Methodenartikel

Productie van Apolipoprotein C-III Knockout Konijnen behulp Zinc Finger Nucleasen

20.6K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/50957

⸱

18 november 2013

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Center for Advanced Models for Translational Sciences and Therapeutics, Department of Internal Medicine, University of Michigan Medical Center, 2Department of Molecular Pathology, University of Yamanashi

In dit artikel

Samenvatting

Recente ontwikkeling in gentargeting instrumenten maakt de productie van knock-out (KO) konijnen mogelijk. In het onderhavige werk, genereerden we vijf Apolipoprotein (Apo) C-III KO konijnen met behulp van Zinc Finger Nucleasen (ZFN). Dit werk heeft aangetoond dat ZFN is een zeer efficiënte methode om KO konijnen.

Samenvatting

Apolipoproteïne (Apo) C-III (apoCIII) zich op het oppervlak van plasma chylomicronen (CM), zeer lage dichtheid lipoproteïne (VLDL) en lipoproteïnen met hoge dichtheid (HDL). Het is bekend dat hoge niveaus van plasma apoCIII constitutea risicofactor voor cardiovasculaire ziekten (CVD). Verhoogde plasma apoCIII niveau vaak correleert met insulineresistentie, obesitas en hypertriglyceridemie. Onschatbare kennis over de rol van ApoCIIIin lipide metabolisme en CVD is verkregen van transgene muismodellen zoals apoCIII knockout (KO) muizen, maar wordt opgemerkt dat het metabolisme van lipoproteïne bij muizen verschilt van die van mensen in vele aspecten. Het is niet bekend tot nu of verhoogde plasma apoCIII is direct atherogene. We werkten aan apoCIII KO konijnen ontwikkelen in de huidige studie op basis van de hypothese dat konijnen kan dienen als een reasonablemodelfor studie van de menselijke vetmetabolisme en atherosclerose. Zinkvinger nuclease (ZFN) sets targeting konijn ApoCIIIgene werden onderworpen aan in vitro validatie vóór embryo micro-injectie. Het mRNA werd geïnjecteerd om het cytoplasma van 35 konijn pronucleaire stadium embryo's, en evalueerden de mutatie tarieven bij de blastocyst staat. Zestien blastocysten die werden getest, een bevredigende 50% mutaties (8/16) en het richten plaats werd bereikt, die het gebruik van set 1 in vivo experimenten. Vervolgens hebben we gemicroinjecteerd 145 embryo's met Set 1 mRNA, en overgebracht deze embryo's tot 7 ontvanger konijnen. Na 30 dagen dracht, werden 21 kits geboren, waarvan er vijf werden bevestigd als apoCIII KO konijnen na PCR sequencing assays. De KO dier tarief (# KO kits / totaal geboren) was 23,8%. De totale productie-efficiëntie is 3,4% (5 kits/145 embryo's). De huidige werk aangetoond dat ZFN is een zeer efficiënte methode om KO konijnen. Deze apoCIII KO konijnen zijn nieuwe middelen om de rollen van apoCIII studeren in lipide stofwisseling.

Inleiding

Apolipoproteïne (Apo) C-III (apoCIII) is een kleine O-geglycosyleerde secretorische eiwit dat voornamelijk wordt gesynthetiseerd in de lever en de darmen. Het bevindt zich op het oppervlak van plasma chylomicronen (CM), zeer lage dichtheid lipoproteïne (VLDL) en lipoproteïnen met hoge dichtheid (HDL). ApoCIII is erkend als een risicofactor voor cardiovasculaire ziekte 1. Patiënten met een erfelijke deficiëntie van apoCIII hebben lage plasma triglyceride (TG) en een dalende subklinische coronaire atherosclerose 2,3. Verhoogde plasma apoCIII niveau, anderzijds vaak correleert met insulineresistentie, obesitas en hypertriglyceridemie (HTG) 4,5.

Knockout (KO) is een krachtig middel om de functie van een gen te bestuderen. In overeenstemming met de waarnemingen in menselijke populaties mutant, knockout van de apoCIII gen in muizen leidde tot een verlaging van plasma TG en bescherming tegen postprandiale HTG 6. Dergelijke positieve rol van apoCIII verschenenonafhankelijk te zijn van Apolipoprotein E (ApoE), zoals muizen die een tekort van zowel ApoE en apoCIII ook worden beschermd tegen postprandiale hyperlipidemie 7. Hoewel deze apoCIII KO muizen waardevolle informatie heeft verstrekt over de mogelijke functies van apoCIII bij de mens, wordt opgemerkt dat het metabolisme van lipoproteïne van muizen verschilt van die van mensen in vele aspecten. Bijvoorbeeld, muis ontbreekt plasma cholesteryl ester transfer proteïne (CETP), een belangrijke enzym betrokken bij het ​​transport van VLDL, LDL en HDL 8. Daarom moet een geschikt diermodel ontwikkeld met als doel de fysiologische rol van apoCIII in vivo.

