Productie van RNA voor transcriptomische analyse van muis ruggenmerg motor neuron cellichamen door laser capture microdissection

Samenvatting

Hoogwaardige totale RNA is bereid uit cellichamen van muis ruggenmerg motorneuronen door laser capture microdissection na het kleuren van ruggenmerg secties met Azure B in 70% ethanol. Voldoende RNA (~40-60 ng) wordt teruggewonnen uit 3.000-4.000 motorneuronen om downstream RNA-analyse door RNA-seq en qRT-PCR mogelijk te maken.

Samenvatting

De bereiding van hoogwaardig RNA uit cellen van belang is van cruciaal belang voor een nauwkeurige en zinvolle analyse van transcriptieverschillen tussen celtypen of tussen hetzelfde celtype in gezondheid en ziekte of na farmacologische behandelingen. In het ruggenmerg wordt een dergelijk preparaat van motorneuronen, het doelwit van interesse in veel neurologische en neurodegeneratieve ziekten, gecompliceerd door het feit dat motorneuronen <10% van de totale celpopulatie vertegenwoordigen. Laser capture microdissection (LMD) is ontwikkeld om dit probleem aan te pakken. Hier beschrijven we een protocol om het ruggenmerg van de muis snel te herstellen, te bevriezen en door te stoten om RNA-schade door endogene en exogene RNases te voorkomen, gevolgd door kleuring met Azure B in 70% ethanol om de motorneuronen te identificeren terwijl endogene RNase wordt geremd. LMD wordt vervolgens gebruikt om de bevlekte neuronen rechtstreeks in de guanidine thiocyanaatlysebuffer vast te leggen, waardoor de RNA-integriteit behouden blijft. Standaardtechnieken worden gebruikt om het totale RNA terug te winnen en de integriteit ervan te meten. Dit materiaal kan vervolgens worden gebruikt voor downstream analyse van de transcripties door RNA-seq en qRT-PCR.

Inleiding

In zoogdierweefsels die uit meerdere verschillende celtypen bestaan, heeft de komst van laser capture microdissection (LMD) instrumentatie de mogelijkheid geboden om een specifiek celtype te selecteren voor analyse op RNA- of eiwitniveau. Op dit moment maken versterkings- en next-gen sequencingtechnieken het gebruik van een pool van totaal RNA uit een paar duizend cellen mogelijk om een relatief grondige inventaris van het transcriptoom te verkrijgen, inclusief beoordeling van relatieve niveaus van RNA's en identificatie van verschillende gesplitste vormen. Tot op heden zullen proteomics-analyses van een paar duizend cellen door alleen meer overvloedige soorten reiken. We hebben bijvoorbeeld < 1.000 van de meest voorkomende eiwitten uit 3.000-4.000 motorneuroncellichamen geïdentificeerd (niet weergegeven), en Zhu en collega's hebben onlangs gemeld dat ze 2.665 eiwitten uit ~ 15.000 tumorcellen hebben geïdentificeerd¹. Met verdere ontwikkelingen van massaspectrometrie is het echter waarschijnlijk dat dergelijke analyses zich tot veel grotere diepte zullen uitstrekken.

Hier presenteren we een specifiek protocol dat wordt gebruikt voor LMD van motorneuroncellichamen uit het ruggenmerg van muizen, gevolgd door de voorbereiding van RNA. Dit protocol werd gebruikt in de context van het vergelijken van RNA's van motorneuronen van presymptomatische transgene mutante superoxide dismutase (SOD)1 amyotrofische laterale sclerose (ALS) muizen met RNA's bereid uit een wilde SOD1 transgene stam door zowel RNA-seq als qRT-PCR validatie². Met name motorneuronen, in de voorste hoorn van de grijze stof in het ruggenmerg, vormen <10% van de totale celpopulatie, omgeven door een zee van astrocyten, en als zodanig kan hun transcriptieprofiel niet gemakkelijk worden gedeconsequenteerd uit studies van het hele koord. Een laser capture-benadering is dus ideaal voor het analyseren van RNA-expressie in deze cellen, waarbij de fysiologie wordt bewaard door het snoer snel te exciseren en te bevriezen na een korte intracardiale zoutoplossingperfusie. Motorneuron somata zijn groot en zijn dus gemakkelijk detecteerbaar, hier met behulp van een kleurstof die een sterke affiniteit heeft voor neuronen³. Bovendien leveren deze cellen met een dergelijke grootte een relatief grote hoeveelheid RNA per gevangen cel. De gebruikte procedure, zoals hieronder beschreven, kan gemakkelijk worden aangepast om andere neuronale celtypen te verkrijgen, evenals mogelijk andere celtypen, die specifiek worden geïdentificeerd door kleuringstechnieken of door antilichaamkleuring.

