Mouse Genome engineering behulp Designer Nucleasen

Summary

Designer nucleasen zoals zinkvinger nucleasen (ZFNs) en transcriptie activator-achtige effector nucleasen (Talens) kan worden gebruikt om het genoom van de muis implantatie embryo's wijzigt activeren zowel de homologe eind mee (NHEJ) en homologe recombinatie (HR) wegen. Deze voorschotten in staat de snelle generatie van muizen met precieze genetische modificaties.

Abstract

Transgene muizen die site-specific genoom modificaties (knockout, knock-in) zijn van vitaal belang voor het ontleden van complexe biologische systemen als voor het modelleren van menselijke ziekten en het testen van therapeutische strategieën. Recente ontwikkelingen in het gebruik van designer nucleasen zoals zinkvinger nucleasen (ZFNs), transcriptie activator-achtige effector nucleasen (Talens), en geclusterde regelmatig afgewisseld korte palindromische herhalingen (CRISPR) /-CRISPR geassocieerde (CAS) 9 voor plaatsspecifieke specifieke genoom techniek opent de mogelijkheid om snelle en gerichte genoom modificatie uit te voeren in vrijwel elk laboratorium soorten zonder de noodzaak om vertrouwen op embryonale stamcellen (ES)-technologie. Een genoom bewerken proef begint typisch met identificatie van designer nuclease doelplaatsen binnen een gen van belang, gevolgd door constructie van custom DNA-bindende domeinen nuclease activiteit rechtstreeks aan de onderzoeker bepaalde genomische locus. Ontwerper nuclease plasmiden in vitro </ Em> getranscribeerd naar mRNA te genereren voor micro-injectie van bevruchte eicellen muis. Hier bieden we een protocol voor het bereiken van gerichte genoom wijziging door directe injectie van TALEN mRNA in bevruchte muis eicellen.

Introduction

Muizen zijn veruit de meest populaire platform voor het genereren van transgene diermodellen. De veelzijdige toolbox voor genetische manipulatie van de muis embryo ^1-3 is onlangs uitgebreid met genoom bewerken benaderingen op basis van designer nucleases zoals zink finger nucleases (ZFN) ^4-6, transcriptie activator-achtige effector nucleases (TALEN) ^7,8, en de geclusterde regelmatig afgewisseld korte palindromische herhalingen (CRISPR) /-CRISPR geassocieerd (CAS) 9 systeem ^9. ZFN en TALEN functie als paren van twee speciaal ontworpen eiwit gebaseerde DNA-bindende domeinen (arrays van zinkvinger eiwitten en herhaalde variabele di-residuen (RVDS), respectievelijk) die elk zijn gekoppeld met de FokI endonuclease ^10-12. Omgekeerd wordt de specificiteit van Cas9-gemedieerde DNA-splitsing door transactiverende CRISPR RNA (crRNA en tracrRNA, die ook kunnen worden gecombineerd tot een enkel chimeer RNA-molecuul aangeduid lijst RNA) ¹¹ die elk een complex met deCRISPR eiwit.

Talens met een gedefinieerde opeenvolging van RVDS kan snel worden gebouwd door individuele onderzoekers met een veelheid van vergadering strategieën te kiezen ^13-17. CRISPR/Cas9 belooft nog minder arbeidsintensieve productie van designer nucleasen, maar de specificiteit van de geleider RNA-DNA-binding nog niet volledig opgelost ^18,19. Generatie van aangepaste ZFNs is tot nu toe beperkt tot gespecialiseerde academische laboratoria en commerciële leveranciers zoals Sangamo Biosciences en de Sigma CompoZr service.

In het algemeen genoom bewerken met designer nucleases wordt beoogd dubbele breuken (DSB) op bepaalde genomische loci, die vervolgens aan te trekken niet-homologe eind mee (NHEJ) of homologe recombinatie (HR) DNA-reparatie machines ^10,12. NHEJ gemedieerde reparatie van DSB resulteert vaak in de inleiding van inserties en deleties in de nabijheid van de plaats van reparatie. Zo NHEJ reparatie ceen worden benut voor het uitspelen van de functie van een target-gen door de invoering van een frame-shift mutatie in de genen-eiwit coderende sequentie ^4,7,9. Alternatief kan gedefinieerd toevoeging of vervanging van genetische informatie worden bereikt door een DNA-donor samen met de ontwerper nucleasen. Een DNA donor omvat onderzoekers ontworpen DNA-sequenties geflankeerd door gebieden met homologie met de doelwitlocus, dus dienen als een sjabloon voor DSB reparatie door HR. Beide plasmiden ^5,6,20 en enkelstrengs oligonucleotiden ^8,9,21 zijn met succes gebruikt als donor. Noch NHEJ-nor-HR gemedieerde genoom bewerkt moeten de introductie van een selecteerbare merker in het genoom van de muis embryo, dat deze strategieën bijzonder geschikt voor het maken van kleine veranderingen in de nucleotidesequentie zonder de totale genetische architectuur maakt.

In dit protocol beschrijven we alle essentiële voorwaarden voor genoom bewerken in demuis embryo met behulp van Talens. Deze omvatten 1) identificatie van een TALEN target site ^22, 2) bouw van Talens door gouden poort klonen ^13, 3) in vitro synthese van TALEN mRNA, 4) micro-injectie van TALEN mRNA in bevruchte muis eicellen, 5) chirurgische procedures voor de embryo transfer en 6) analyseren van TALEN geïnduceerde mutagenese in grondlegger dieren. Wij richten ons op TALEN mRNA micro-injectie en screening van oprichters voor NHEJ-geïnduceerde inserties / deleties. Hiervoor hebben we bifunctionele TALEN constructen die zowel expressie in zoogdiercellen uitgevoerd wanneer getransfecteerde plasmiden en in vitro synthese van TALEN mRNA voor micro-injectie in muisembryo's gegenereerd. Deze constructen omvatten een afgeknotte TALE ruggengraat ²³ gefuseerd heterodimere FokI domeinen ^24,25 optimale genoom bewerking in zoogdiercellen. Dit protocol kan ook voor micro-injectie van andere designer nucleasen of gecombineerde injecties van ontwerper nucleases worden aangenomenen donor constructies (ontwerp van DNA donoren is in uitstekende technische publicaties beschreven door Wefers et al.. ^26,27).

