroomprofiel binnen de PLBR verwijst de lezer naar Grünberger et al.13 voor meer details.

Groeisnelheidsanalyse

Het huidige systeem kan worden toegepast om verschillende bacteriesoorten te bestuderen met betrekking tot verschillende biologische parameters zoals groei, morfologie of een fluorescent signaal. In een eerste voorbeeld werd C. glutamicum, een industrieel relevant productieorganisme, onder standaard kweekomstandigheden gekweekt (T=30 °C, CGXII-medium21). Figuur 6A toont de groeicurven afgeleid van drie isogene microkolonies. Exponentiële groei wordt gehandhaafd totdat de PLBR's gevuld zijn, wat aangeeft dat er geen nutriëntbeperking optreedt. Figuur 6B toont vier DIC-tijd-reeks microscopiebeelden van een groeiende C. glutamicum kolonie.

Fluorescentieanalyse

Voor single-cell fluorescentiemicroscopie maken onderzoekers vaak gebruik van specifieke fluorescente eiwitten, bijvoorbeeld GFP of derivaten, om een specifiek fenotype van belang te koppelen aan een meetbare output (een fluorescent signaal). Om de toepasbaarheid van de PBLR voor fluorescentie-gebaseerde tijd-reeksstudies aan te tonen, hebben we de fluorescentie-emissie onderzocht van een C. glutamicum stam die een plasmide-gecodeerde YFP-TetR-fusieproteïne produceert onder controle van de Ptac-promotor (pEKEx2-yfp-tetR)18,22

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We hebben de fabricage, experimentele opstelling en bijbehorende bedieningsprocedures beschreven van een microfluïdische PDMS-apparaat dat meerdere (PLBR's) bevat voor single-cell analyse van bacteriën.

Microfabricage met behulp van zachte litografietechnieken maakt snelle aanpassingen van apparaatopmetingen mogelijk voor verschillende maten en bacteriemorfologieën. Momenteel optimaliseren we de picoliter bioreactor met betrekking tot de cultivatie van verschillende microbiële organismen en de productieopbrengst. Om de vanggeefficiëntie te verhogen, wordt ook de reactorgeometrie geoptimaliseerd. Figuur 8 toont vier nieuwe PLBR-apparaten die momenteel worden gevalideerd. In alle figuren is het zaaikanaletje herontworpen met betrekking tot breedte en vorm. In de praktijk lijkt dit een effect te hebben op het aantal cellen dat wordt vastgehouden, maar dit moet verder worden onderzocht. Aanzienlijke verbeteringen met betrekking tot de vanggeefficiëntie werden ook bereikt door de opname van extra overloopkanalen die leiden tot hogere convectiefloei door de reactor en meer cellen die worden vastgehouden. Tegelijkertijd neemt echter het risico toe om cellen tijdens de cultivatie weg te spoelen.

Het apparaat is een interessante alternatief voor macrocultivatiemten die al decennia worden gebruikt om groei- en productieprocessen op single-cell niveau te onderzoeken. Het heeft echter enkele belangrijke vereisten: voor parallelle bewaking van meerdere picoliter bioreactoren is een hoogwaardige en volledig gemotoriseerde microscopische opstelling met focusdriftcompensatie verplicht. Bovendien is een incubatiesysteem nodig om de gewenste cultivatietemperatuur constant te houden gedurende de metingen.

We bereiken een succespercentage van 95% bij het fabriceren van het apparaat. De belangrijkste problemen hebben betrekking op inefficiënte PDMS-glasbinding, instorting van het PDMS-dak of vloeistoflek (zie Tabel 1 voor probleemoplossing van de meest voorkomende problemen). Hoewel het experimentele werk gedeeltelijk onder niet-steriele omstandigheden wordt uitgevoerd, zien we zelden besmetting tijdens experimenten, vanwege het gesloten vloeistofsysteem. PDMS-microfluïdische apparaten zijn optisch transparant en kunnen daarom worden gebruikt voor hoogwaardige in vivo beeldvorming. Hoewel PDMS perfect lijkt te zijn voor de toepassing, heeft het een hoge affiniteit voor hydrofobe moleculen, waardoor het gebruik van oplosmiddelen die veel worden gebruikt in biokatalytische processen met hele cellen beperkt is. Er zijn echter geschikte coatings beschikbaar om het protocol aan te passen aan dit soort toepassingen.