Protocol

De hier beschreven procedures voor anesthesie, euthanasie en hartperfusie van muizen werden uitgevoerd volgens een protocol dat is goedgekeurd door het Yale University Institutional Animal Care and Use Committee.

1. Voorbereiding van RNase-vrije instrumenten en oplossingen

1. RNase is een veel voorkomende verontreiniging van alle laboratoriumoppervlakken, inclusief tafelbladen, micropipetten en de onderzoeker.
   1. Verwissel handschoenen vaak of regelmatig afvegen met een RNAse ontsmettingsoplossing.
   2. Roestvrijstalen dissectiegereedschappen en glaswerk kunnen RNase-vrij worden gemaakt door 1 uur of langer >200 °C te verwarmen. Opmerking: Stoomsterilisatie vernietigt RNase niet. U kunt ook afvegen met een RNase-ontsmettingsoplossing, vervolgens met RNase-vrije 70% ethanol en aan de lucht drogen.
   3. Veeg tafelbladen, andere laboratoriumoppervlakken en micropipettors af met RNase-ontsmettingsoplossing en vervolgens met RNase-vrije 70% ethanol. Wijs een specifieke labbank of werkgebied aan voor RNA-herstel en -analyse. Opmerking: Verwijder de tip ejectors voordat u de assen van de pipettors afveegt en laat ze indien mogelijk uit.
   4. Gebruik buizen, microcentrifugebuizen, pipetten en micropipettips die door hun fabrikant zijn gecertificeerd als RNase-vrij. Het gebruik van zeer lage bindingstips en microtubes wordt aanbevolen. Gebruik indien mogelijk vers geopende dozen of zakken van deze componenten en houd ze gescheiden van de algemene laboratoriumvoorraad.
   5. Verkrijg RNase-vrije oplossingen [Dulbecco's calcium- en magnesiumvrije PBS (PBS), ethanol, RNase-vrije 70% ethanol] uit commerciële bronnen. Gebruik nieuw geopende flessen voor elk experiment.
2. De bron van de Azure B-kleur kleurt het herstel van intactE RNA. Test elke partij kleurstof voordat u kostbare monsters aan kleuring en verzameling toelegt. Verzamel een paar duizend neuronen van een niet-experimenteel dier, bereid RNA voor en bepaal de RNA-integriteit zoals hieronder beschreven om er een te vinden die consequent RIN-nummers boven 8,5 produceert.
   1. Los Azure B-kleurstof (1%, wt/vol) op in RNase-vrije 70% ethanol, meestal 0,3 g in 30 ml ethanol in een centrifugebuis van 50 ml. Meng goed op een rocker bij RT 's nachts of totdat alle deeltjes zijn opgelost. Eén buis van deze oplossing kan worden gebruikt om meerdere dia's te beitsen zonder de kleurintensiteit te beïnvloeden.
   2. Gebruik uit voorzorg een andere vlekbuis voor elke biologische replica.
3. Gebruik de cryomolds en O.C.T. voor het insluiten van snoersecties zonder verdere behandeling.
4. Houd de cryostaat op -20 tot -24 °C. Plaats de dia's na het doorsnijden in een vriezer van -80 °C totdat er voldoende is voorbereid. Start de RNA-voorbereiding zo snel mogelijk nadat de dia's zijn gemaakt. Voor langdurige opslag moet u niet-gesectiede of gedeeltelijk doorsneden OCT-blokken in plaats van dia's bij 80 °C bewaren.
5. Maak de guanidine thiocyanaatbuffer voor RNA-bereiding uit de ontlede motorneuronen met behulp van de oplossingen die door de fabrikant van de RNA-voorbereidingskit worden geboden volgens de aanwijzingen.

