In vivo beeldvorming van Optic Nerve Fiber Integrity by-Contrast Enhanced MRI in Muizen

Samenvatting

Deze video illustreert een methode, met behulp van een klinische 3 T scanner, voor contrast-versterkte MRI van de naïeve muis visuele projectie en voor herhaalde en longitudinale in vivo studies van de oogzenuw degeneratie geassocieerd met acute oogzenuw verpletteren letsel en chronische oogzenuw degeneratie in knock-out muizen (p50 ^KO).

Samenvatting

Het knaagdier visuele systeem omvat retinale ganglion cellen en hun axonen die de oogzenuw te vormen om thalamische en middenhersenen centra, en postsynaptische projecties in te voeren om de visuele cortex. Op basis van zijn aparte anatomische structuur en gemakkelijke toegankelijkheid, is het uitgegroeid tot de favoriete structuur voor studies op neuronale overleving, axonale regeneratie, en synaptische plasticiteit. Recente ontwikkelingen in de MRI zijn de in vivo visualisatie van de retino-tectal deel van deze projectie met behulp van mangaan gemedieerde contrast enhancement (MEMRI) ingeschakeld. Hier presenteren we een MEMRI protocol ter illustratie van de visuele projectie in muizen, waarbij resoluties (200 um) ³ worden bereikt gebruikelijke 3 Tesla scanners. We zien hoe intravitreale injectie van een enkele dosis van 15 nmol _MnCl2 tot een verzadigde verbetering van de intacte uitsteeksel binnen 24 uur. Met uitzondering van het netvlies, zijn veranderingen in de intensiteit van het signaal onafdent van samenvallende visuele stimulatie of fysiologische veroudering. We deze techniek verder toepassen lengterichting te controleren axonaledegeneratie in respons op acute optische zenuw letsel, een paradigma waarbij Mn ^{2 +} vervoer volledig arrestaties op de laesie. Omgekeerd actieve Mn ^{2 +} transport kwantitatief evenredig met de levensvatbaarheid, nummer en elektrische activiteit van axon vezels. Voor een dergelijke analyse, illustreren we Mn ^{2 +} transportkinetiek langs de visuele pad in een transgene muismodel (NF-kB p50 ^KO) weergeven van spontane atrofie van sensorische, waaronder visuele, projecties. In deze muizen, MEMRI geeft verminderd, maar niet vertraagd ^{Mn2 +} transport in vergelijking met wildtype muizen, waardoor onthullend tekenen van structurele en / of functionele beperkingen door NF-KB mutaties.

Samengevat, MEMRI gunstig bruggen in vivo testen en post mortem histologie voor de characterizatiop van zenuwvezel integriteit en activiteit. Het is zeer nuttig voor longitudinale studies op axonale degeneratie en regeneratie, en onderzoeken van mutante muizen voor echt of induceerbare fenotypes.

Inleiding

Op basis van haar gunstige neuro-anatomische structuur het knaagdier visuele systeem biedt unieke mogelijkheden om farmacologische stoffen en hun vermogen evalueren om neuroprotection ¹ of pro-regeneratieve effecten ^2,3 bemiddelen. Bovendien kan onderzoek naar de functionele en neuro-anatomische kenmerken van muis mutanten, zoals onlangs geïllustreerd voor muizen die het presynaptische steiger eiwit Bassoon ^4. Bovendien is een breed spectrum van aanvullende instrumenten biedt extra kenmerken van retinale ganglioncellen (RGC) en RGC axon nummers evenals RGC activiteit, bijvoorbeeld door elektroretinografie en gedragstesten, en de bepaling van de corticale herschikkingen door optische beeldvorming van intrinsieke signalen. De laatste technische ontwikkelingen in de laser microscopie mogelijk te maken de in situ visualisatie van RGC regeneratie door diepe weefsel fluorescentie beeldvorming in ganse berg exemplaren van de oogzenuw (ON) en de hersenen. In deze histologsche benadering, tetrahydrofuraan gebaseerd weefsel clearing in combinatie met licht blad fluorescentie microscopie maakt de oplossing van enkele vezels die opnieuw in te voeren in de deafferented ON en tractus opticus ^5. Hoewel dergelijke technieken superieur resolutie en bepaling van groeipatronen kunnen zijn, ze repetitief en longitudinale analyses van individuele groei gebeurtenissen, die bijzonder gewenst zijn om het proces van langdurige regeneratie kan beoordelen.