Ethische verklaring

Alle dierproeven werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen en voorschriften van de Kantonnale Veterinair Bureau van het kanton Zürich.

Protocol

1. Identificatie van TALEN doelplaatsen

1. Bezoek de TAL Effector Nucleotide Targeter 2.0 website (http://tale-nt.cac.cornell.edu) en kies "TALEN Targeter".
2. Voer de sequentie van het doelwitgen. Als pCAG-T7-TALEN expressie constructen wordt gebruikt (figuur 1C) kiezen "Miller et al.., 2011" onder "Gebruik een Preset Architecture" om doel sites die kan worden gericht met de optimale lengte van de tussengroep voorspellen (15-20 bp) en nummers van TALE RVDS (15-20) voor dit TALEN architectuur.
3. Kies "NN" onder "G Substitute" (Guanosine-specifieke NH RVDS zijn ook beschikbaar, maar nog niet uitvoerig getest op TALEN montage).
4. Optioneel: voor de andere instellingen en opties volg dan de instructies op de website en de links er voorzien.
5. Een tekstbestand met potentieel doelwit-sites is gegenereerd, die kunnen wordenin een spreadsheet programma voor meer handige weergavefuncties geïmporteerd. Selecteer de TALEN paar (s) voor Golden Gate montage.
6. Optioneel: Sequence de genomische regio van belang in de muis stam die zal worden gebruikt voor micro-injectie om mogelijke single nucleotide polymorfismen (SNP's) die niet kunnen worden verantwoord in openbare databanken en op te sporen kan mogelijk voorkomen nuclease bindend.
7. Optioneel: Zie Tabel 3 voor extra designer-nucleases gerelateerde online bronnen.
8. De meeste plasmiden die nodig zijn voor ZFN en TALEN constructie kan worden verkregen bij Addgene:
   http://www.addgene.org/special-collections/
   Addgene ID's voor de Golden Gate TALEN kit en zoogdieren TALEN expressie constructen worden gegeven in tabel 2.
   Als alternatief kan bijzonder functionele modules zoals zinkvingerdomeinen uit een gensynthese service provider worden besteld.

2. Golden Gate TALEN Vergadering

Deze paragraaf beschrijft de montage van Talens met behulp van een protocol gepubliceerd door Cermak et al.. ¹³ Full-length Talens zijn gebouwd met behulp van twee opeenvolgende Golden Gate kloneringsstappen (figuur 1). Deze benadering maakt de opneming van een aantal RVDS tussen 12 en 31 in de uiteindelijke expressieconstructen. Het samenstel protocol is aangepast om bestemming vectoren ontworpen voor het genereren van mRNA (figuur 1C) die zeer actief Talens volgende eicel microinjectie drukken. Raadpleeg ook de online protocol van de Golden Gate TALEN kit voor het opzetten en onderhouden van het plasmide bibliotheek ( http://www.addgene.org/TALeffector/goldengateV2/ ).