2. Voorbereiding van ruggenmergsecties van muizen (figuur 1A)

1. Reinig alle dissectiegereedschappen, glazen dia's, scheermesjes en dissectieplatform door te bakken of af te vegen met RNase-ontsmettingsoplossing, gevolgd door RNase-vrije 70% ethanol. Laat 2 min drogen. Houd alles stofvrij door het te bedekken met laboratoriumdoekjes.
2. Procedures voor de behandeling van dieren, waaronder anesthesie, hartperfusie en euthanasie, moeten worden uitgevoerd volgens de eisen van het lokale institutionele comité voor dierverzorging en -gebruik (IACUC), met als doel het dier snel op het punt van dwarslaesie te brengen.
   1. Verdoof de muis door intraperitoneale (ip) injectie van een dodelijke dosis Ketamine (450 mg/kg).
   2. Zodra een diep niveau van anesthesie is bereikt en bevestigd door het ontbreken van een teen-pinch-respons, plaatst u de ventrale kant van de muis omhoog op een dissectieplatform (een piepschuimbord, bijvoorbeeld), opent u de borstholte om het hart bloot te stellen en steekt u de 27 G vlindernaald van een infusieset in de linkerventrikel (die zich aan de rechterkant van de onderzoeker bevindt). Knip het rechter atrium met een scherpe tang en doordrenk met PBS met een snelheid van 5-7 ml/min gedurende ongeveer 2 minuten met behulp van een peristaltische pomp. De vloeistof die uit het atrium stroomt, moet op dit punt grotendeels vrij zijn van bloed.
   3. Verwijder de perfusienaald, onthoofd de muis en draai deze om op het dissectiebord. Open de huid om de wervelkolom bloot te leggen, gebruik een kleine schaar en tang om de wervels te verwijderen en til het ruggenmerg op terwijl u de zenuwwortels doorknipt met een scherpe tang. Snelheid en oefening zijn essentieel bij het verplaatsen van het begin van de perfusie naar het verwijderen van het snoer; dit mag niet langer dan 7 minuten duren.
   4. Spoel het snoer 10 seconden af in RNase-vrij water om eventueel restbloed af te wassen. Leg het ruggenmerg op een RNase-vrije glazen glijbaan met een gebogen tang heel voorzichtig maar snel. Verdeel het ruggenmerg dwars met een schoon scheermesje in 9-10 stukken.
   5. Plaats de stukken in een cryomold gevuld met O.C.T. met dezelfde tang en lijn ze verticaal uit met een schone naald. Plaats de mal in een ondiepe lade met 2-methylbutaan voorgekoeld met vloeibare stikstof en plaats de lade vervolgens in een vloeibaar stikstofbad om de ruggenmergstukken snel te bevriezen om RNA-afbraak te voorkomen.
   6. Bewaar het oct-ingesloten blok bij -80 °C gedurende maximaal 6 maanden voordat u het doorsnijdt. Het proces van het ophalen van het snoer tot het invriezen moet binnen 5 minuten worden uitgevoerd om de RNA-integriteit te behouden.
3. Cryosection het O.C.T.-ingebed blok bij -20 °C met een cryostaat om 20 μm plakken te produceren, elk met 9-10 ruggenmergdoorsneden, op RNase-vrije PEN-membraan 2 μm dia's die aanvankelijk op kamertemperatuur worden gehouden om ervoor te zorgen dat de secties zich aan de dia hechten. Vries het gedeelte onmiddellijk opnieuw in op een oppervlak van -20 °C in de cryostaat. Houd de dia's op -80 °C tot ze gebruikt zijn.