Contrast-versterkte MRI is gebruikt voor de minimaal invasieve visualisatie van de retino-tectal projectie bij muizen en ratten ^6,7. Dit kan worden bereikt door directe intra-oculaire aflevering van paramagnetische ionen (bijvoorbeeld ^{Mn2 +)} retinale cellen. Als calcium analoge, Mn ^{2 +} wordt via voltage-gated calcium kanalen opgenomen in RGC somata en langs de axonale cytoskelet van de intacte ON en tractus opticus actief vervoerd. Terwijl het zich ophoopt in de hersenen kernenvan de visuele projectie, dwz de laterale nucleus geniculate (LGN) en superieure colliculus (SC), transsynaptische propagatie in de primaire visuele cortex lijkt verwaarloosbaar ^8,9, maar het kan voorkomen ^10,11. Onder MR sequencing, paramagnetische Mn ^{2 +} breidt MR contrast voornamelijk door het verkorten van de T ₁ spin-rooster relaxatietijd ^12. Dergelijke Mn ^{2 +} versterkte MRI (MEMRI) is met succes in diverse neuro-anatomische en functionele studies van ratten, inclusief de beoordeling van axonale regeneratie en degeneratie na ON letsel ^13,14 toegepast, de precieze anatomische mapping van de retino-tectal projectie ¹⁵ , evenals de bepaling van axonaal transport karakteristieken na farmacologische behandeling ^16. Recente verbeteringen in de dosering, toxiciteit en kinetiek van neuronale ^{Mn2 +} opname en transport, alsmede een verbeterde MRI protocollen toepassing uitgebreid onderzoek naar transgene⁹ muizen met 3 Tesla scanners gebruikt in klinische praktijk ^17.

Hier presenteren we een MEMRI protocol geschikt zijn voor longitudinale in vivo beeldvorming van de muis retino-tectal projectie en voorbeelden van de toepasbaarheid van het beoordelen van Mn ^{2 +} afhankelijke versterking signaal onder naïef en diverse neurodegeneratie voorwaarden. Ons protocol legt bijzondere nadruk op MR data-acquisitie in een matig 3 T magnetisch veld dat is over het algemeen toegankelijker dan toegewijde dier scanners. In naïeve muizen, we zien hoe darmkanaal-specifiek signaal intensiteit kan zijn aanzienlijk en reproduceerbaar worden verhoogd na intravitreaal (ivit) Mn ^{2 +-toepassing.} Kwantitatief, Mn ^{2 +} voortplanting langs de visuele projectie gebeurt onafhankelijk van het normale verouderingsproces (gemeten tussen 3 en 26 maanden oude muizen) en vergroting ongevoelig is voor visuele stimulatie en aanpassing aan de duisternis. Daarentegen Mn ^{2 + verrijking in thalamus en middenhersenen centra is verminderd na acute OP crush 18 alsook in nfkb1 knock-out muizen (p50 KO) lijden aan spontane apoptotische RGC dood en ON degeneratie 19. Dus, in het vergroten van conventionele histologische analyse, longitudinale MEMRI analyse van individuele dieren maakt profilering van unieke kinetiek van neurodegeneratieve processen. Dit moet nuttig zijn voor studies over neuroprotection en axonale regeneratie geassocieerd met farmacologische of genetische interventies blijken.}

Protocol

Alle dierlijke interventies worden uitgevoerd in overeenstemming met het Europees Verdrag voor Animal Care en gebruik van proefdieren en de ARVO verklaring voor het gebruik van dieren in Oogheelkundige en Vision Research. Alle experimenten zijn goedgekeurd door de lokale ethische commissie. De procedure van ON letsel bij muizen wordt elders ⁹ beschreven.