Het konijn is een klassieke model diersoorten 9-11. Het heeft een korte dracht (30-31 dagen), grote worpgrootte (4-12/litter) en kan gemakkelijk worden ondergebracht in een indoor faciliteit. In vergelijking met muizen, konijnen fylogenetisch dichter bij de mens 10. Belangrijk is, zoals human, maar in tegenstelling tot muizen, konijnen zijn LDL-rijk zoogdieren en hebben aanzienlijke niveaus van CETP 10,12. Bovendien zijn ze gevoelig voor cholesterol-rijk dieet geïnduceerde atherosclerose de laesies gelijk aan die in menselijke atherosclerose 13. Daarom veronderstelden we dat apoCIII KO konijnen kan dienen als een beter model dan hun tegenhangers muis om de rol van ApoCIIIplay vetmetabolisme en atherosclerose bij mensen te onderzoeken.

Productie van gen gerichte transgene (GTT) konijnen is een uitdaging. Dit is voornamelijk te wijten aan het ontbreken van kiembaan verzenden van embryonale stamcellen (ESC) en de extreem lage rendement van somatische celkernen (SCNT) bij konijnen. ESC is het belangrijkste instrument om GTT muizen te genereren, terwijl en SCNT is met succes toegepast op KO dieren te genereren in soorten ontbreekt germline verzenden van SER's, met inbegrip van varkens, schapen en runderen, maar niet konijnen. Onlangs Zinc Finger Nuclease (ZFN), Transchrijving Activator-Like Effector Nuclease (TALEN) 14, en RNA Guided Endonuclease (RGEN) 15 ontpopt als krachtig middel voor het genoom bewerken. Deze nucleasen, zogenaamde "moleculaire scharen", zijn efficiënt in het genereren van dubbelstrengs breuken (DSB) in het genoom die kan leiden tot een functioneel KO van het doelgen of worden gebruikt om een ​​DNA sequentie te integreren op een specifieke locus in het genoom een aantal soorten 16. In 2011, een van de eerste aanpassing van de ZFN technologie genereerden wij peroxisoomproliferator-activated receptor gamma (PPARy) KO varkens cellen via deze aanpak en met succes gegenereerd PPARy KO varkens na het gebruik van deze cellen voor SCNT 17. In hetzelfde jaar, efficiënte immunoglobuline gendisruptie en gerichte vervanging bij konijnen ook met behulp ZFN werd gemeld 18.

In deze studie werden vijf apoCIII KO konijnen gegenereerd zoals bevestigd door PCR sequencing, met ZFN Set 1 (zie figuur 1 . voor stroomschema illustratie). Deze dieren zijn nieuwe middelen om de rollen van apoCIII studeren in lipide stofwisseling.

Protocol

Alle onderhoud dier, zorg en het gebruik procedures werden beoordeeld en door de Universitaire Commissie goedgekeurd op het gebruik en onderhoud van Dieren van de Universiteit van Michigan.

1. ZFN Ontwerp en Selectie

  1. Voorzie de genomische sequentie-informatie van het gen van belang (bijvoorbeeld konijn apoCIII) aan de fabrikant. Selecteer ZFN set (s) voor de experimenten op basis van de ZFN scores.

2. Konijn Embryo Collection

  1. Superovuleren seksueel volwassen (6-18) New Zealand White (NZW) vrouwelijke konijnen door subcutane (sc) injectie van FSH tweemaal / dag met een dosering van 3 mg voor de eerste twee injecties, 5 mg gedurende de volgende twee injecties en 6 mg voor de laatste twee injecties.
  2. Dien een enkele intraveneuze (iv) injectie van 200 IE hCG op 72 uur na de eerste injectie FSH om ovulatie te induceren. Mate de gesuperovuleerde vrouwen met een mannelijk konijn onmiddellijk na de hCG-injectie.
  3. EuthaniZE de gesuperovuleerde donor konijnen met natrium pentobarbital (150 mg / kg, iv) op 16-18 uur na inseminatie (psi).
  4. Herstellen van de eileider ampullen door zorgvuldig verzamelen van de hele eileiders en eierstokken structuur.
  5. Spoel elke eileider met 10 ml medium manipulatie HEPES gebufferde TCM 199 aangevuld met 10% foetaal runderserum, door het injecteren van het medium uit de baarmoeder uiteinde van de eileider. Verzamel de gespoelde medium bij de eierstok-eindopening van de eileider een petrischaal.
  6. Observeer en identificeren teruggewonnen embryo's in het medium gespoeld, was de embryo driemaal de manipulatie medium bewaar ze manipuleren medium bij 38,5 ° C in lucht, en neem ze onder een stereomicroscoop voor het optreden van bevruchting. Bereid je voor micro-injectie op pronucleaire podium embryo 19-21 h psi

