FIBS-enabled Noninvasive metabole

Samenvatting

Een beschrijving van hoe je Förster Resonance Energy Transfer geïntegreerde biologische sensoren (FIBS) kalibreren voor in situ metabool profiel wordt gepresenteerd. De FIBS kan worden gebruikt om de intracellulaire niveaus van metabolieten invasief leveren aan de ontwikkeling van metabole modellen en hoge doorvoer screening van bioproces omstandigheden te meten.

Samenvatting

In het tijdperk van de computationele biologie, nieuwe high throughput experimentele systemen die nodig zijn om aan te vullen en te verfijnen modellen, zodat ze kunnen worden gevalideerd voor voorspellende doeleinden. Idealiter dergelijke systemen zou een laag volume, dat de bemonstering en destructieve analyses in de weg staat wanneer de tijd cursus data zijn te verkrijgen zijn. Wat nodig is, is een in situ monitoring tool die de nodige informatie in real-time en niet-invasief te kunnen melden. Een interessante optie is het gebruik van fluorescente, basis van eiwitten in vivo biologische sensoren als reporters intracellulaire concentraties. Een specifieke klasse van in vivo biosensoren die toepassingen heeft in metaboliet kwantificering is gebaseerd op Förster Resonance Energy Transfer (FRET) tussen twee fluorescente eiwitten verbonden door een ligand bindend domein. FRET geïntegreerde biologische sensoren (FIBS) worden constitutief geproduceerd binnen de cellijn, ze hebben snelle responstijden en hun spectrale chagenschappen veranderen gebaseerd op de concentratie van metaboliet in de cel. In dit artikel wordt de werkwijze voor het construeren van de Chinese hamster ovarium (CHO) cellijnen die constitutief een FIBS glucose en glutamine en kalibreren van de FIBS in vivo in batch celkweek om toekomstige kwantificering van intracellulaire metaboliet concentratie inschakelen beschreven. Gegevens van fed-batch CHO celkweken aantoont dat de FIBS kon telkens de resulterende verandering in de intracellulaire concentratie detecteren. De fluorescerende signaal van de FIBS en de eerder geconstrueerde ijkcurve werd de intracellulaire concentratie nauwkeurig bepaald bevestigd door een onafhankelijke enzymatische test.

Inleiding

Metaboliet controle heeft diverse toepassingen in bioprocessing, inclusief procesontwikkeling, media en diervoeders ontwerp en metabolic engineering. Verschillende werkwijzen zijn beschikbaar voor concentratiemetingen door middel van enzymatische ^{1, 2} chemisch of bindingstesten ^3. Een interessante optie is het gebruik van fluorescente, basis van eiwitten in vivo biologische sensoren als reporters van de intracellulaire concentratie van belangrijke metabolieten. In ultra-low volume assays, fluorescentie is een handig hulpmiddel als miniaturisatie feite verbetert de signaal-ruisverhouding ^4,5 en eiwit gebaseerde sensoren kunnen genetisch gecodeerd zin dat geen exogene reagens nodig metabolietanalyse zijn. Förster Resonance Energy Transfer (FRET) biosensoren uit twee fluorescerende eiwitten verbonden door een ligand bindend domein. FRET is een nonradiative overdracht van energie van een foto-enthousiast donor naar een acceptor fluorescerend molecuul locat ed in de nabijheid (<100). Ligand splitsing of binding veroorzaakt een conformationele verandering in de sensor, die op zijn beurt veroorzaakt een verandering in de nabijheid van de fluoroforen, wat leidt tot een verandering in FRET efficiëntie gemeten door de verandering in het emissiespectrum. FRET geïntegreerde biologische sensoren (FIBS) wordt constitutief geproduceerd in de cellijn en de spectrale eigenschappen veranderen gebaseerd op de concentratie van metaboliet in de cel. FIBS hebben snelle responstijden waardoor ze ideaal zijn voor het nemen van metingen van dynamische modellen ^6. Vorige toepassingen zijn onder meer het toezicht op enkele ^7-9 en meerdere ¹⁰ metabolieten en het verstrekken van gegevens over de tijdruimtelijke verdeling ^11. FIBS kunnen worden gemaakt in twee configuraties: Apo-Max, wanneer ligandbinding verstoort de nabijheid van de fluoroforen verlagen energieoverdracht en Apo-Min, wanneer ligandbinding brengt de twee fluoroforen in nauwer contact (figuur 1).

_content "> In dit werk wordt een protocol gepresenteerd voor de bouw van Chinese hamster ovarium (CHO) cellijnen die constitutief een FIBS voor een metaboliet, glucose of glutamine. Een methodologie vastgesteld voor de kalibratie van de sensor in vivo om toekomstige kwantitatieve staat metingen van intracellulaire metaboliet concentratie zoals aangegeven in figuur 2. Op basis daarvan de intracellulaire concentratie van glucose of glutamine kan worden bepaald fed-batch CHO celkweken, waarbij de twee nutriënten werden toegevoegd in hoge concentraties in het proces. de resultaten blijkt dat met het fluorescerende signaal van de FIBS en de eerder geconstrueerde ijkcurve nauwkeurig voorspellen van de intracellulaire concentratie mogelijk, zoals bevestigd door een onafhankelijke enzymatische test. Deze methode biedt aanzienlijke voordelen boven de huidige analytische technieken omdat het invasieve, goedkope en snel, het geven van een real-time signaal van de FIBS die maan kan zijnitored de hele cultuur.