1. Intravitreale Mangaan Injection

1. Voer de ^{Mn2 +} injectie 24 uur vóór de MR scannen met behulp van een assistent. Verdoven dieren door intraperitoneale injectie van een 5% chloraalhydraatoplossing (420-450 mg / kg lichaamsgewicht in steriele PBS). Voor aanvullende topische anesthesie, breng een druppel vloeistof conjuncain (0,4% oxybuprocaïne hydrochloride) om het hoornvlies voorafgaand aan oog punctie. Injecteren 15 nmol Mn ^{2 +} per oog bereiden een 7,5 mM _MnCl2 oplossing, bijvoorbeeld door het verdunnen van 1 L 1 M _MnCl2 stockoplossing in 132 LH _{2 <}/ Sub> O. Laad 5 ul van de uiteindelijke oplossing in een 5 pl Hamilton spuit verbonden met een 34 G klein naaf verwisselbare naald (RN naald).
2. Bij het starten met het rechter oog, plaatst u de muis-linker-zijdige onder een binoculair microscoop en voorzichtig open en zet de juiste oog tussen de duim en wijsvinger van je linkerhand. Pak de spuit met je rechterhand en pak de naald dicht bij de tip. Voor atraumatische punctie van de oogbol, voorzichtig steek de naald in het glasachtig lichaam in de infero-temporele omtrek ongeveer 1 mm distaal van de limbus, waardoor sclerale schepen sparen.
3. Vervolgens, de assistent langzaam past de totale 2 pl terwijl het regelen van de omvang van de Hamilton spuit. Tijdens deze procedure bewaken optimale plaatsing van de naald onder de microscoop en punctie van de lens of morsen van de vloeistof te voorkomen. Houd de naald statisch geplaatst voor een extra 30 seconden, trek hem dan langzaam naar vloeibaar te minimaliserenlekkage vanuit de injectieplaats.
4. Tijdens de gehele procedure, moet speciale zorg worden genomen om de druk op de ogen te vermijden. Ook, vermijd hard of talrijke pogingen om doorboren de oogbol. Sinds Mn ^{2 +} opname in RGC en transport langs de ON is al verzadigd bij 15 nmol _MnCl2, dit minimaliseert signaal variaties met iets onnauwkeurig injectie volumes. Voor bilaterale verbetering van het signaal van de visuele projectie, herhaal de injectie procedure voor het linkeroog.
5. Breng ofloxacine bevattende (3 mg / ml) oogdruppels en panthenol bevattende zalf eenmaal na de procedure ooginfecties en drogen van de ogen te voorkomen. De terugkeer van de muizen naar hun kooien onder normale woonomstandigheden tot het begin van de MR-scan.

2. Animal Voorbereiding voor MRI

1. Verdoven van de muis door toediening van een 2% / 98% isofluraan / zuurstof gasmengsel. Monteer de muis op een muis houder in een bijna horizontale, niet getwist positie. Insert het in de MR spoel, die vervolgens wordt aangepast in de MR-scanner. Monitor ademhaling en hartslag door geschikte systemen. Voor technische details, zie Herrmann et al. ^20.
2. Tijdens MRI, levering anesthesie door continue inblazen van een aanvankelijk 1,5% / 98,5% isofluraan / zuurstof gasmengsel via een verdamper aangesloten op de muis hoofd houder door een geïntegreerde buis. Tijdens het scannen, stel de diepte van anesthesie volgens de opgenomen vitale parameters (bijvoorbeeld streven naar een stabiele ademhalingssnelheid van 40 ademhalingen per minuut). Met een verwarmingsinrichting hou het oppervlak lichaamstemperatuur stabiel tussen 35 en 37 ° C, zoals gemeten met een temperatuursensor gepositioneerd aan de abdominaal van de muis. Voor technische details, zie Herrmann et al. ^17.
3. Na de scan, bevrijden de muis van de houder en voorzien van zuivere zuurstof om het herstel van de anesthesie te versnellen. Daarnaast houdt de lichaamstemperatuur stabiel door het gebruik vaneen rood licht warmtebron.