3. Bereiding van mRNA ZFN

  1. Zuiver het resulterende mRNA voordat hersuspensie in RNAse-vrij 0.1X TE (1 mM Tris-Cl pH8,0, 0,1 mM EDTA). Meet de concentratie en bewaar het mRNA bij -80 ° C tot gebruik.
  2. Bereid de mRNAs coderend ZFN paar (4-10 ng / ul in 1 mMTris-Cl, 0,1 mM EDTA bij pH 7,5), 10 pi aliquot in flesjes. Bewaar ze bij -80 º C tot klaar voor gebruik. Voordat micro-injectie, ontdooien de RNA flacon (s), en houd het op ijs.

4. Embryo Microinjection

  1. Bereid de micro-injectie platform door het plaatsen van een 5 ul druppel manipulatie medium op een 1-well kamer dia waarop de media kamer verwijderd heeft. Bedek het medium druppel met minerale olie en leg ze op de verwarmde microscoop podium.
  2. Plaats die pipet (120 micrometer diameter) in de houder arm van de micromanipulator en plaats het in de daling van manipulatie medium.
  3. Fabriceren injectie micropipetten door verhitting en trekken borosilicaatglas capillaire buizen in een micropipet trekker apparaat. Plaats het mRNA te injecteren in de injectiepipet.
  4. Schakel de persluchttoevoer die aangesloten is op een microinjector.
  5. Plaats injectie pipet in de injectie houder, zet het op de micromanipulator en plaats deze in de daling van manipulatie medium.
  6. Stel de microinjector met de volgende voorgestelde parameters: holdP = 2 psi, InjP = 20 psi, ClearP = 60 psi, Injtime = 1 seconde, wat resulteert in een injectievolume van 1-5 pl.
  7. Open de punt van de injectie pipet door zachtjes tikken tegen het bedrijf pipet.
  8. Transfer embryo (30-50) naar de micromanipulatie druppel op het platform. Gebruik het bedrijf pipet om een ​​embryo lijnt de injectienaald, embryo en het aandelenbezit pipet langs de x-as.
  9. Onder 400X vergroting, vooraf de injectie pipet door het embryo. Wees voorzichtig om de kern te voorkomen. Zodra het plasmamembraan wordt doorboord, drukt voetpedaal te injecteren. Na injectie, trekken de naald, laat het embryo. Herhaal dit proces voor alle overige embryos.
  10. Was geïnjecteerde embryo driemaal embryo kweekmedium, bestaande uit Earle's Balanced Salt Solution (EBSS), aangevuld met essentiële aminozuren (NEAA), essentiële aminozuren (EAA), 1 mM L-glutamine, 0,4 mM natriumpyruvaat en 10% FBS.
  11. Incubeer embryo bij 38,5 ° C in 5% CO2 in lucht gedurende 1-2 uur voordat ze chirurgisch overgebracht naar de eileiders van een gesynchroniseerde ontvangende vrouwelijke NZW konijnen (zie stap 5.1). Als alternatief, de cultuur van de embryo's tot ze blastocyststadium bereiken voordat ze worden gebruikt voor in vitro validatie of assays.