1. Dag 1 - Golden Gate Reactie # 1 - Montage van RVD Arrays in pfu's Vectoren
   1. Optioneel: Voor elke TALEN paar ontworpen in PPROTOCOL 1, voert de DNA-sequentie van de twee de doelplaatsen (inclusief de initiële T, 5 'naar 3') in de TALEN_Voytas_Pipetting spreadsheet een pipetteren regeling per Golden Gate-reactie (ook invoeren concentraties van alle plasmiden die voor de samenstellen ). Het werkblad biedt ook de verwachte DNA-sequentie van RVDS die kunnen worden gebruikt voor het uitlijnen van sequencing resultaten in paragraaf 2.5.2.
   2. Voor elke unieke TALEN ontworpen in Protocol 1:
      Als TALEN lengte is 12-21 (standaard), selecteert repeat variabele di-residuen (RVDS) 1-10 en bestemming vector pFUS_A. Selecteer resterende RVDS en een bestemming pFUS_B vector, bijvoorbeeld voor een TALEN met 15 RVDS (met inbegrip van de laatste herhaling, die zal worden toegevoegd aan de eindmontage in paragraaf 2.3.3, selecteert RVDS 11-14 en bestemming vector pFUS_B4 (Figuur 1A).
      Als TALEN lengte is 22-31, gebruik RVDS 1-10 en bestemming vector pFUS_A30A. Kies RVDS 11-20 en bestemming vector pFUS_A30B. Selecteer resterende RVDS en een pFUS_Bdestination vector, bijv. voor TALEN met 24 RVDS pick RVDS 21-23 en bestemming vector pFUS_B3.
   3. Opgezet Golden Gate reactie # 1 voor elke pfu + RVD combinatie afzonderlijk, dwz 1-10 + pFUS_A en resterende RVDS + respectieve pFUS_B vector of voor TALEN langer dan 21 RVDS, 1-10 + pFUS_A30A, 11-20 pFUS_A30B, en de resterende RVDS + respectieve pFUS_B vector. Gebruik 150 ng elk RVD vector, 150 ng vector pfu, 1 ui BsaI, 1 ui T4 DNA ligase, 2 pi 10 x T4 DNA ligase buffer, en _H2O tot 20 ul totaal reactievolume. (Gebruik verse monsters van T4 ligase buffer voor elke ronde van Golden Gate samenstellingen wordt aanbevolen omdat herhaald ontdooien / invriezen van T4-efficiëntie van de reactie te verminderen.)
   4. Plaats Golden Gate reacties in een thermo fietser.
      Programma:
      37 ° C 5 min
      16 ° C 10 min
      10 cycli
      50 ° C 5 min
      80 ° C 5 min
   5. Voeg 1 ul 10 mM ATP en 1 pi plasmide-Safe nuclease elk en incubeer bij 37 ° C gedurende 1 uur. Deze behandeling zal lineaire onvolledig ligatieproducten die kunnen worden gekloneerd in de bestemming vectoren in vivo homologe recombinatie in getransformeerde bacteriën te verwijderen.
   6. Transform E. coli met afzonderlijke ligatiereacties (elektrocompetente of chemisch competente E. coli dat α-complementatie vergemakkelijken zoals XL1-Blue of DH5a hier en in de volgende transformaties gebruikt).
   7. Plaat bacteriën op spectinomycine (50 ug / ml) platen met X-Gal en IPTG (40 ug / ml elk) voor blauwe / witte kolonieselectie.
2. Dag 2 - Bevestiging van correcte pfu-RVDS Vergadering
   1. Door het gebruik van kolonie PCR met primers pCR8_F1 en pCR8_R1 (Zie tabel 1 voor primer sequenties) scherm 1-3 witkolonies van elke plaat. Correct pfu-RVDS samenstellingen vertonen doorgaans een band die overeenkomt met de gecombineerde lengte van alle RVDS gekloneerd (bijv. ongeveer 1,1 kb 10 RVDS) en een "ladder" kleinere minder duidelijke banden (Figuur 1B).
      PCR-programma:
      95 ° C 3 min
      95 ° C 30 sec
      55 ° C 30 sec
      72 ° C 1 min 45 sec
      30-35 cycli
      72 ° C 10 min
   2. Gebruik bevestigde klonen overnacht cultuur beginnen (2-5 ml LB met 50 ug / ml spectinomycine).
3. Dag 3 - Golden Gate Reactie # 2 - RVD Arrays in TALEN Expression Vectors
   1. Voer "minipreps" naar pfu-RVD assemblies isoleren (afhankelijk van het aantal RVDS ofwel pFUS_A en pFUS_B of pFUS_A30A, pFUS_A30B en pFUS_B).
   2. Optioneel: Sequence individuele pfu vectoren met behulp van primers pCR8_F1, pCR8_R1 (zie tabel 1 voor primer sequenties). Sequencing kan ook worden uitgevoerd op final TALEN construeert (paragraaf 2.5.2); echter voor langere Talens compleet leest van alle RVDS misschien niet mogelijk met behulp van Sanger sequencing.
   3. Opgezet Golden Gate reactie # 2 voor elke afzonderlijke TALEN. 150 ng van elk pfu vector, 150 ng PLR-HD, PLR-NG, PLR-NI, PLR-NN (laatste "half-repeat") volgens het ontwerp van de RVD sequentie en voor de l inks TALEN gebruiken 75 ng van pCAG-T7-TALEN-ELD-bestemming en voor de juiste TALEN gebruiken 75 ng pCAG-T7-TALEN-KKR-Bestemming (of vice versa). Voeg 1 ul Esp3I, 1 ui T4 DNA ligase, 2 pi 10 x T4 DNA ligase buffer, _H2O tot 20 ul totaal reactievolume.
   4. Plaats Golden Gate reacties in een thermo fietser.
      Programma:
      37 ° C 5 min
      16 ° C 10 min
      10 cycli
      37 ° C 15 min
      80 ° C 5 min
   5. Gebruik reacties van punt 2.3.4 te transformeren E. coli.
4. Dag 4 - Bevestiging van correcte TALEN Vergadering
   1. Scherm 1-3 witte kolonies van elke plaat door kolonie PCR met primers TAL_F1 en TAL_R2 (zie tabel 1 voor primer sequenties). Correct geassembleerde Talens tonen een PCR-product met een lengte die overeenkomt met het totale aantal RVDS opgenomen (figuur 1D, band soms moeilijk te detecteren terwijl het "ladder effect" een sterke indicator van succesvolle montage).
      PCR-programma:
      95 ° C 3 min
      95 ° C 30 sec
      55 ° C 30 sec
      72 ° C 3 min
      30-35 cycli
      72 ° C 10 min
   2. Gebruik bevestigd juiste klonen overnacht bacteriële kweken (2-5 ml LB met 100 ug / ml ampicilline) starten.
5. Dag 5 - Bevestiging van correcte TALEN Vergadering
   1. Voer "minipreps" naar pCAG-T7-TALEN plasmiden te isoleren.
   2. Als sequentie niet werd uitgevoerd sectie 2.3.2, gebruik primers TAL_Seq_5-1 en TAL_R2 (zie tabel 1 voor primer sequenties) te bepalen juiste RVD assemblage in full-length TALEN.