Protocol

1. Cellijn Revival en onderhoud

1. Revive CHO-cellen in 9 ml CD-CHO medium aangevuld met 8 mM L-glutamine en 10 ml / L 100x hypoxanthine / thymidine supplement (compleet groeimedium).
2. Centrifugeer bij 100 xg gedurende 5 minuten.
3. Resuspendeer de cellen in 10 ml vers compleet groeimedium.
4. Verwijderen van een 1 ml monster en bepaal de levensvatbare cel concentratie met lichtmicroscopie met de trypanblauw kleurstof uitsluiting methode in een hemocytometer.
5. Start een cultuur op een seeding dichtheid van 3 x 10 ⁵ cellen / ml in 125 ml schudflessen.
6. Handhaaf de cultuur in een incubator bij 37 ° C, een bevochtigde atmosfeer van 5% _CO2, op een orbitale schudden platform roteert met 120 rpm.
7. Subcultuur elke 3-4 dagen in hele groeimedium in een zaaidichtheid van 2 x 10 ⁵ cellen / ml.

2. Transfectie van de cellijn met het plasmide Containing de biosensor Gene

1. Bereid plasmide-DNA met een grootschalige plasmide zuiveringskit.
2. Handhaaf cellen bij de geschikte omstandigheden (37 ° C, 5% _CO2) 12-24 uur voor transfectie te zorgen voor de cellen actief delende op het moment van transfectie.
3. Tel de cellen met de kleurstof trypan blauw uitsluiting werkwijze vervolgens een werkvolume van 20 ml celkweek in een 125 ml schudkolf bij een concentratie van 1 x 10 ⁶ cellen / ml.
4. Gebruik een geschikte transfectie kit voor de cellijn in gebruik. Het plasmide DNA transfectie reagentia ratio zal afhankelijk van de cellijn en vector zijn. Aanbevolen wordt het geoptimaliseerd door het testen van verschillende verhoudingen binnen het bereik van de fabrikant gespecificeerde alvorens zij de uiteindelijke transfecties. Ook houden tenminste een negatieve controle kweek die de cellen maar geen DNA.
5. Incubeer gedurende 4 dagen in de statische modus en vervolgens overbrengen naar een shaking platform draaien op 125 rpm.
6. Voeg de juiste antibioticum voor plasmide selectie naar een geschikte concentratie, zoals bepaald door een kill-curve. In deze studie werd zeocine toegevoegd tot een eindconcentratie van 400 ug / ml voor de selectie van getransfecteerde cellen.
7. Verander media op een geschikt moment interval voor de cellijn, antibiotica telkens voegen, totdat de cellen in de controle goed zijn gestorven.
8. Gebruik de meest samenvloeiing putten om de voortgang te schudden culturen.
9. Stel een cel bank bevroren cellen in cryogene flesjes die 10 ⁷ levensvatbare cellen in 1 ml bevriezen mengsel. In dit werk, die bestaat uit 92,5% groeimedium en 7,5% dimethylsulfoxide.

3. Batch en Fed-batch celgroei Curve

1. Volg de instructies voor celonderhoud hierboven om drievoud celculturen van de getransfecteerde CHO-cellen in 250 ml vestigen schud kolven met een werkvolume van 50 ml.
2. Handhaving van de cultures in een bevochtigde cel incubator bij 37 ° C met 5% _CO2, op een orbitale schudden platform roteert met 125 rpm en verwijder 4,1 ml monsters van elke groeiende kweek van 24 uur intervallen.
3. Gebruik 100 ul van het monster op de levensvatbare celconcentratie en levensvatbaarheid van de cellen met de kleurstof trypan blauw uitsluiting methode bepalen.
4. Herhaal dit totdat de levensvatbare cel concentratie tot nul wordt gereduceerd.
5. Herhaal de fed-batch celculturen te vullen met de geschikte hoeveelheid glucose of glutamine op dag 6 met de concentratie respectievelijk herstellen naar hun initiële waarden van 36 mM en 4 mM. Aanbevolen wordt extra controle kweken ook worden gehandhaafd, die worden gevoed met hetzelfde volume (12 ml in dit geval) zuiver water.

4. FRET Ratio Metingen

1. Neem 2 ml van de dagelijkse monsters verwijderd in stap 3.2 en centrifugeer bij 100 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C.
2. Resuspeindigde de celpellet in 2 ml ijskoude fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS). Breng deze in een 6-wells plaat en voeg een blanco monster dat geen cellen aan een putje.
3. Meet de niveaus van blauwe en gele fluorescentie onmiddellijk bij een excitatie golflengte van 430/435 nm en emissie golflengten van 465/435 nm (blauw) en 520/510 nm (geel).
4. Bereken de FRET ratio (verhouding van gele fluorescentie gedetecteerd over blauwe fluorescentie gedetecteerd).