5. Embryo Transfer

  1. Selecteer een vrouwelijke NZW konijn 5-12 maanden oud, in goede gezondheid, met een gewicht van ca.. 4,0-5,0 kg als ontvanger dier. Dien Gonadotropin Releasing Hormone (GnRH) injectie intramusculair (im, 50 mcg / ml, 0,3 ml / dier) aan de ontvanger op hetzelfde tijdstip met die van hCG injectie aan het donordier (en) (zie stap 2.2).
  2. Na voltooiing van micro-injectie, bereiden de ontvanger konijn voor embryotransplantatie (normaal 16-24 uur na GnRH-injectie). Verdoven van het konijn met 10-40 mg / kg ketamine (im), en / of verdampte isofluraan (2-4%) bij inademing. Bescherm de ogen van het konijn uitdrogen door de toepassing van een steriele oogzalf. Observeer het dier totdat het volledig onbewust, dwz. reageert niet op pedaal reflexen, knijpen de voet pad wordt gebruikt om te controleren bij gebrek aan pedaal reflex die een indicatie van geschikte anesthesie.
  3. Scheer de buik van het konijn, wassen met een antiseptische scrub, gevolgd door antiseptische oplossing, en veeg het geschoren gebied met een steriel gaasje sponzen.
  4. Voer operatie onder steriele omstandigheden opnemen vitale functies van de ontvanger konijn ongeveer elke 15 minuten gedurende de operatie.
  5. Overdracht 10-25 embryo een ontvanger dier, afhankelijk van het beschikbare aantal embryo.
  6. Aan het einde van dechirurgische procedures, sluit de spierlaag met gecoate absorbeerbare hechtdraad. Hecht de huid met ofwel een subcuticulaire hechtdraad behulp absorbeerbare hechtdraad of met eenvoudige onderbroken huid hechtingen gebruik nonabsorable hechtdraad (bijv. monofilament nylon of iets dergelijks).
  7. Houd het dier warm en bewaken totdat zijn borstligging wordt bereikt.
  8. Monitor het dier dagelijks. Volg de instructies dierenarts voor de verzorging van het dier. Pijnstiller injecteren (sc 1,0 mg / kg) om pijn te verlichten en / of te verminderen koorts dagelijks na de operatie als door de dierenarts noodzakelijk bepaald.
  9. Verwijder nonabsorable huid hechtingen op ongeveer 10-14 dagen na de operatie.

6. Detectie van ZFN Induced genverstoring

  1. Voor in vitro validatie uitvoeren genotypering op de in vitro gekweekte embryo's. Lyse individuele embryo's die ontwikkeld morula / blastocyst Stadium 5 pl NP40 oplossing (1% NP40 plus 1 ug / ml proteïnase K in Taq Buffer) Gedurende 0,5-1 uur bij 55 ° C en 10 min bij 95 ° C.
  2. Voor genotypering van de nakomelingen, het verzamelen van oor huid monsters van pasgeboren kits, extract genomische DNA, en ze gebruiken als voor de PCR sequencing. Solliciteer Kwik-Stop om de bemonstering gebied na inzameling te stoppen met bloeden en ongemak te verminderen.
  3. Gebruik de lysis van stap 6.2 of 6.3 als matrijs voor PCR met LA-Taq en PCR-primerpaar, die stroomopwaarts zijn gelegen (5'-TGAGGCCGGGAAGGGAGCAGTCG-3 ') en stroomafwaarts (5'-GCCAGGCCCACCCACGGAACAGC-3') van de ZFN doelplaats .
  4. Zuiver PCR producten en sequentie hen sequencing primer (5'-TCTGCACGCTTGGGGCTGGAG-3 ').
  5. Identificeer mutant monsters door te zoeken naar dubbele bocht in de sequence diagram rond de targeting terrein. Label de degenen met dubbele bochten als "positief".
  6. Kloon de "positieve" PCR-producten in TA kloneervector, pick-up 10-20 klonen, volgorde van de inserts, en bevestig de mutaties rond de targeting website.

Resultaten

In vitro validatie van ZFN paren
Zestien ZFN paren werden aanvankelijk ontworpen. De gerichte verstoring opeenvolging van Set 1 is gelegen op Exon 2 van konijn apoCIII (Figuur 2A). Drie paren (Set 1, 2 en 3, figuur 2A) werden geselecteerd en onderworpen aan de gist MEL-1 reporter assay de ZFN activiteiten (figuur 2B) bepalen. Set 1 heeft een ZFN score van 224,2%, hoger dan die van Set 2 (196,9%) en Set 3 (177,8%) en veel hoger dan de selectie drempel (dwz 50% van de interne positieve controle). Daarom Set 1 werd geselecteerd voor in vitro validatie experimenten.