3. Nuclease mRNA synthese

1. Generatie van DNA Template
   1. Bereid hoge kwaliteit midi of maxipreps van pCAG-T7-TALEN plasmiden voor mRNA-synthese.
   2. Lineariseren 10 ug van de TALEN of ZFN mRNA synthese plasmide met een restrictie enzym dat knipt bij voorkeur stroomafwaarts en in de nabijheid van de nuclease STOP codon (voor pCAG-T7-TALEN vectoren SacI). mRNA-synthese plasmiden typisch een T7 of SP6 faag promoter stroomopwaarts van de coderende sequentie nuclease.
   3. Run 200-500 ng verteerd plasmide op een 0,7-1% agarosegel om te controleren op volledige spijsvertering.
   4. Verwijder zouten uit plasmide door verteren precipiteren van het DNA met 0,1 volume natriumacetaat en 3 volumes ethanol gedurende 1 uur bij kamertemperatuur Temperatuure. Pellet de DNA door centrifugatie bij 14.000 xg of meer gedurende 10 minuten, was het pellet met 200 ul 70% ethanol, rotatie nog 5 minuten, wordt de ethanol, lucht droog de pellet en resuspendeer in een geschikt volume van RNAse-vrij water. Zuivering van het gelineariseerde plasmide is ook mogelijk met een kolom systeem, bijv. QIAquick PCR Purification Kit.
   5. Bepaal de concentratie van het lineaire template en gebruik 1 ug te zetten in vitro transcriptie.
2. mRNA synthese en Polyadenylatie
   1. Voor in vitro transcriptie van pCAG-T7-TALEN plasmiden gebruiken de mMESSAGEmMACHINE T7 Ultra Kit. Stel de transcriptie reactie voor elke TALEN op ijs: tot 20 ul met nuclease-vrij water, 10 pi T7 2x NTP / ARCA, 2 pi 10x T7 Reaction Buffer, 1 ug van DNA-template, 2 pi T7 enzym mix. Meng de reactie en incubeer gedurende 1-2 uur bij 37 ° C.
   2. Gebruik de volledige 20 ul transcriptietie reactie mix het opzetten van de polyadenylerings reactie op het ijs: 36 ul van nuclease-vrij water, 20 pi 5x EPAP buffer, 10 pi 25 mM MnCl2, 10 pi 10 mM ATP. Mix en verwijder 2,5 ul van het reactiemengsel als controlemonsters L1 en R1 (voor links en rechts nuclease, respectievelijk). Voeg 4 pi E-PAP enzym en incubeer de reactie gedurende 45-60 min bij 37 ° C. Verwijder een 2,5 pi reactiemengsel controlemonsters L2 en R2.
3. mRNA Zuivering
   1. Gebruik NucAway Spin Kolommen voor mRNA-zuivering (buffer uitwisseling en verwijdering van niet opgenomen nucleotiden). Tik kolommen droge gel vestigen in de bodem van de kolom. Hydrate kolom met 650 ul RNAse-vrij microinjectie buffer (1 mM Tris-Cl, 0,1 EDTA, pH 7,5). Cap, draaikolk, kraan uit luchtbellen en hydrateren gedurende 5-15 minuten bij kamertemperatuur.
   2. Plaats de kolom in een verzameling buis en draaibij 750 xg, 4 ° C gedurende 2 minuten om overtollig interstitiële vloeistof te verwijderen. Gooi collectie buis en plaats kolom in een 1,5 ml elutiebuisje.
   3. Toepassen volledige reactiemengsel uit sectie 3.2.2 kolom en draaien op 750 xg, 4 ° C gedurende 2 minuten. Nuclease mRNA wordt nu opgelost in micro-injectie buffer. Verwijder 2.5 gl gezuiverde monsters L3 en R3.
   4. WINKEL mRNA bij -80 ° C totdat microinjectie hoeveelheden bereid.
4. mRNA Gelelektroforese
   1. Reinig een gel kamer om RNAse verontreinigingen verwijderen met behulp van 10% SDS-oplossing of RNaseZAP.
   2. Bereid een 1% agarosegel in 1xTBE loopbuffer.
   3. Meng elk RNA-monster L1/R1, L2/R2, L3/R3 met 3 delen NorthernMax Formaldehyde Load Dye en incubeer gedurende 15 minuten bij 65 ° C.
   4. Lading samples en een RNA-size ladder (bv. RNA Millennium grootte marker) op de gelen lopen gel bij 10 V / cm in 1x TBE tot ladingskleurstof het einde van de gel bereikt.
   5. Vlekken op de gel met SYBR green oplossing (Invitrogen) gedurende 30-60 minuten onder roeren bij kamertemperatuur.
   6. Het imago van de gel en de afmetingen te vergelijken van L1/R1 met L2/R2 en L3/R3. Monsters L2/R2 en L3/R3 moeten banden van een toegenomen grootte in verhouding tot L1/R1 tonen aangeeft succesvol polyadenylerings in (figuur 2).
   7. Bepaal mRNA concentratie met behulp van een spectrofotometer.
   8. Bereid mRNA monsters voor micro-injecties door mengen nuclease linker en rechter nuclease mRNA in een 1:1 verhouding. We raden bereiden monsters met een totale concentratie van 200 ng / pl (100 ng / ul van elk nuclease) door verdunning met micro-injectie buffer. WINKEL mRNA aliquots bij -80 ° C.

4. Embryo Isolatie en micro-injectie

1. Embryo Isolatie. Dit protocol is met succes gebruikt bij C57BL/6J en BDF1 stams en kan waarschijnlijk worden aangepast aan andere stammen algemeen in micro-injectie experimenten zoals FD of CBF1. De muizen worden gehuisvest onder een 12 uur-12 uur licht-donker cyclus in een temperatuur-en vochtigheid gecontroleerde faciliteit met voedsel en water ad libitum.
   1. Superovuleren donordieren om de opbrengst van embryo verhogen. 16 vrouwen (4 weken oud) worden gesuperovuleerde door intraperitoneale (ip) injectie van serum gonadotropin 5 IU drachtige merrie (PMSG), gevolgd door ip injectie van 5 IE humaan choriongonadotrofine (hCG) 48 uur later.
   2. Mate de 16 gesuperovuleerde vrouwtjes tot 16 vruchtbare leeftijd (2-8 maanden) mannetjes onmiddellijk na de hCG-injectie.
   3. Offer de vrouwtjes met behulp van een goedgekeurde euthanasie protocol zoals CO ₂ inhalatie.
   4. Herstellen van de bevruchte eicellen. Eicellen worden verzameld uit eileiders de volgende ochtend en dan bevrijd van alle resterende cumulus cellen door een 3-5 minuten behandeling in 0,1% bovine hyaluronidase opgelost in M2 medium. Afhankelijk van het paargedrag en de stam gebruikt de embryo opbrengst kan variëren. 16 C57BL/6J vrouwtjes meestal 150-250, terwijl BDF1 opbrengst 300-400 bevruchte eicellen, respectievelijk.
2. Embryo Microinjection
   1. Spuit de nuclease mRNA. Pronucleaire stadium eicellen zijn meestal geïnjecteerd in de vroege namiddag. Cytoplasmatisch mRNA micro-injectie wordt uitgevoerd in M2-medium onder minerale olie met behulp van een omgekeerde microscoop met behulp van DIC Nomarski 20X objectief en embryo micromanipulators en een injectie-eenheid. We raden begin van de injecties TALEN mRNA in een concentratie van 10 ng / ul (20 ng / ul totaal).
   2. Zuig de eicel met een bedrijf capillair en injecteer de nuclease mRNA in het cytoplasma van de embryo vermijden van contact met de pronuclei. De injectie dient ondiepe, dichtbij de plasma membraan. De injectie volume laag te houden en de micro-injectie naald moet wit zijnhdrawn bij de eerste tekenen van cytoplasmatische uitzetting. Een micro-injectie serie bestaat normaliter uit 100-300 eicellen. Normaal gesproken moet ten minste 80-90% van de embryo's de injectie overleven zonder directe lysis.
   3. Na micro-injectie, plaatst de embryo's gedurende 1 uur in M16 (Sigma) bij 37 ° C en 5% _CO2 en breng de overlevende embryo's in pseudozwangere pleegmoeders.