3. MRI protocol

1. Het protocol is gevalideerd voor een 3 Tesla scanner uitgerust met een speciale, SNR-efficiënt, klein dier spoel (lineair gepolariseerde Litz spoel) met een effectief beeldveld van 35 mm × 38 mm. Bedien de spoel in zend-ontvangst mode.
2. Met het dier op zijn definitieve plaats, past de melodie en match van de spoel met behulp van een frequentie analyzer. Stel handmatig de zender referentiespanning en de shim stromen op de foto om de homogeniteit en kwaliteit te optimaliseren.
3. Verwerven T _1-gewogen TSE 2D beelden met een resolutie van 0,5 mm × 0,5 mm × 2 mm in sagittale en transversale uitzicht voor de planning. De planning MR scans, verwerven de MEMR afbeeldingen in coronale meetrichting geroteerd evenwijdig aan het hoofd van het dier met fasecodering langs de links-rechts richting zijn. Om acquisitie te minimaliseren, gebruik dan een rechthoekige gezichtsveld aangepast aan dewerkelijke afmetingen van de kop. Gebruik een verwende 3D FLASH sequentie (VIBE 3D) met de volgende parameters: basismatrix 256, gezichtsveld van 54 mm x 50,65 mm x 14,08 mm, met behulp van 93.8% rechthoekig gezichtsveld in fasecoderende richting en 128 schijfjes van 0,11 mm plakdikte met plak resolutie ingesteld op 61%.
4. Activeer de in-plane interpolatie tot de uiteindelijke beelden te creëren met 512 × 480 × 128, een effectieve resolutie van 0,21 mm x 0,21 mm x 0,18 mm (0,1 mm x 0,1 mm x 0,09 mm geïnterpoleerd), echo tijd T _E = 6,51 msec, herhalingstijd T _R = 16 msec, bandbreedte = 160 Hz / px, flip hoek = 22 °. Breng twee gemiddelden en drie herhalingen tot een totale overname (T _A) van ongeveer 30 minuten te bereiken.

4. MRI Data Analysis

1. Analyseer de gegevens met behulp van de software syngo fastView. Voor kwantitatieve verbetering van het signaal, selecteert gedefinieerde gebieden of belangstelling 2D planaire MRI-opnamen en bepalen signaalintensiteiten (SI) van de versterkte structuur (SI _MEMRI), weefsel achtergrond (SI _achtergron) en de standaarddeviatie van de ruis (SD _N). Gebruik indien nodig een muis hersenen atlas om neuro-anatomische oriëntatie voor LGN en SC structuren te vergemakkelijken. Bereken de contrast-ruisverhouding (CNR) volgens de formule:
2. CNR = (SI _MEMRI - SI _achte) / SD _N
3. Kwantificeren drie opeenvolgende beelden voor de gemiddelde CNR berekening voor elk monster. In bilateraal geïnjecteerd dieren, analyseren elk halfrond onafhankelijk.
4. Voor de voorstelling van horizontale, coronale en sagittale beelden, berekenen multiplanaire reconstructies van de oorspronkelijke 3D-MRI data set. Deze bewerkte beelden zijn niet geschikt voor kwantitatieve analyse. Geanimeerde 3D-reconstructies (maximale intensiteit projecties, MIP) van de Retino creëren-Tectal projectie, gebruik maken van een angiografie post-processing software module.

5. Mn ^{2 +} Autometallography (TIMM kleuring)

1. Voor TIMM kleuring van Mn ^{2 +} getraceerd hersenstructuren volgende MEMRI, injecteren een dosering van 15-150 nmol Mn ^{2 +} ivit 24 uur voorafgaand aan de beeldvorming.
2. Na de MR scannen, perfuseren de dieren met 30 ml ijskoude 0,325% Na _2S in PBS (pH 7,4). Ontleden retinae en vries monsters Vriescoupe.
3. Snijd sequentiële, equatoriale secties van 15 micrometer dikte op een cryotoom.
4. Voer TIMM kleuring ²¹ in afwezigheid van fixeermiddel en cryoprotection volgens Angenstein et al. ^22.