3. Kleuring van ruggenmergsecties (figuur 1A)

1. Schik zes conische buizen van 50 ml op een schoon rek. Vul ze allemaal met 25-30 ml RNase-vrije 70% ethanol, zodat de diepte voldoende is om alle secties op een dia te bedekken wanneer de dia wordt ondergedompeld. Maak 30-35 ml 1% Azure B-oplossing zoals eerder beschreven en bewaar deze op hetzelfde rack om de tijd tussen het wisselen van oplossingen tijdens het wassen of kleuren te minimaliseren. Houd drie of vier labdoekjes voor het rek om extra oplossing snel af te tappen.
2. Haal de dia's uit de vriezer van -80 °C op droogijs. Ontdooi een glijbaan door deze op een gehandschoende handpalm te plaatsen. Verwijder het grootste deel van het vocht en condensatie op de glijbaan door het af te vegen met een laboratoriumdoekje, waarbij u erop let dat u de secties niet aanraakt. Doe de glijbaan op vers silicagel droogmiddel in een Petrischaaltje voor 30-40 sec om volledig te drogen. Als de luchtvochtigheid in het laboratorium hoog is, kan een korte behandeling in een vacuümdesicator worden gebruikt om de glijbaan sneller te drogen.
3. Wassen en kleuren.
   1. Dompel de gedroogde glijbaan in de eerste tube RNase-vrije 70% ethanol. Week de glijbaan gedurende 30 seconden en was vervolgens de glijbaan om de OCT te verwijderen door deze 45-60 sec op en neer te dompelen. Haal de schuif uit de oplossing en giet de overtollige vloeistof af op laboratoriumdoekjes. Herhaal hetzelfde proces door de glijbaan in de tweede buis van 70% ethanol te dompelen. Als de OCT rond de ruggenmergsecties niet volledig verdwenen is, herhaalt u de was in de derde buis.
   2. Nadat u de overtollige vloeistof hebt afgetapt, dompelt u de dia gedurende 30-45 seconden onder in 1% Azure B-oplossing in 70% RNase-vrije ethanol. Leeg de overtollige Azure B op een lab wipe; op dit punt zal de hele dia blauw zijn.
   3. Dompel de glijbaan onder in de volgende buis van 70% ethanol en duik snel 3-4x op en neer om overtollige kleurstof te verwijderen en de specifieke kleuring van motorneuronen zichtbaar te maken. Als de secties er erg donker gekleurd uitzien, herhaal dan de inbeperkte stap in een verse buis van 70% ethanol. Als de kleuring te licht lijkt, retourneert u de dia naar de Azure B-oplossing voor nog eens 30 seconden en herhaalt u de bewaring. Veeg de overtollige ethanol af en droog de glijbaan gedurende ~ 40 seconden af totdat alle vloeistof weg is. De grijze stof zal lichtblauw zijn, terwijl de motorneuronen diepblauw worden gekleurd, wat gemakkelijk zichtbaar is. Start de dissectie onmiddellijk.

4. Laser Capture Microdissection (LMD) (figuur 1B)

1. Zet de microscoop aan en verwijder de buishouder om de dop van een microfugebuis van 0,6 ml te bevestigen voor het verzamelen van monsters. Doe 30 μl guanidine thiocyanaatlysebuffer in de dop van een microfugebuis van 0,6 ml. Bedek het oppervlak van de dop met vloeistof door de oplossing te verspreiden met behulp van een pipetpunt. Op deze manier worden alle verzamelde neuronen opgelost in een solubiliserende oplossing terwijl ze worden ontleed. Lijn de dop uit met het gat en het doel met de microscoopsoftware. Houd de dop in de afgedekte positie totdat u begint met laser capture.
2. Plaats de luchtgedroogde dia ondersteboven op het podium van de LMD-microscoop, zodat het membraan van de PEN naar beneden gericht is. Het membraan met secties moet naar het gat kijken, daaronder bevindt zich de opvangbuis.
3. Schakel de laser 10 minuten in voordat u begint met de voorbereiding van de schuif. Focus op een ruggenmergsectie met de 5X-doelstelling. Ga naar de 20X-doelstelling voor dissectie.
   1. Markeer een "dummy"-gebied met de lichtpen en laat de laser deze uitsnijden zonder deze te verzamelen. Dit ontspant het PEN-membraan en maakt het mogelijk om meerdere regio's achtereenvolgens te markeren en te snijden.
   2. Heroriënteer en identificeer motorneuronen in het ventrale hoorngebied. Deze neuronen zijn herkenbaar aan hun locatie, hun piramidale morfologie, hun grote formaat en hun donkerblauwe kleuring met Azure B (Figuur 2).
   3. Selecteer met behulp van de lichtpen het tekengereedschap en markeer langs de rand van de motorneuronen, waardoor een volledige omtrek wordt gemaakt. Probeer de omtrek zo dicht mogelijk bij het motorneuron te maken om besmetting van andere cellen dan het motorneuron te voorkomen. (Test vooraf enkele secties om te zien hoe breed de lasersnijlijn is en pas de speling indien nodig aan.) Markeer meerdere cellen voordat u gaat snijden; de software onthoudt de posities.
   4. Breng de dop onder de snijpositie door op de doppositie te klikken. Klik op de startknop om motorneurondissectie met de laser te starten. Verzamel alle motorneuronen van alle secties op één dia in de dop van één microfugebuis.
   5. Nadat de inzameling is voltooid, haalt u de microfuge-buis uit de houder door de lade uit te laden en de buis voorzichtig los te maken. Los de motorneuronen in de buffer volledig op door de oplossing op en neer te pipetten. Verplaats de oplossing in het lichaam van de buis door gedurende 2 min bij 4 °C 14.000 x g te centrifugeren. Vries het monster onmiddellijk in droogijs en bewaar het bij -80 °C. Dit proces, van diakleuring door motorneuronverzameling, moet binnen 30 minuten voor één dia worden uitgevoerd om RNA-afbraak te minimaliseren.