De voorgestelde PLBR is goed geschikt voor ruimte-tijdelijke analyse van cellulaire en zelfs subcellulaire gebeurtenissen van verschillende soorten bacteriën. Een belangrijk voordeel van de huidige aanpak is de mogelijkheid om microkoloniegroei direct te kwantificeren in tegenstelling tot conventionele methoden. Bovendien maakt de PLBR cultivatie mogelijk onder gedefinieerde en constante omstandigheden. Omdat het systeem het gebruik van kleine hoeveelheden reagentia of materialen mogelijk maakt, heeft het de voordelen van goedkoopheid, aanpasbaarheid en geschiktheid voor hoge doorvoer. Bij traditionele methoden worden gemiddelde waarden van de hele populatie overwogen bij het analyseren van microbiële cultivatie. Bovendien hebben bestaande methoden handmatig monsteronderzoek nodig, wat kan leiden tot degradatie van monsters en dus tot fouten in de meting. De PLBR biedt nieuwe perspectieven voor bioprocesontwikkeling en populatieheterogeniteitsanalyse in de microbiologie. De PLBR is een veelbelovend hulpmiddel voor verschillende toepassingen binnen bioprocesontwikkeling en kan worden toegepast in verschillende onderzoeksgebieden, bijv. analyse van cel-tot-cel heterogeniteit, analyse van specifieke celclusters binnen cellijnen, screening van microbiële productiestammen en real-time onderzoek van celfenotypen.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs willen de technicus Agnes Müller-Schröer bedanken voor haar waardevolle bijdrage. Dit werk werd gedeeltelijk uitgevoerd bij Helmholtz Nanoelectronic Facility (HNF) bij Forschungszentrum Jülich GmbH. De auteurs zijn dankbaar voor de genereuze hulp en ondersteuning.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Silicon wafer 100 mm diameter, P/BOR <100>Si-MAT, Silicon Materials, Germany
Photoresist SU-8 2000.5Micro Resist Technology GmbH, Germany
Photoresist SU-8 2010Micro Resist Technology GmbH, Germany
SU-8 Developer mr DEV- 600Micro Resist Technology GmbH, Germany
Polydimethylsiloxane (PDMS) Sylgard 184 Silicone Elastomer KitDow Corning; Farnell GmbH, Germany
Dispensing needles Precision Tips  27 G; ID = 0.2 mm, OD = 0.42 mmNordson EFD Deutschland, Germany
Glass plates D263 T eco, 30 mm x 25 mm x 0.17 mmSchott AG, Germany
Hole puncher AKA 5130-B-90Harris Uni-Core
Tubing Tygon S-54-HL, ID = 0.25 mm, OD = 0.76 mmSaint Gobain; VWR International GmbH, Germany
Disposable Syringes – Omnifix Spritzen BRAUN Omnifix 40 Duo, 1 mlB. Braun Melsungen AG, Germany552-183143
Syringes, 1 ml sterile glass syringesINNOVATIVE LABOR SYSTEME GMBH (ILS), Germany
Chemicals
(NH4)2SO4Carl Roth GmbH + Co. KG, Germany
UreaCarl Roth GmbH + Co. KG, Germany
KH2PO4Carl Roth GmbH + Co. KG, Germany
K2HPO4Carl Roth GmbH + Co. KG, Germany
MgSO4•7H2OCarl Roth GmbH + Co. KG, Germany
MOPSCarl Roth GmbH + Co. KG, Germany
FeSO4•7H2OCarl Roth GmbH + Co. KG, Germany
MnSO4•H2OCarl Roth GmbH + Co. KG, Germany
ZnSO4•7H2OCarl Roth GmbH + Co. KG, Germany
CuSO4Carl Roth GmbH + Co. KG, Germany
NiCl2•6H2OCarl Roth GmbH + Co. KG, Germany
CaCl2Carl Roth GmbH + Co. KG, Germany
BiotinCarl Roth GmbH + Co. KG, Germany
Procatechuic acidCarl Roth GmbH + Co. KG, Germany
Glucose-MonohydrateCarl Roth GmbH + Co. KG, Germany
BHIBecton, Dickinson
Cells
Corynebacterium glutamicum ATTC 13032DSMZ; Leibniz-Institut DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Germany
Escherichia coli MG 1655DSMZ; Leibniz-Institut DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Germany
Equipment
Wafer Cleaner SSEC 3300Solid State Equipment LLC
Spin Coater SPIN150 -NPPSPS Europe B.V.
Mask Aligner MA-6Karl Suess
Hot Plate HP30A - 2Torrey Pines Scientific
Laboratory oven Memmert UN 200Memmert
Plasma Cleaner FEMTODiener Electronics, Germany
neMESYS syringe pumpsCetoni GmbH, Germany
Magnetic stirrer CB 162StuartVWR 442-0304
Microscope Nikon Eclipse TiNikon Microscopy
Microscope incubuatorPecon GmbH, Germany
Centrifuge minispin plus “black line”Eppendorf9776501
Photometer BioPhotometer plus Eppendorf6132000008
Shake flask shaker/incubator 3031GFL - Gesellschaft für Labortechnik mbH, Germany
Profilometer, Dektak 150 Stylus ProfilerVeeco