5. Chirurgische Embryo Transfer

1. Bereid pseudozwanger embryo ontvangers (pleegmoeders) een dag voor mRNA micro-injectie. Volwassen vrouwtjes (3-6 maanden oud) van een robuuste outbred stam, zoals CD-1, zijn zeer geschikt voor de rol. Induceren pseudozwangerschap door paring de vrouwtjes op een vorige dag met ofwel chirurgisch of genetisch vasectomized mannen ^28. Slechts 0,5 DPC vrouwen met een duidelijke copulatory plug worden gebruikt als embryo ontvangers. In ongebruikte vrouwen verdwijnt de schijndracht na ongeveer 3 weeks waardoor het herhaald gebruik.
2. Verdoven de 0,5 dpc pleegmoeder vrouwtjes door ip injectie van ketamine, xylazine (120 mg / kg en 16 mg / kg, respectievelijk). Deze formulering garandeert ~ 30 min chirurgische tolerantie is ruim voldoende voor de beoogde werking van 5-10 minuten.
3. Plaats de verdoofde dier op haar buik op een warme ondergrond en ontsmet het gebied van de incisie met een geschikt desinfectiemiddel, zoals 70% ethanol of chloorhexidine en alcohol mengsel.
4. Incise de huid op de rug van het dier en open de peritoneale holte met een steriele schaar.
5. Visualiseren en externalize de baarmoeder hoorn door aan het vet pad aan de eierstok. Houd de organen vochtig met warm 0,9% NaCl-oplossing. Houd in gedachten dat de operatiewond kan moeten worden gedrapeerd met steriel verband of geschoren om te voldoen aan lokale veterinaire richtlijnen.
6. Immobiliseer de voortplantingsorganen door knippen de eierstok vet pad met een bulldog klem.
7. Voorzichtig pakt u de eileider net stroomopwaarts van de ampulla met horlogemaker pincet en gebruik een 30 G injectienaald om een ​​klein gat in de eileider muur te creëren.
8. Trek de naald en steek een dunne glazen capillair met de embryo's in het gat waardoor de plaatsing van de embryo's in de ampulla door zachtjes te blazen in het mondstuk van de capillaire houder. Trek de capillaire wanneer de embryo's worden in de ampulla en vervang de voortplantingsorganen terug in de lichaamsholte.
9. Sluit de peritoneale holte met een reeks steriele hechtingen (Prolene 6-0).
10. Sluit de huid met 1-2 wondklemmen (Autoclip 9 mm) afhankelijk van de grootte van de opening.
11. Na de operatie terug de dieren naar de kooi en begeleiden hen totdat het effect van verdoving slijten.
12. Om stress te minimaliseren, het huis van de muizen in stabiele sociale groepen (2-4 dieren / type III kooi) waar mogelijk.
13. Solliciteer postoperatieve pijnstillendes in de vorm van Dafalgan toegevoegd aan het drinkwater (paracetamol 200 mg / kg BW) gedurende 3 dagen na de operatie.

6. Analyse van de oprichters van PCR en T7 Endonuclease of met restrictie-enzymen

1. Ontwerp van primers voor een gebied tussen 200-700 bp rond de nuclease bindingsplaats amplificeren. De afstanden voorwaartse primer-nuclease spacergebied en nuclease spacergebied-reverse primer moet voldoende verschillen om detectie van twee banden voor gedigereerde producten op een agarosegel (zie figuren 3 en 4 voorbeelden) zijn.
2. Run PCR met geoptimaliseerde omstandigheden. Controleer PCR amplicon grootte op een agarosegel.
3. Optioneel: Zuiveren PCR-producten, bijvoorbeeld met QIAquick PCR Purification Kit aan zouten en nucleotiden van de PCR-mix te verwijderen. Vele restrictie-enzymen zijn actief in PCR monsters aangevuld met het geschikte restrictie-enzym buffer en zuivering is niet noodzakelijk. We hebben ook successfully gebruikt T7 endonuclease in QiagenTaq PCR-buffer aangevuld met NEBuffer 2.
4. 1. T7 endonuclease analyse. Meng 17 ui PCR-product met 2 ui NEBuffer 2 en run heteroduplexvorming (figuur 3b) programma in een thermocycler:
      95 ° C 2 min
      95 ° C tot 85 ° C (2 ° C / sec)
      85 ° C tot 25 ° C (-0,1 ° C / sec)
      4 ° C te houden.
      Voeg 1 pl T7 endonuclease aan elk monster en geïncubeerd bij 37 ° C gedurende 20 minuten. (De landmeter assay (Transgenomic), die zich baseert op CEL 1 nuclease, kan ook hier worden gebruikt. Raadpleeg de instructies van de fabrikant.)
   2. Restrictiedigest van PCR-product. Meng 17 ui PCR-product met 2 ui 10X restrictie-enzym buffer en 1 ui restrictie-enzym. Digest bij geschikte temperatuur gedurende 1 uur of meer.
5. Voeg DNA laadkleurstof monsters en lopen op een 2% agarose gel om afzonderlijke digestie detecterenpatronen voor wild-type dieren en oprichters dragen gemuteerde allelen. Zie figuren 3 en 4 voor verwachte resultaten.
6. Clone PCR-producten van oprichters positief voor gemuteerde allelen voor Sanger sequencing (bijv. door TA-klonering in pGEM-T Easyor direct sequencen mengsels van PCR producten met behulp van next-generation sequencing.