5. RNA-voorbereiding van motorneuronen

Ontdooi alle verzamelde neuronen van één dier en bundel ze samen om RNA te extraheren. Voorbeelden kunnen er lichtblauw uitzien, afhankelijk van het aantal motorneuronen (gekleurd met Azure B) erin. Extract RNA met behulp van een geschikte kit volgens het protocol voor LMD-weefsel, eluting in het minimaal mogelijke volume. Neem 1 μl om de hoeveelheid en integriteit van het monster te controleren. Vries het resterende RNA snel in op droogijs en bewaar bij -80 °C.

6. Bepaling van RNA-kwaliteit en -kwantiteit

Bepaal de RNA-kwaliteit met het monster van 1 μl op een capillaire elektroforesemicrofluïdicachip volgens het protocol van de fabrikant. Totale RNA-preparaten met een RNA Integrity Number (RIN) boven 8,5 kunnen worden gebruikt voor RNA-seq en qRT-PCR. De gegevensuitvoer omvat meestal ook de geschatte concentratie van het monster.

Resultaten

Het hierboven en in figuur 1 beschreven protocol moet 50 ng of meer van het totale RNA produceren met een RIN van > 8,5 van 3.000-4.000 spinale motorische neuroncellichamen die zijn ontleed uit de 9-10 20 μm-plakjes op ongeveer 20 PEN-dia's. Omdat dit aantal dia's minder dan 10% van een O.C.T.-ingebed blok van een muismerg vertegenwoordigt, is het mogelijk om terug te keren naar het blok, dat is opgeslagen bij -80 °C, en meer plakjes te snijden om nog een ronde RNA-voorbereiding te doorlopen. Als grotere hoeveelheden RNA nodig zijn voor een analyse, is het beter om alleen het aantal dia's(bijv. 20) in één keer te maken dat in een paar dagen kan worden verwerkt door dissectie en RNA-voorbereiding, maak dan meer dia's voor een tweede ronde en combineer de producten. Zorg ervoor dat u eerst de RIN van elke bereiding controleert om te voorkomen dat u een goede met een slechte combineert. RNA-seq-methoden worden gevoeliger en nieuwe PCR-technologieën beloven een hogere gevoeligheid dan de huidige. Er zal dus minder RNA van minder neuroncellichamen nodig zijn, waardoor een grotere sequencingdiepte en een uitgebreidere validatie van interessante hits mogelijk is. Aan de andere kant kan volledige naleving van de MIQE-aanbevelingen voor qRT-PCR-analyse en validatie⁴ grotere hoeveelheden vereisen om de noodzakelijke controlereacties voor NNA's met een lage overvloed mogelijk te maken.