Een bijzondere set moet resulteren in een positieve tarieven in de embryo's van 10% of hoger om de embryo's in vitro validatie, op basis van de interne validatie criteria passeren. De mRNA (5 ug / ml) Set 1 werd gemicroinjecteerd het cytoplasma van 35 pronucleaire fase konijn embryo (Figuur 3A </ Strong>). Gespoeld embryo zonder microinjectie behandeling (n = 31) werden gebruikt als controlegroep. Achttien embryo's van micro-injectie groep ontwikkelde BL stadium D5, waarvan zestien werden gesequentieerd en acht (BL # apoc-3, 4, 5, 7, 11, 13, 15, 17, figuur 3B, rood onderstreept) weergegeven gemuteerd sequenties aan de targeting website (black-boxed, Figuur 2B, bovenste rij, apoC3wt.seq). Het BL snelheid van de micro-injectie groep (51,4%) is lager dan die van de controlegroep (77,4%), wat aangeeft enigszins verminderde ontwikkelingsstoornissen van microgeïnjecteerde embryo. De positieve mutatie snelheid van de micro-injectie embryo 50,0% (8/16), veel hoger dan het geselecteerde drempel (10%). Deze resultaten bleek dat Set 1 is een effectieve ZFN set om mutaties op de targeting plaats van konijn apoCIII. Daarom Set 1 werd gekozen voor in vivo productie van apoCIII KO konijnen.

Productie van apoCIII KO konijnen
Het mRNA of ZFN Set 1 werd gemicroinjecteerd naar het cytoplasma van konijn pronucleaire embryo's, en overgebracht 145 gemicroinjecteerd embryo tot 7 pseudo-zwangere ontvanger konijnen (Figuur 4A). Vers gespoeld embryo's (n = 75) zonder ZFN microinjectie werden doorgegeven aan ontvangers (n = 6) als controlegroep. Na 30 dagen van de dracht werden 21 kits geboren in de gemicroinjecteerd groep. PCR sequencing identificeerde vijf (apoC3-R1, R9, R11, R12 en R16) als positief KO kits (Figuur 4B). De term tarief berekend als totale looptijd kits / totaal embryo's is 14,5% (21/145), terwijl het tarief is 29,3% (22/75) in de controlegroep. De KO tarief berekend als totaal KO kits / totale looptijd is 23,8% (5/21). Een KO kit (apoC-R16) stierf vijf dagen postpartum (20,0%, 1/5). De indelsat de targeting site zijn twee toevoegingen en drie deleties, ze areΔ1, 1, 1, Δ20 en Δ21, voor Konijnen # R1, R9, R11, R12 en R16, respectievelijk (Figuur 4B).

Bioinformatics analyse werd gebruikt om potentiële ZFN identificeren off-targets met 7 of minder mismatches instellen 1 sequentie, zoals eerder 17 beschreven. Slechts een voorspelde mogelijke off-target-site, gelegen op chromosoom 14, werd geïdentificeerd met 7 mismatch bps. PCR-test gedetecteerd geen off-target gebeurtenissen in een van de oprichter dieren.

Discussie

In het onderhavige werk, werden vijf apoCIII KO konijnen gegenereerd met behulp van de ZFN technologie. Voorheen het enige rapport van de productie van GTT konijnen ook de ZFN technologie 18. De huidige werk bevestigde dat ZFN nuttig is om effectief te richten genen in konijnen.

In deze studie, de transgene tarief (positieve kits / totaal geboren) is23.8% (5/21), die vergelijkbaar is met die van het vorige verslag ZFN bij konijnen (30,8%, 16/52) 18 en die gerapporteerd van het gebruik van ZFN bij andere diersoorten, waaronder zebravis 19, 20 muizen, ratten 21 en varkens 17. Dit percentage is zelfs hoger dan de percentages veel conventionele transgene konijnen productie studies, die normaal vallen in het traject van 5-20%. Bijvoorbeeld, in een poging om het product apoCIII transgene konijnen via conventionele DNA micro-injectie, Ding et al.. Verkregen 3 positieve oprichters van de 54 pups geboren (5,6%) 22.

In overeenstemming met eerdere bevindingen, de mutaties op de targeting sites zijn variabel, zoals deleties of inserties bestaande verschillend aantal basen (variërend 1-21 in vijf konijnen KO). Op basis van de specifieke sequentie informatie van de grondlegger dieren wordt voorspeld dat tenminste vier (dwz. Die met Δ1, 1, 1, of Δ20 mutaties) functieverlies van apoCIII hebben. Animal R-16 met Δ21 niet functieverlies weergegeven, aangezien deze mutatie is voorspeld enige oorzaak verlies van zeven aminozuren, maar geen leesraam verschuiving. Uiteindelijk fenotype assays worden nagegaan of deze grondlegger dieren werkelijk verlies van apoCIII functies weer.