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Muzzey, D., van Oudenaarden, A. Quantitative Time-Lapse Fluorescence Microscopy in Single Cells. Ann. Rev. Cell Dev. Biol. 25, 301-327 (2009).
  2. Wei, P., et al. Bacterial virulence proteins as tools to rewire kinase pathways in yeast and immune cells. Nature. 488, 384-388 (2012).
  3. Park, S., et al. Influence of topology on bacterial social interaction. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 13910-13915 (1073).
  4. Lee, P. J., Helman, N. C., Lim, W. A., Hung, P. J. A microfluidic system for dynamic yeast cell imaging. BioTechniques. 44, 91-95 (2008).
  5. Kobel, S. A., et al. Automated analysis of single stem cells in microfluidic traps. Lab Chip. 12, 2843-2849 (2012).
  6. Carlo, D. D., Wu, L. Y., Lee, L. P. Dynamic single cell culture array. Lab Chip. 6, 1445-1449 (2006).
  7. Locke, J. C. W., Young, J. W., Fontes, M., Jimenez, M. J. H., Elowitz, M. B. Stochastic Pulse Regulation in Bacterial Stress Response. Science. 334, 366-369 (2011).
  8. Boedicker, J. Q., Li, L., Kline, T. R., Ismagilov, R. F. Detecting bacteria and determining their susceptibility to antibiotics by stochastic confinement in nanoliter droplets using plug-based microfluidics. Lab Chip. 8, 1265-1272 (2008).
  9. Fritzsch, F. S. O., et al. Picoliter nDEP traps enable time-resolved contactless single bacterial cell analysis in controlled microenvironments. Lab Chip. 13, 397-408 (2013).
  10. Groisman, A., et al. A microfluidic chemostat for experiments with bacterial and yeast cells. Nat. Methods. 2, 685-689 (2005).
  11. Mather, W., Mondragon-Palomino, O., Danino, T., Hasty, J., Tsimring, L. S. Streaming Instability in Growing Cell Populations. Phys. Rev. Lett. 104, (2010).
  12. Wang, P., et al. Robust growth of Escherichia coli. Curr. Biol. 20, 1099-1103 (2010).
  13. Grunberger, A., et al. A disposable picolitre bioreactor for cultivation and investigation of industrially relevant bacteria on the single cell level. Lab Chip. 12, 2060-2068 (2012).
  14. Walden, M., Elf, J. Studying transcriptional interactions in single cells at sufficient resolution. Curr. Opin. Biotech. 22, 81-86 (2011).
  15. Keymer, J. E., Galajda, P., Lambert, G., Liao, D., Austin, R. H. Computation of mutual fitness by competing bacteria. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 20269-20273 (2008).
  16. Keymer, J. E., Galajda, P., Muldoon, C., Park, S., Austin, R. H. Bacterial metapopulations in nanofabricated landscapes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 17290-17295 (2006).
  17. Grunberger, A., et al. Beyond growth rate 0.6: Corynebacterium glutamicum cultivated in highly diluted environments. Biotechnol. Bioeng. 110, 220-228 (2013).
  18. Binder, S., et al. A high-throughput approach to identify genomic variants of bacterial metabolite producers at the single-cell level. Genome Biol. 13, (2012).
  19. Mustafi, N., Grunberger, A., Kohlheyer, D., Bott, M., Frunzke, J. The development and application of a single-cell biosensor for the detection of L-methionine and branched-chain amino acids. Metab. Eng. 14, 449-457 (2012).
  20. Huber, R., et al. Robo-Lector - a novel platform for automated high-throughput cultivations in microtiter plates with high information content. Microb. Cell Fact. 8, (2009).
  21. Keilhauer, C., Eggeling, L., Sahm, H. Isoleucine synthesis in Corynebacterium glutamicum: molecular analysis of the ilvB-ilvN-ilvC operon. J. Bacteriol. 175, 5595-5603 (1993).
  22. Frunzke, J., Bramkamp, M., Schweitzer, J. E., Bott, M. Population Heterogeneity in Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 caused by prophage CGP3. J. Bacteriol. 190, 5111-5119 (2008).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Microfluidic Picoliter BioreactorSingle Cell AnalysisCorynebacterium GlutamicumPDMS Chip FabricationSU 8 PhotolithographyTime lapse MicroscopyBacterial Culture PreparationContinuous Media FlowIsogenic MicrocoloniesAutomated Imaging

Gerelateerde artikelen