Figuur 2 toont een typische reeks afbeeldingen van een deel van een sectie van een ventrale hoorn van het ruggenmerg na Azure B-kleuring en dissectie. In paneel A zijn de grote, donker bevlekte cellichamen motorneuronen, bevestigd door anti-Chat-antilichaamkleuring^2,en zijn ze gemakkelijk te onderscheiden van kleinere naburige cellen. Paneel B toont hetzelfde gebied met individuele cellichamen omlijnd met de lichtpen en genummerd door de microscoopsoftware. De contouren volgen de marges van de cellichamen op de voet, met een kleine vergoeding voor de snijbreedte van de laser. Deze afstand moet worden bepaald voor elke laservermogensinstelling om de opname van buitenaards materiaal te minimaliseren en verlies van motorneuroncytosol te voorkomen. Panelen C en D tonen de sectie nadat de laser is gesneden en de afzonderlijke cellichamen in de opvangdop zijn gevallen. Merk op dat de snijmarge niet precies de omtrek van de lichtpen in paneel C volgt, maar er grotendeels buiten blijft. Deze onregelmatigheid is zichtbaar in paneel D, net als het verduisterde gebied rond elke snede, dat de warmteschade aan het weefsel weerspiegelt die door de laser wordt veroorzaakt. Daarom, als twee cellichamen zeer dicht bij elkaar staan, is het beter om ze voor een enkele snede te schetsen, in plaats van te proberen ze afzonderlijk te snijden en wat RNA te verliezen aan warmteschade in hun regio van bijna-contact.

Figuur 3 toont typische resultaten van een elektroforetische analyse van de RNA-integriteit van een monster van RNA bereid uit ~4.000 muismotorneuroncellichamen verzameld door LMD. Het bovenste paneel is het elektroferogram dat wordt geproduceerd door 1 μl van het totale RNA; de inzet aan de rechterkant is een afbeelding van de gel. Let bij beide op de prominente ribosomale RNA-pieken. Het onderste paneel is het elektroferogram van de rijstrook met RNA-groottenormen. De analysesoftware berekende een RIN van 9,8 voor dit monster, met een concentratie van 4,9 ng/μl. In totaal was 13 μl van deze oplossing beschikbaar na de analyse, wat 64 ng RNA leverde voor downstream qRT-PCR validatie van transcriptiehoeveelheden. Voor een typische qRT-PCR-analyse van matig overvloedige transcripties is 0,15-0,20 ng totaal RNA voldoende om nauwkeurige kwantificering²te produceren, dus de hoeveelheid RNA die beschikbaar is uit dit preparaat is voldoende om een aantal transcripties met meerdere primersets te valideren, zoals aanbevolen⁴. Natuurlijk kunnen grotere hoeveelheden input RNA worden gebruikt om validatie van zeldzame transcripties mogelijk te maken. Dit bedrag is ook meer dan voldoende om bibliotheekvoorbereiding en RNA-seq van de volgende generatie mogelijk te maken.

Figuur 1. Overzicht van de productie van ruggenmergsegmenten en laser capture microdissection van spinale motorische neuroncellichamen. A) Belangrijke stappen in de productie en kleuring van plakjes. B) Cartoon weergave van ruggenmerg sectie en laser dissectie. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken. 

Figuur 2. Voor-en-na beelden van een laser dissectie van Azure B bevlekte motor neuron cel lichamen. A) Een deel van de ventrale hoorn van een bevlekte sectie. Let op de vier grote, donker bevlekte cellen. Er zijn ook een paar licht bevlekte en iets kleinere cellen, die geen motorneuronen zijn (bevestigd door anti-Chat antilichaamkleuring; niet getoond, maar zie Bandyopadhyay²) en die niet zullen worden geselecteerd voor dissectie. De vele kleine, donkere vlekken zijn waarschijnlijk neuronale processen (dendrieten en axonen), maar dit is niet bevestigd. B) De vier cellichamen die met de lichte pen worden geschetst. Merk op dat de contouren de marges van de cellen op de voet volgen, met een minimale afstand ertussen. Deze afstand moet empirisch worden vastgesteld voor elke microscoop en laser. De software nummert de individuele neuronen, wat het bijhouden van het aantal verzamelde neuronen vereenvoudigt. C en D) Nadat de laser is gesneden en de stukken met de cellichamen in de opvangdop zijn gevallen. Merk op dat het achtergelaten gat iets groter is dan de omtrek en onregelmatig is. Dit weerspiegelt de breedte van de laserstraal en de enigszins variabele snijefficiëntie, afhankelijk van de lokale samenstelling van het weefsel. Ook zichtbaar is de rand van verduisterd weefsel rondom elk gat als gevolg van lokale verwarmingsschade veroorzaakt door de laser. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken.