Geen van de vijf KO konijnen opgewekt in de huidige studie bevatten biallelisch wijzigingen. Interessant is ook het geval in het vorige ZFN konijn verslag. Wanneer daarentegen ZFNs gericht α1 ,3-galactosyltransferase werden op varkenscellen, de frequentie gericht op een allel varieerde 7-46%, met ongeveer een derde van mutaties creëren eenstaps biallele knockouts 23. Consistent hiermee bij TALEN werd toegepast op varkens fibroblastcellen, de biallele wijzigingen werden gevonden bij ongeveer 15-40% van de totale positieve klonen 14. Het is mogelijk dat het niet biallele KO konijnen genereren in deze studie species (verschil konijnen versus varkens) voor deze capaciteit van nuclease genexpressie targeting vermeldt. Het is echter meer waarschijnlijk dat dit is gewoon omdat het aantal KO konijnen gegenereerd in dit project is relatief klein. Wij geloven dat ZFN kan genereren bialleic mutaties in konijnen, die moet worden beschouwd als een ander potentieel voordeel van ZFN gebaseerd GTT konijnenproductie. Verdere experimenten nodig om deze capaciteit van ZFN bij konijnen bevestigen.

Kortom, de huidige werk toont aan dat ZFN gebaseerd gene targeting aanpak effectief is in het produceren van KO konijnen. In het bijzonder, we gegenereerd vijf apoCIII KO konijnen met een bevredigend transgene tarief van 23,8%. Deze dieren worden beschouwd als meer betekenisvolle informatie over de rol van lipide metabolisme bij mensen deze eiwitten dan de overeenkomstige muismodellen geven. Wij voorspellen ZFN gebaseerde gen targeting, evenals andere nuclease gebaseerde technologieën zoals TALEN en RGEN in nonmurine dieren aanzienlijk de ontwikkeling van nieuwe diermodellen voor diverse menselijke ziekten te bestuderen vergemakkelijken.

figure-discussion-1
Figuur 1. Stroomschema van de productie van knock-out konijnen met behulp ZFN technologie. Productie van KO konijnen middels ZFN techniek begint met de selectie van het gen van belang. De sequentie-informatie wordt verstrekt, ZFN sets zijn ontworpen, en subjected om op basis van gist validatie. Bij de check point (CP) 1 (CP-1), alleen die sets voorbij interne validatie (50% of meer van de interne positieve controle) zal worden aan de gebruikers voor selectie aangeboden. Als er geen sets voorbij CP-1, kunnen aanvullende volgorde nodig zijn voor het ontwerpen van effectieve ZFN sets. Een embryo's in vitro validatie wordt gevolgd om ervoor te zorgen de geselecteerde ZFN set kan mutaties veroorzaken op geselecteerde sites (CP-2). ZFN set (s) zal alleen gebruikt worden als het passeert CP-2 (> = 10% mutatie prijzen in embryo's in vitro). Mislukking op CP-2 zal een herontwerp van de ZFN sets nodig. Embryo donoren zullen worden voorbereid en pronucleaire stadium embryo wordt gemicroinjecteerd met de gevalideerde ZFN sets. Deze gemicroinjecteerd embryo's zullen worden overgedragen aan gesynchroniseerd embryo ontvangers. Na een maand draagtijd wordt pasgeborenen genotyperen (CP-3). Als geen van de pasgeborenen positief zijn, zal extra micro-injectie worden uitgevoerd. Het duurt 2-3 maanden na aanvang van het project tot CP-2, uitgaande van no falen tijdens het proces. Het duurt nog 2-3 maanden van CP-2 naar CP-3. Daarom is het mogelijk om een knock-out konijn in een 4-6 maanden tijd met behulp van de ZFN technologie genereren. Klik hier voor grotere afbeelding .

figure-discussion-2
Figuur 2. ZFN ontwerp. Drie ZFN sets (Set 1, 2, en 3) werden ontworpen gericht is op verschillende sequenties op Exon 1 of Exon 2 van konijn apoCIII (A). Alle drie sets werden onderworpen aan de gist MEL-1 reporter assay de ZFN activiteiten te bepalen. Volgens protocollen van de fabrikant worden ZFNs dat> 50% van de activiteiten die van de interne positieve controle voor de vervaardiging tonen geacht bruikbaar voor in vitro en in vivo experimenten genoom bewerken.De ZFN activiteiten waren 224,2% voor Set 1, 196,9% voor Set 2 en 177,8% voor Set 3 (B), dus Set 1 werd geselecteerd in de huidige studie. Klik hier voor grotere afbeelding .