5. Metaboliet Testen

1. Neem 2 ml van de dagelijkse monsters verwijderd in stap 3.2 en centrifugeer bij 100 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C. Verwijder het supernatant.
2. Resuspendeer de celpellet in 3 ml ijskoude PBS en centrifugeer opnieuw bij 100 xg gedurende 5 minuten.
3. Verwijder het supernatant en resuspendeer de celpellet in 3 ml ijskoude PBS zoals hierboven. Ultrasone trillingen het monster 5x gedurende 3 min elk bij een puls van 15 seconden aan en 15 seconden uit. Op dit punt, de cel extracts kan worden bevroren, indien gewenst.
4. Gebruik een geschikte glucose-assay kit volgens de instructies van de fabrikant voor monsters van celextracten de intracellulaire glucoseconcentratie bepalen (zie tabel materialen).
   Opmerking: Gebruik de juiste normen om een ​​standaard curve construeren. In dit werk, de concentratie van de normen varieerde van 0-100 mm.
5. De metingen van de normen, bouwen de standaardcurve en vind de lineaire vergelijking best passende (hier: y = 1310.51x - 723,43 waarbij y de absorptie lezen en x de glucoseconcentratie).
6. Bereken de concentraties glucose met de standaardcurve en rekening houdend met de verdunningsfactor. De intracellulaire glucoseconcentratie kan dan berekend door de vergelijking:
   
   Voor CHO-cellen, werd het enkelvoudige celvolume berekend met een celdiameter van 12 pM ¹² .
7. De geschikte glutamine assay kit volgens de instructies van de fabrikant voor monsters van celextracten de intracellulaire glutamine concentratie kan worden bepaald (zie tabel materialen).
   Opmerking: Gebruik de juiste normen om een ​​standaard curve construeren. In dit werk, de concentratie van de normen varieerde tussen 0-2 mm.
8. Zoals in 5.5 hierboven, bouwen de kalibratiecurve (in dit geval y = + 17,1 203.1x waarbij y de absorptie lezen en x de glucoseconcentratie)
9. De standaardcurve Bereken de glutamine concentratie van de monsters, waarbij de verdunning wordt gehouden. De intracellulaire glutamine concentratie kan worden berekend met vergelijking 1 hierboven.

Resultaten

Een overzicht van de methode is weergegeven in figuur 2. In het werk die hierin werden CHO-cellen getransfecteerd met de vector FIBS en stabiele cellijnen werden geselecteerd in een antibioticum druk van 400 ug / ml zeocine. Twee afzonderlijke stabiele cellijnen constitutief glucose en glutamine sensoren zijn derhalve gecreëerd. Figuur 1 toont de configuratie van de twee biosensoren in deze studie. De glucosesensor is het Apo-Max principe en de overeenkomstige plasmide pRSET-FLIPglu600μ...

Discussie

De FIBS mogelijk in vivo en in situ kwantificering van sleutelmoleculen in casu groei beperkende voedingsstoffen, onzekerheden van gevolg van afschrikken en extractiemethoden. De resultaten suggereren dat er een goede correlatie tussen de FIBS signaal en de intracellulaire concentraties in het traject van 1-5 mM glucose en 0.3-2 mM glutamine. In batch CHO-celkweek, zijn deze concentraties aangetroffen in de exponentiële, stationaire en vroege daling fasen. De exponentiële en stationaire fasen zijn de m...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
CHO-S Cellen	Life Technologies	11619-012	De cellijn varieert afhankelijk van de doelen van de studie
pCDNA4/TO vector	Life Technologies
TransIT-PRO Transfectie Reagens	Mirus Bio	MIR 5700	Transfecties kunnen worden uitgevoerd met behulp van elke methode die geschikt is voor de onderzochte cellijn
Zeocin	Invivogen
CD-CHO medium	Life Technologies	10743-011	Het celgroeimedium is afhankelijk van de onderzochte cellen
100x HT Supplement	Life Technologies	11067-030
L-Glutamine 200 mM (100x), Liquid	Life Technologies	25030032
InfinitePRO 200 plate reader	Tecan	FLx800TBI	Elke 96-wells fluorescentie plate reader die toegang heeft tot de vereiste golflengten kan worden vervangen
Filters voor plate reader	Tecan	30000463
Maxiprep Plasmid Purification Kit	Qiagen	12163	Elke geschikte kit kan worden vervangen
Amplex Red glucose/glucose oxidase assay kit	Invitrogen	A22189	Elke geschikte kit kan worden vervangen
EnzyChrom  Glutamine Assay Kit	BioAssay Systems	EOAC-100	Elke geschikte kit kan worden vervangen
Improved Neubauer hemocytometer	Fisher Scientific	MNK-420-010N
Incubator	Nuaire	NU-5510E