6. Statistische analyse

Uitvoeren van statistische analyses met behulp van de Student's t-test voor enkelvoudige vergelijkingen, gevolgd door post hoc ANOVA. Gegevens zijn weergegeven als gemiddelde ± standaardfout. Individuele N nummers zijnafzonderlijk vermeld voor elk experiment. Resultaten bereiken P ≤ 0,05 wordt als statistisch significant (p ≤ 0,05, *, p ≤ 0,01, **, P ≤ 0,001, ***).

Resultaten

Het vermogen van deze beeldvormende techniek om de vitaliteit en functionaliteit van de visuele projectie nauwkeurig vast steunt op precieze toepassing van een niet-toxisch ^{Mn2 +} dosering het glasachtige lichaam en zijn opname door RGC. Deze basisstelling wordt getest in figuur 1, waarbij layer specifieke ^{Mn2 +} opname wordt aangetoond door autometallography (TIMM kleuring) ^21. Retina secties werden geanalyseerd op 24 uur na ivit toepassing van ofwel 15 nmol of 1...

Discussie

MEMRI van het visuele systeem breidt conventionele neurobiologische technieken voor het beoordelen van de functionaliteit onder naïef en pathologische omstandigheden. Naast het bieden van een uniek inzicht in de integriteit van een geïsoleerd CZS vezel-darmkanaal, kan MEMRI gemakkelijk worden aangevuld met gedragstesten, bijvoorbeeld, optometrie en visueel gebaseerd water taken, om de onmiddellijke gevolgen van een bepaald paradigma voor visuele waarneming te onderzoeken. Het verbindt ook elektrofysiologische e...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Mangaan (II) chloride oplossing 1 M	Sigma Aldrich, Taufkirchen, Duitsland	M1787	MEMRI contrastmiddel
Conjuncain	Dr. Mann Pharma, Berlijn, Duitsland	PZN 7617666	0,4% oxybuprocaïne hydrochloride
Floxal oogdruppels	Dr. Mann Pharma, Berlijn, Duitsland	PZN 3820927	3 mg/ml ofloxacine
Panthenol zalf	Jenapharm, Jena, Duitsland	PZN 3524531
Chloraalhydraat	Sigma Aldrich, Taufkirchen, Duitsland	C8383	420-450 mg/kg lichaamsgewicht
Hamilton spuit	Hamilton Company, Reno, NV, VS	7634-01	SYR 5 µl, 75 RN, geen NDL
34 G naald (34/35/pst4/tapN)	Hamilton Company, Reno, NV, VS	207434/00	verwisselbare naald RN, 34 G, lengte 38,1 mm, puntstijl 4
Binoculaire Stemi-2000	Zeiss, Oberkochen, Duitsland
3 T MRI-scanner Magnetom TIM Trio	Siemens Medical Solutions, Erlangen, Duitsland
Rat hoofd spoel	Doty Scientific Inc., Columbia, SC, VS
Muis houder			op maat gemaakt
Rode lichtlamp
Bevroren sectie medium NEG-50	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Duitsland	6502	weefsel inbedding voor cryo-secties
Natriumdiwaterstoffosfaat monohydraat (NaH2PO4·H2O)	Merck, Darmstadt, Duitsland	106346	voor sulfide perfusie
Natriumsulfide nonahydraat (Na2S·9H2O)	Sigma Aldrich, Taufkirchen, Duitsland	208043
Gom arabicum	Roth, Arlesheim, Zwitserland	4159	voor TIMM kleuring
Hydrochinon (C6H6O2)	Roth, Arlesheim, Zwitserland	3586
Citroenzuur (C6H8O7)	Roth, Arlesheim, Zwitserland	6490
Tri-natriumcitraat dihydraat (C6H5Na3O7·2H2O)	Merck, Darmstadt, Duitsland	106448
Zilvernitraat (AgNO3)	Roth, Arlesheim, Zwitserland	7908