figure-discussion-3
Figuur 3. Embryo's in vitro validatie van ZFN. De mRNA (5 ug / ml) Set 1 werd gemicroinjecteerd het cytoplasma van 35 pronucleaire fase konijn embryo (A). Gespoeld embryo zonder microinjectie behandeling (n = 31) werden gebruikt als controlegroep. Het BL ontwikkeling bedroeg 77,4% in de controlegroep. In de gemicroinjecteerd groep, de BL bedroeg 51,4%. Van 16 BLs onderworpen aan PCR sequencing, 8 (50%) werden geïdentificeerd als positief, wat aangeeft Set 1 is een effectieve ZFN set om mutaties op de targeting plaats (B, apoc3wt.seq, zwart-boxed) van apoCIII bij konijnen. De BLs bevattende mutaties BL # apoc-3, 4, 5, 7, 11, 13, 15, en 17 (B, rood onderstreept). De resterende BLs (# apoc-2, 6, 9, 10, 12, 14 en 16) hebben geen mutaties op de targeting website. Klik hier voor grotere afbeelding .

figure-discussion-4
Figuur 4. Productie van apoCIII KO konijnen. Honderd en vijfenveertig embryo gemicroinjecteerd met ZFN Set 1 mRNA's werden overgebracht naar 7 pseudo-zwangere konijnen ontvanger (A). Vers gespoeld embryo's (n = 75) zonder ZFN microinjectie werden doorgegeven aan ontvangers (n = 6) als controlegroep. De term tarief berekend als totale looptijd kits / totaal embryo experiment groep 140,5% (21/145), terwijl het tarief is 29,3% (22/75) in de controlegroep (A). Van de 21 kits geboren in de gemicroinjecteerd groep, vijf (R1, R9, R11, R12 en R16) werden geïdentificeerd als positief KO kits na PCR sequencing (B). De INDELs bij de targeting site zijn twee inserties (1 voor zowel R9 en R11) en drie deleties (Δ1, Δ 20 Δ 21 voor R1, R12 en R16, respectievelijk). Klik hier voor grotere afbeelding .

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit werk werd deels gefinancierd door subsidies van de National Institutes of Health (HL105114, HL088391, NS066652 en HL068878 te YEC), de American Heart Association (Nationale Scientist Development 0835237N om JZ). YEC wordt financieel ondersteund als begiftigd Frederick Huetwell hoogleraar Cardiovasculaire Geneeskunde aan de Universiteit van Michigan Medical Center (UMMC). Dit werk gebruikt Core Services ondersteund door Center for Advanced Models for Translational Sciences and Therapeutics (CAMTraST) bij UMMC.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
APOC3-ZFNSigma AldrichCSTZFNY-1KTDoelgen: APOC3, Lotnummer: 12201118MN
mMESSAGE kitInvitrogenAM1344MmRNA-synthese
MEGAclear Kit InvitrogenAM1908MmRNA-zuivering
Follikelstimulerend hormoonBioniche Life SciencesFolltropin-VBehandelen van embryodonorkonijnen
Humaan choriongonadotrofineIntervetChorulonBehandelen van embryodonorkonijnen
Gonadotropin-releasing hormoonProspecbioHOR-255Behandelen van embryoreceptorkonijnen
Earle's Balanced Salt Solution (EBSS) Thermo Fisher ScientificSH30029.02Embryocultuur, basismedium
MEM (niet-essentiële aminozuren)Sigma AldrichM7145Embryocultuur, supplementen
BME AMINO ZUREN oplossingSigma AldrichB6766Embryocultuur, supplementen
GlutamineGibco25030-149Embryocultuur, supplementen
Natriumpyruvaat Gibco11360-070Embryocultuur, supplementen
Foetaal bovien serumSigma Aldrich12003CEmbryocultuur, supplementen
HEPES gebufferd TCM 199 Gibco12350039Embryo manipulatiemedium
IncubatorEppendorfGalaxy 170Embryocultuurapparatuur
Micromanipulator EppendorfTransferMan NK 2Embryo manipulatieapparatuur
Micropipet pullerSutter Instruments Inc.P-1000Embryo manipulatieapparatuur
Microinjector Tritech ResearchMINJ-DEmbryo manipulatieapparatuur
Borosilicaat glas capillaire buizen World Precision Instruments, Inc.TW100F-6Embryo manipulatievoorraad
Euthasol (pentobarbital natrium)Virbac AH, Inc.ANADA#200-071Euthanisatie van embryodonorkonijnen