Figuur 3. Elektroforetische analyse van de integriteit van RNA bereid uit LMD-monsters. A) Een 1 μl aliquot van het RNA bereid uit ~4.000 motorneuroncellichamen volgens bovenstaand protocol werd geanalyseerd door microcapillaire elektroforese op een microfluïdische chip. Het elektroferogram wordt getoond, met prominente ribosomale RNA-pieken. Aan de rechterkant is een afbeelding van de gel zelf. B) Het elektroferogram van de groottenormen wordt getoond, met de overeenkomstige gelstrook aan de rechterkant. De instrumentsoftware berekende een RIN van 9,8 voor dit monster en een concentratie van 4,9 ng/μl. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken.

Discussie

De belangrijkste graadmeter voor het succes van dit protocol voor de productie van totaal RNA door lasermicrodsectie van dwarslaesiesegmenten is de RIN-waarde⁵. Voor RNA-monsters van hogere eukaryoten leveren waarden boven 8,5 regelmatig sequencing- en qRT-PCR-gegevens van hoge kwaliteit op. Als de opbrengst laag is, maar de kwaliteit hoog, herhaal dan het preparaat. Als de integriteit echter lager is (zelfs 7,5-8), is het beter om de bron van het probleem te vinden en het opnieuw te proberen. Er zijn veel stappen waarbij er iets mis kan gaan, maar eigenlijk slechts twee bronnen van het probleem - endogene RNase-besmetting of exogene RNase-besmetting. De eerste kan door de praktijk worden aangepakt, zodat de tijd van het offeren van de muis tot het bevriezen van het O.C.T-ingebedde snoer wordt geminimaliseerd. Het andere punt in het protocol waar endogene RNase kan bijdragen aan een slecht resultaat is tijdens de bereiding van de plakjes. Elk plakje moet zich snel aan een PEN-schuif op kamertemperatuur hechten, maar deze smelt (de O.C.T wordt duidelijk). Hoe sneller het plakje kan worden gerevrozen, hoe beter. De cryostaat die we gebruiken heeft vlakke oppervlakken in de kamer die op -20 °C staan, die we gebruiken om de plak snel opnieuw in te vriezen. Zoek een vergelijkbare plek in de gebruikte cryostaat en zorg ervoor dat het plakje snel weer ondoorzichtig wordt.

Het opsporen van bronnen van exogene RNase kan moeilijk zijn, omdat er zoveel mogelijkheden zijn. De enige reagentia die niet uitdrukkelijk RNase-vrij zijn, zijn O.C.T. en de Azure B. Als de Azure B eerder naar tevredenheid heeft gepresteerd, probeert u een nieuwe fles O.C.T., hoewel dit reagens nooit een probleem is geweest. RNase-vrije reagentia kunnen ook worden vervangen, zelfs van een andere leverancier. Een veel waarschijnlijker bron is de onderzoeker. Naast een grondige opruiming van het werkgebied, is het vaak handig om een ander laboratoriumlid langs te laten komen en alle stappen in de procedure te observeren. Zelfs als dit iemand is die deze procedure niet routinematig uitvoert, kan een nieuwe reeks ogen een anders onopgemerkte bron van besmetting oppikken.

Om dit protocol uit te breiden tot het herstellen van RNA uit andere ruggenmergcellen, uit ruggenmergcellen van andere soorten of van specifieke celtypen in andere organen, moeten op verschillende gebieden worden gewijzigd om een duidelijke identificatie van de cellen van belang te bereiken en tegelijkertijd de impact van endogene RNase te verminderen of op zijn minst te minimaliseren. In het protocol hier, snelle verwijdering en bevriezing van het snoer, in combinatie met Azure B-kleuring in 70% ethanol, maakte zowel minimalisatie van RNA-afbraak als eenvoudige identificatie van motorneuroncellichamen mogelijk. Azure B is een gevestigde histochemische vlek voor neuronen die lijkt te binden aan RNA³ en is gebruikt om RNA-gehalte van neuronen te evalueren in autopsiemonsters van hersenweefsel van patiënten met neurodegeneratieve ziekte⁶. Azure B-kleuring heeft met name geen invloed op de integriteit van het gezuiverde RNA of op het vermogen om omgekeerd te worden getranscribeerd en geanalyseerd. Andere kleurstoffen, zoals cresylviooltje⁷ en toluidineblauw^8, zijn gebruikt in vergelijkbare LMD-protocollen. Het verzamelen van de cellichamen rechtstreeks in guanidine thiocyanaat oplossing als ze werden ontleed, vormde de laatste stap die resulteerde in het routinematige herstel van intact RNA.