Results

We geconstrueerde plasmiden bestemming verenigbaar met de Gouden GateTALEN samenstel gepubliceerd door Cermak et al.. ¹³ dat expressie van Talens in zoogdiercellen en in vitro mRNA synthese uit de faag T7 promotor (figuur 1C) mogelijk. Deze plasmiden dragen heterodimere FokI domeinen (ELD of KKR mutaties) die zijn aangetoond off-doeleffecten opzichte FokI homodimeren verminderen en splitsing activiteit te verhogen in vergelijking met de eerste generatie FokI heterodimeren ^25,29. Golden schuifelementsamenstel reacties # 1 en # 2 zijn meestal zeer efficiënt en elke witte kolonie, wanneer geanalyseerd door kolonie PCR toont het verwachte patroon voor het specifieke aantal RVDS gekloneerd (Figuren 1B en 1D).

Gel-analyse van in vitro gesynthetiseerde mRNA (figuur 2) moet een onderscheiden band met weinig of geen uitstrijk voor ieder monster geanalyseerd onthullen. Er moet een duidelijk formaat verschuiving tussen monsters L1/R1 en L2/R2, L3/R3, die succesvol polyadenylering aangeeft zijn.

Grondlegger dieren kunnen worden gescreend NHEJ-geïnduceerde gemuteerde allelen genotypering met behulp van PCR gevolgd door T7 endonuclease digestie (Figuur 3) of restrictie digestie met een enzym dat splitst de wildtype sequentie in het spacergebied van het nuclease paar (figuur 4). De T7 endonuclease test is van toepassing op elke vorm van mutatie, ongeacht de specifieke genomische sequentie in het spacergebied van het nuclease paar geïnjecteerd; echter, het detecteert alleen mismatches tussen DNA-strengen in heteroduplex PCR-producten. Dus, in het zeldzame geval dat een oprichter draagt ​​twee identiek gemuteerde allelen, PCR producten zou geen T7 verteringpatroon tonen. Dergelijke onderscheid is echter altijd mogelijk wanneer een bepaalde restrictieplaats binnen de nuclease spacergebied die worden geëlimineerd door NHEJGeïnduceerde inserties / deleties (Figuur 5). Hier, onverteerd bands wijzen op de aanwezigheid van mutaties, en het ontbreken van enige verteerd producten wijst er sterk op een van de oprichters die mutaties in beide allelen van het beoogde gen (aangeduid met sterretjes in figuur 4b).

Figuur 1. Golden Gate klonen van TALEN RVDS in heterodimerische pCAG-T7-Destination vectoren. A) Montage van de RVD arrays in pfu vectoren. Hier is een voorbeeld opgenomen voor een TALEN paar met individuele VERHAAL arrays met 15 RVDS en 17 RVDS, respectievelijk (voor VERHAAL arrays langer dan 21 RVDS worden drie pfu-RVDS assemblages vereist, niet afgebeeld). Pijlen geven primers voor pfu-specifieke kolonie-PCR reacties. B) PCR-productengeamplificeerd uit juiste pfu samenstellingen vertonen doorgaans een band die overeenkomt met de gecombineerde lengte van alle RVDS gekloneerd (bijv. ongeveer 1,1 kb 10 RVDS) en een "ladder" kleinere minder duidelijke banden vanwege het repetitieve aard van RVD arrays. C) eindmontage van pfu-RVD arrays en een plasmide dat de laatste herhaling (PLR) in heterodimerische TALEN expressie vectoren met FokIELD en FokIKKR varianten, respectievelijk. De TALEN backbone (geannoteerd als N-en C) lijkt de architectuur gepubliceerd door Miller et al.. ²³ CAG (CMV vroege enhancer element / chicken beta-actine) promoter zorgt voor een hoge expressie niveaus in getransfecteerde zoogdiercellen, terwijl de faag T7-promotor kan in vitro synthese van mRNA (gebruik Sacl voor linearisatie van de vector stroomafwaarts van de nuclease STOP codon). D) Colony PCR met behulp van primers aangegeven met pijlen in C) maakt de identificatie van correct gemonteerd Talens. Full-length PCR-producten zijn vaak minder opvallend, terwijl de "ladder effect" is een robuuste indicator van succesvolle vergadering. Klik hier voor grotere afbeelding .

Figuur 2. . Kwaliteitscontrole van nuclease mRNA in vitro synthese onder toepassing van agarosegelelektroforese worden ZFN mRNA als voorbeeld weergegeven (L, links ZFN, R, rechts ZFN). Monsters L1/R1 mRNA tonen voorafgaand aan polyadenylering, monsters L2/R2 tonen gepolyadenyleerde mRNA en L3/R3 tonen gezuiverd gepolyadenyleerd mRNA. Klik hier voor grotere afbeelding .

alt = "Figuur 3" fo: content-width = "6in" fo: src = "/ files/ftp_upload/50930/50930fig3highres.jpg" src = "/ files/ftp_upload/50930/50930fig3.jpg" width = "600" />
Figuur 3. Voorbeeld van een T7 endonuclease test gebruikt voor de identificatie van de oprichter van dieren uitvoeren nuclease-geïnduceerde mutaties van de doelwitlocus. A) Een TALEN paar werd ontworpen om te splitsen in het coderende gebied van de muis prion eiwit gen (PRNP, kan TALEN doelsequentie worden verstrekt op aanvraag). Een PCR-product gegenereerd met een voorwaartse primer (F) gelegen 110 bp stroomopwaarts en een reverse primer (R) 250 bp stroomafwaarts van de TALEN splitsingsplaats. B) Het PCR-product wordt vervolgens onderworpen aan vorming en T7 endonuclease heteroduplex. C) TALEN geïnduceerde mutagenese in het beoogde genomische regio enkele stichters blijkt uit de aanwezigheid van een volledige lengte PCR product met digestieproducten van 250 en 110 bp.50930/50930fig3highres.jpg "target =" _blank "> Klik hier voor grotere afbeelding.