Referenties

  1. Ooi, E. M., Barrett, P. H., Chan, D. C., Watts, G. F. Apolipoprotein C-III: understanding an emerging cardiovascular risk factor. Clinical Science. 114, 611-624 (2008).
  2. Pollin, T. I., et al. A null mutation in human APOC3 confers a favorable plasma lipid profile and apparent cardioprotection. Science. 322, 1702-1705 (2008).
  3. Ginsberg, H. N., et al. Apolipoprotein B metabolism in subjects with deficiency of apolipoproteins CIII and AI. Evidence that apolipoprotein CIII inhibits catabolism of triglyceride-rich lipoproteins by lipoprotein lipase in vivo. The Journal of Clinical Investigation. 78, 1287-1295 (1986).
  4. Cohn, J. S., et al. Increased apoC-III production is a characteristic feature of patients with hypertriglyceridemia. Atherosclerosis. 177, 137-145 (2004).
  5. Cohn, J. S., Patterson, B. W., Uffelman, K. D., Davignon, J., Steiner, G. Rate of production of plasma and very-low-density lipoprotein (VLDL) apolipoprotein C-III is strongly related to the concentration and level of production of VLDL triglyceride in male subjects with different body weights and levels of insulin sensitivity. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 89, 3949-3955 (2004).
  6. Maeda, N., et al. Targeted disruption of the apolipoprotein C-III gene in mice results in hypotriglyceridemia and protection from postprandial hypertriglyceridemia. The Journal of Biological Chemistry. 269, 23610-23616 (1994).
  7. Jong, M. C., et al. Apolipoprotein C-III deficiency accelerates triglyceride hydrolysis by lipoprotein lipase in wild-type and apoE knockout mice. Journal of Lipid Research. 42, 1578-1585 (2001).
  8. James, J. F., Hewett, T. E., Robbins, J. Cardiac physiology in transgenic mice. Circ. Res. 82, 407-415 (1998).
  9. Duranthon, V., et al. On the emerging role of rabbit as human disease model and the instrumental role of novel transgenic tools. Transgenic Research. 21, 699-713 (2012).
  10. Fan, J., Watanabe, T. Transgenic rabbits as therapeutic protein bioreactors and human disease models. Pharmacol. Ther. 99, 261-282 (2003).
  11. Shiomi, M., Ito, T. The Watanabe heritable hyperlipidemic (WHHL) rabbit, its characteristics and history of development: a tribute to the late Dr. Yoshio Watanabe. Atherosclerosis. 207, 1-7 (2009).
  12. Morehouse, L. A., et al. Inhibition of CETP activity by torcetrapib reduces susceptibility to diet-induced atherosclerosis in New Zealand White rabbits. Journal of Lipid Research. 48, 1263-1272 (2007).
  13. Getz, G. S., Reardon, C. A. Animal models of atherosclerosis. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 32, 1104-1115 (2012).
  14. Carlson, D. F., et al. Efficient TALEN-mediated gene knockout in livestock. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2012).
  15. Jiang, W., Bikard, D., Cox, D., Zhang, F., Marraffini, L. A. RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISPR-Cas systems. Nature Biotechnology. 31, 233-239 (2013).
  16. Petersen, B. Update on 'molecular scissors' for transgenic farm animal production. Reproduction, Fertility, and Development. 25, 317-318 (2012).
  17. Yang, D., et al. Generation of PPARgamma mono-allelic knockout pigs via zinc-finger nucleases and nuclear transfer cloning. Cell Research. 21, 979-982 (1038).
  18. Flisikowska, T., et al. Efficient immunoglobulin gene disruption and targeted replacement in rabbit using zinc finger nucleases. PLoS ONE. 6, e21045(2011).
  19. Foley, J. E., et al. Targeted mutagenesis in zebrafish using customized zinc-finger nucleases. Nature Protocols. 4, 1855-1867 (2009).
  20. Carbery, I. D., et al. Targeted genome modification in mice using zinc-finger nucleases. Genetics. 186, 451-459 (2010).
  21. Mashimo, T., et al. Generation of knockout rats with X-linked severe combined immunodeficiency (X-SCID) using zinc-finger nucleases. PLoS ONE. 5, e8870(2010).
  22. Ding, Y., et al. Hypertriglyceridemia and delayed clearance of fat load in transgenic rabbits expressing human apolipoprotein CIII. Transgenic Research. 20, 867-875 (2011).
  23. Hauschild, J., et al. Efficient generation of a biallelic knockout in pigs using zinc-finger nucleases. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 12013-12017 (2011).

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

ApoCIII knockoutkonijnenembryo microinjectieembryo s in het pronucleusstadiumgene targetingZFN mRNA injectiemutatiesnelheid van blastocystenPCR sequencing assaysoverdracht naar recipientkonijnknockout dierpercentage
Productie van Apolipoprotein C-III Knockout Konijnen behulp Zinc Finger Nucleasen
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.