Vergelijkbare benaderingen kunnen worden voorgesteld voor andere cellen en organen, erkennend dat het identificeren van de cellen van belang terwijl RNA-afbraak door endogene RNases wordt geminimaliseerd of, bij voorkeur, wordt voorkomen, de essentiële vereiste is voor een succesvolle analyse. In weefsels met hoge niveaus van RNase, zoals alvleesklier, zijn snelle behandeling en lage temperatuur gecombineerd om herstel van RNA uit β-cellen mogelijk te maken, profiterend van hun natuurlijke autofluorescentie voor visualisatie⁹. Procedures met antilichaamkleuring voor identificatie zijn ook gemeld¹⁰, maar zijn niet volledig succesvol geweest in onze handen. Ten slotte zijn er veel muismodellen beschikbaar die fluorescerende fusie-eiwitten(d.w.z. GFP, YFP, RFP) uitdrukken in cellen van belang, die kunnen worden gebruikt om ze te identificeren in weefselsecties op de LMD-microscoop. In feite drukken de muisstammen die we met dit protocol hebben geanalyseerd een fusie-eiwit uit tussen SOD1 en YFP¹¹, en hun spinale motorneuronen zijn zeer fluorescerend. We waren echter niet in staat om een reeks ethanolwassingen en / of uitdrogingsomstandigheden te vinden die tegelijkertijd de O.C.T. zouden verwijderen, de RNase-activiteit zouden remmen en consequent voldoende YFP-fluorescentie zouden handhaven om visualisatie van de motorneuronen en hun herstel door LMD mogelijk te maken. Misschien kan een nieuw fluorescerend eiwit of een variant van de beschikbare die fluorescentie in organische oplosmiddelen handhaaft, worden gevonden om deze beperking te overwinnen.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Ketamine	Webster Veterinary	26637041101	Elke bron goedgekeurd door de institutionele dierenarts
Dissectie-instrumenten (schaar, pincet, etc.)			Elke handige bron van hoogwaardige dissectie-instrumenten
Cryostat	Leica Microsystem	CM3050S	Andere cryostats zouden geschikt moeten zijn
LMD6000 B	Leica Microsystem		Andere LMD-systemen zijn niet getest
RNase-vrije PEN-membraan 2 μm slides	Leica Microsystem	11505189	Andere soorten slides zijn getest en presteren niet goed
RNeasy Micro kit (50)	Qiagen	74004	Elke kit die guanidinethiocyanaat lysebuffer gebruikt en is getest op het herstellen van kleine hoeveelheden RNA, kan worden gebruikt
Agilent 2100 BioAnalyzer	Agilent Technologies	G2939A
Azure B Certified	MP Biomedicals	190520	Kritisch! Product van elke bron moet worden getest voor gebruik op zijn vermogen om de RNA-integriteit te behouden
PBS	Sigma Life Science	D8537	Elke betrouwbare bron van RNase-vrije PBS
RNA Ethanol 70% (gemaakt met DEPC behandeld water)	American Bioanalytical	AB04010-00500	Elke betrouwbare bron, kan in het lab worden gemaakt
Water, RNase-vrij, endotoxine getest (behandeld met DEPC om RNase te elimineren)	American Bioanalytical	AB02128-00500	Elke betrouwbare bron, kan in het lab worden gemaakt
RNase AWAY	Invitrogen Life Technologies	10328-011	Andere vergelijkbare RNase-verwijderingsreagentia, zoals RNaseZAP (ook van Invitrogen) kunnen worden gebruikt
2-Methylbutaan	Electron Microscopy Sciences	78-78-4	Elke bron
Maxymum Recovery microfuge buizen (0,6 en 1,5 ml) en pipettenpunten	Axygen	311-03-051 & 311-09-051	Ultra-lage retentie, RNase-vrije buizen en punten; test andere fabrikantenproducten voor gebruik
O.C.T. Compound	Tissue-Tek	4583
Cryomold Intermediate Size	Tissue-Tek	4566
Labdoeken (Kimwipes)	KIMTECH	34155