Figuur 4. Voorbeeld van een restrictiedigest van PCR-producten die worden gebruikt voor de identificatie van de oprichter van dieren uitvoeren nuclease-geïnduceerde mutaties van de doelwitlocus. ZFN specifiek voor de muis Rosa26 locus ²⁹ doel een Xbal restrictieplaats binnen intron 1. A) Founders werden gescreend door genotypering van PCR met behulp van een voorwaartse primer (F) op 500 bp stroomopwaarts en een reverse primer (R) 250 bp stroomafwaarts van de splitsings-plaats. B) Spijsvertering van PCR-producten met Xbal onthult digestiepatronen aangeeft muizen met bi-allele mutaties (gemarkeerd met sterretjes), mono -allele mutaties (verteerd en onverteerde bands, bijvoorbeeld dier 2)en wt muizen (volledige spijsvertering, bijv. dier 21). C) Sequencing van muizen met potentiële bi-allele wijzigingen toont tot 3 (dier 24) onderscheiden inserties / deleties. Klik hier voor grotere afbeelding .

Naam van Primer	Sequentie 5 'naar 3'
pCR8_F1	ttgatgcctggcagttccct
pCR8_R1	cgaaccgaacaggcttatgt
TAL_F1	ttggcgtcggcaaacagtgg
TAL_R2	ggcgacgaggtggtcgttgg
TAL_Seq_5-1	catcgcgcaatgcactgac

Tabel 1. Sequenties van primers die voor kolonie PCR en sequencing binnen de Golden Gate TALEN montageprotocol.

Plasmide / Collectie	Inzender	Addgene ID	Reacties
Golden Gate TALEN en TAL Effector Kit 2.0	Voytas lab	1000000024	Bevat alle plasmiden die nodig zijn voor het Golden Gate TALEN montage
pCAG-T7-TALEN -KKR/ELD bestemming vectoren	Pelczar lab	40131, 40132	Add-on plasmiden voor TALEN expressie in zoogdiercellen en in vitro mRNA-synthese

Tabel 2. Plasmiden en plasmide collecties nodig voor Golden Gate TALEN montage kan worden verkregen bij Addgene ( www.addgene.org ).

OnlineHulpbron	Reacties
http://tale-nt.cac.cornell.edu	Ontwerp van TALEN; TALEN off-target voorspelling
http://zifit.partners.org/ZiFiT/	Ontwerp van TALEN, OPEN ZFN, CoDA ZFN, CRISPR/Cas9
http://www.genome-engineering.org	Ontwerp van TALEN, CRISPR/Cas9; CRISPR/Cas9 off-target voorspelling
http://baolab.bme.gatech.edu/Research/BioinformaticTools/assembleTALSequences.html	Assemblage van TALEN sequenties voor de bevestiging van sequencing resultaten
http://pgfe.umassmed.edu/ZFPmo dularsearchV2.html	Ontwerp van modulaire opbouw ZFN
www.genomecenter.ucdavis.edu/s egallab / segallabsoftware	Ontwerp van modulaire opbouw ZFN

Tabel 3. Online bronnen voor het ontwerpen ZFN, TALEN, en CRISPR/Cas9.

Discussion

Designer-nuclease gedreven genoom bewerken benaderingen zijn aanzienlijk uitgebreid het aantal soorten vatbaar zijn voor gerichte aanpassingen van hun respectieve genomen ^10,12. Bij muizen, heeft-gen-targeting in ES-cellen een standaard techniek voor meer dan twee decennia; echter is het moeilijk aan te passen ES cellen uit andere soorten dan de muis aangetoond, hoewel er recente succes in ratten ES-cellen is. Zelfs met de beschikbaarheid van "off-the-shelf"-gen gerichte muis ES-cel klonen die door consortia, zoals EUCOMM, KOMP of NorCOMM ³ genoom uitgeven door ZFN en TALEN biedt een hogere precisie en flexibiliteit met betrekking tot het spectrum van aanpassingen die kunnen worden ingebracht in het muis genoom. Oprichter dieren dragen nuclease gemedieerde mutaties lijken sterk kiem-lijn bevoegde ^4-6,20,21, wat niet altijd het geval voor chimaera afkomstig van blastocyst injecties van ES-cellen zijn. In bepaalde gevallen micro-injectie van designer nucleases kan resulteren in aanzienlijk sneller genereren van nieuwe muis lijnen met gerichte genoom wijzigingen.

De succesvolle productie van knockout muizen door injectie van ZFN TALEN en hangt in grote mate af van de activiteit van de geïnjecteerde nuclease paar. Talens is aangetoond dat een hoog slagingspercentage hebben gericht op een groot aantal genen in verschillende organismen; Echter, recente studies suggereren dat TALEN binding gevoelig is voor cytosine methylering ^30,31. dus nieuw gegenereerde nuclease paren, bijvoorbeeld Talens gekloneerd in pCAG T7-vectoren kunnen worden transiënt getransfecteerd in een muizen cellijn zoals NIH-3T3 of Neuro -2a, die chromatine stand van de muis embryo nabootsen enigszins. Hier kunnen nucleaseactiviteit worden geschat met behulp van de T7 endonuclease assay of een restrictiedigest van PCR-product zoals beschreven in paragraaf 5 voorafgaand aan mRNA-synthese en micro-injectie. Wij raden sequencing van het genoom regio van belang in het respective cellijn en de muis stam gebruikt voor micro-injectie experimenten.

In muis zygoten zullen verschillende TALEN of ZFN paren optimaal werken bij verschillende mRNA-concentraties en bijgevolg de optimale werking concentratie van de micro-injectie nuclease mRNA wellicht proefondervindelijk worden bepaald. Afhankelijk van de nuclease pair, zal een te lage concentratie resulteren in geen decollete terwijl een te hoog kan leiden tot embryo letaliteit. Afhankelijk van de nuclease paar, hebben we succes gehad met totale concentraties zo laag als 2 ng / ul en zo hoog als 200 ug / ul mRNA. Deze effecten zijn moeilijk te voorspellen uit experimenten in celkweek en de concentratie nuclease optimaal voor zowel embryo overleving en modificatieverhouding van de doelwitlocus moet empirisch worden bepaald.

Zeer actieve ZFN of TALEN kunnen hun doelsequentie aanhangen dan de een-cel stadium van de gemicroinjecteerd embryo en dus leiden tot complexe patronen van mutagenese eend mozaïcisme in oprichters. Wij en anderen ⁴ hebben drie of meer verschillende gemuteerde allelen in een oprichter (figuur 5C) waargenomen. Dus, als de oprichting van een nieuwe muis lijn van deze oprichters, nakomelingen zorgvuldig worden gescreend door sequencing op de aanwezigheid van de gunstige mutatie sinds de spijsvertering testen leveren bewijs alleen dat een ongedefinieerde mutatie aanwezig is.

Een kritiek gehoorde tegen ZFN en TALEN systemen is de mogelijkheid dat deze nucleasen ook in staat splitsen sequenties die ergens anders in het genoom die vergelijkbaar is met de doelplaatsen zijn. Dergelijke off-target effecten zijn waargenomen met de vroege generatie reagentia met de homodimere FokI domein en heterodimer constructen werden ontworpen om off-target effecten ²⁵ verlichten. Potentiële off-target sites kunnen worden voorspeld tot op zekere hoogte in silico ^32,33 en gescreend door PCR en sequencing. Een duidelijk voordeel of behulp ZFNs en Talens voor het genereren van muizen in plaats van cellijnen is de mogelijkheid van het verwijderen van de palen mutaties gekoppelde gewenste genoom wijziging door het uitvoeren van verscheidene terugkruisingen naar een wild-type stam keuze. Voor de analyse van een groot aantal oprichter muizen volgende generatie diepe sequencing van PCR-producten gegenereerd uit de nuclease gerichte locus en in silico voorspelde off-target loci kan een alternatieve kwalitatieve en kwantitatieve uitlezing bieden om de destructie analyses van PCR-producten.

De kunstmatige voortplantingstechnieken beschreven in dit protocol zijn geoptimaliseerd voor standaard muis stammen gebruikt voor micro-injectie experimenten zoals C57BL/6J of B6D2F1. Muizen van verschillende oorsprong, zoals outbred stammen, kan in principe worden gebruikt voor het genoom bewerken benaderingen en wellicht een meer geschikte genetische achtergrond voor specifieke onderzoeksvragen te bieden. De prestaties van geassisteerde voortplantingstechnieken zoals superovulatie kan predi zijncted een aantal stammen ^34-36 maar kan verdere optimalisatie van afwijkende stammen verlangen bij een voldoende aantal embryo's te verkrijgen voor nuclease micro-injectie.

Naast ZFN en TALEN, hebben nieuwe designer nucleases zoals de RNA-begeleide CRISPR/Cas9 systeem ^9,37,38 nu ingevoerd voor genoom toepassingen voor het bewerken. Alle methodes voor micro-injectie en analyse van oprichter dieren die hier worden beschreven zijn ook van toepassing op CRISPR/Cas9 en toekomstige vormen van genoom bewerken.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
BsaI	NEB	R0535S of L
Esp3I	Thermo Scientific	ER0451
T4 Ligase	NEB	M0202S of L
Spectinomycin	Sigma	S0692-1ML
Ampicillin	Sigma	A0166
X-Gal	Sigma	B4252
IPTG	Sigma	I6758
Plasmid-Safe nuclease	Epicentre	E3101K
QIAprep Spin Miniprep Kit	Qiagen	27106
QIAGEN Plasmid Midi Kit	Qiagen	12143
QIAquick PCR Purification Kit	Qiagen	28106
mMESSAGE mMACHINE T7 Ultra Kit	Invitrogen	AM1345
NucAway Spin Columns	Invitrogen	AM10070
RNaseZAP	Sigma	R2020-250ML
NorthernMax Formaldyde Load Dye	Invitrogen	AM8552
RNA Millennium Markers	Invitrogen	AM7150
10x TBE buffer	Thermo Scientific	B52
T7 endonuclease	NEB	M0302S of L
pGEM-T EasyVector System I	Promega	A3600
SYBR Green I Nucleic Acid Gel Stain	Invitrogen	S-7563
pregnant mare's serum gonadotrophin (PMSG)	Sigma	G4877
human chorionic gonadotropin (hCG)	Sigma	CG5
M2 embryo culture medium	Sigma	M7167
M16 embryo culture medium	Sigma	M7292
Mineral oil, embryo tested	Sigma	M8410
Ketamine	CentraVet	Ket 201
Xylazine	Sigma Aldrich	46995
Equipment/Tools
Inverted microscope met Nomarski DIC-optica (bijvoorbeeld Nikon Eclipse TE200)	Nikon
Micromanipulator units (bijvoorbeeld Narishige, NT88NF)	Narishige
Embryo holding capillaries	Sutter Instruments	B100-75-10
Embryo injection capillaries	Narishige	GD-1
Capillary puller (bijvoorbeeld Sutter P97)	Sutter Instruments
Microforge (bijvoorbeeld Narishige MF-900)	Narishige
Walton skin scissors	FST	14077-10
Surgical scissors	FST	14041-10
Surgical probe	FST	10140-03
Reflex wound clip system (9 mm)	FST	12031-09
Reflex wound clips (9 mm)	FST	12032-09
Dumont fine forceps 5	FST	11254-20
Moria curved forceps	FST	11370-31
Moria fine forceps	FST	11399-80
Dietrich bulldog clamp	FST	18038-45
C57BL/6J muizen	Jackson Labs	strain code 000664
CD-1 muizen	Charles River	strain code 000664