Het gebruik van gaschromatografie tot veranderingen in de samenstelling van vetzuren Analyseer in Rat leverweefsel tijdens de zwangerschap

Samenvatting

Zwangerschap leidt tot belangrijke veranderingen in de vetzuursamenstelling van maternale weefsels. Lipidenprofiel kan worden verkregen via gaschromatografie van de identificatie en kwantificatie van vetzuren in individuele lipideklassen onder ratten verschillende hoge en lage vetgehalte diëten tijdens de zwangerschap.

Samenvatting

Gaschromatografie (GC) is een zeer gevoelige methode voor het vetzuurgehalte van lipiden identificeren en kwantificeren van weefsels, cellen en plasma / serum, waardoor resultaten met hoge nauwkeurigheid en hoge reproduceerbaarheid. Metabole en voeding studies laat GC beoordeling van veranderingen in vetzurenconcentraties volgende activiteiten of tijdens veranderingen in de fysiologische toestand, zoals zwangerschap. Vaste fase-extractie (SPE) met aminopropyl silica cartridge kan scheiding van grote lipide klassen waaronder triacylglycerolen, verschillende fosfolipiden en cholesteryl esters (CE). GC gecombineerd met SPE werd gebruikt om de veranderingen in vetzuursamenstelling van de CE-fractie in de levers van maagdelijke en zwangere ratten die waren gevoed verschillende hoge en lage vetgehalte diëten analyseren. Er zijn aanzienlijke dieet / zwangerschap interactie-effecten op de omega-3 en omega-6 vetzuren van lever CE, wat aangeeft dat zwangere vrouwen hebben een andere reactie op dieet manipulation dan wordt gezien bij maagdelijke vrouwtjes.

Inleiding

Gaschromatografie (GC) is een gevestigde techniek voor de opname van vetzuren in aanvulling of fysiologische aandoeningen zoals obesitas (en verwante ziekten zoals diabetes) of zwangerschap ³ identificeren en kwantificeren in lipide zwembaden en celmembranen ^{1,2 - 5.} Het is ook geschikt voor het analyseren van de soorten en hoeveelheden van vetten in voedingsmiddelen. Dit is handig wanneer het karakteriseren van experimentele diëten, alsmede ervoor te zorgen dat de voedingsindustrie voldoet aan regelgeving. Zo kunnen GC worden gebruikt om de identiteit en hoeveelheid van vetzuren in een product, zoals een voedingssupplement bevestigen zodat etikettering juist is en regels worden nageleefd ^6,7. Analyse van vetzuren kan waardevolle inzichten in de vetstofwisseling in gezondheid en ziekte, de gevolgen van dieet te veranderen, en het effect van veranderingen in de fysiologische toestand ⁸ bieden. Gebruik van GC om monsters te bestuderen tijdens de zwangerschap is belangrijk verstrektinformatie over wijzigingen in vetzuur en complexe lipiden homeostase ^3.

Voorafgaand aan de chromatografische scheiding, worden meestal lipiden geëxtraheerd uit het monster met de oplosbaarheid van lipiden in oplosmiddelmengsels van chloroform en methanol. Natriumchloride wordt toegevoegd om de scheiding van het mengsel in waterige en organische fasen lipide bevattende ^9,10 vergemakkelijken. Complexe lipide klassen van belang kan uit het totale lipide extract gescheiden worden door vaste-fase-extractie (SPE). Deze scheidingstechniek spoelt lipide klassen op basis van hun polariteit of bindingsaffiniteit. Triacyglycerols (TAG) en cholesteryl esters (CE) eerst geëlueerd als een gecombineerde fractie verder klassen, fosfatidylcholine (PC), Fosfatidylethanolamine (PE) en niet-veresterde vetzuren (NEFA) worden geëlueerd door het verhogen van de polariteit van de loopvloeistof . De scheiding van TAG van CE maakt gebruik van de binding van TAG alleen voor een frisse SPE cartridgdge, waardoor CE worden geëlueerd. TAG kan vervolgens worden geëlueerd door het verhogen van de polariteit van het eluerende oplosmiddel ^9,10. Deze methode maakt meerdere monsters tegelijkertijd worden gescheiden met een hogere opbrengst dan wordt bereikt met dunnelaagchromatografie, waardoor relatief klein formaat monsters (bijv. <100 gl plasma of serum, <100 mg weefsel) kunnen worden geanalyseerd ^11,12.

GC is een gevestigde techniek voor het eerst beschreven in 1950, werd gesuggereerd dat de mobiele fase in het toen vloeistof-vloeistof systemen kunnen worden vervangen door stoom. Het werd aanvankelijk gebruikt voor de olie-analyse, maar snel uitgebreid naar andere gebieden, zoals aminozuur analyse en lipide biochemie, die nog steeds van groot belang. Vooruitgang in GC apparatuur en technologie, zoals de ontwikkeling van capillaire kolommen uit de eerder gebruikte gepakte kolommen heeft geleid tot de huidige technieken die vetzuren kunnen wordenefficiënter afgescheiden bij lagere temperaturen resulteert in GC wordt routinematig gebruikt om vetzuren in diverse onderzoeken ¹³ identificeren en te kwantificeren.

GC vereist vetzuren worden gederivatiseerd zodat zij voldoende vluchtig worden geëlueerd bij redelijke temperaturen zonder thermische ontleding kan worden. Meestal gaat de substitutie van een functionele groep die waterstof esters, thio-esters of amiden voor analyse vormen. Methylesters worden vaak bestudeerd derivaten die worden geproduceerd door methylering. In deze werkwijze de esterbindingen in complexe lipiden worden gehydrolyseerd tot vrije vetzuren, die transmethylated om vetzuurmethylesters (FAME) vormen loslaten. Het resulterende profiel van FAME, bepaald met GC, wordt aangeduid als de vetzuursamenstelling en kunnen gemakkelijk worden vergeleken tussen verschillende experimentele groepen ^9,10. De techniek kan zowel de verhoudingen van indiUAL vetzuren en hun concentraties te meten.

Naast het gebruik van GC te analyseren vetzuren in de voeding studies en in de voedingsmiddelenindustrie kan de techniek worden gebruikt in diverse analytische velden. Bijvoorbeeld, milieu-analyses met behulp van GC omvatten het meten van verontreiniging van het water door insecticiden en bodemanalyses meten chlorobenzeen inhoud. In toxiciteitsstudies, is GC ook gebruikt om illegale stoffen in urine en bloedmonsters van personen te identificeren, dergelijke sportprestaties versterkers ¹² en het vermogen om complexe mengsels van koolwaterstoffen te scheiden maakt deze techniek populair in de aardolie-industrie voor petrochemische analyse ^12.

Zwangerschap wordt geassocieerd met significante veranderingen in de vetzuursamenstelling van maternale weefsels, met name in het gehalte aan omega-3 (n-3) en omega-6 (n-6) poly-onverzadigde vetzuren acids (PUFA) ^3. In de huidige studie, illustreren wij het gebruik van GC in de meting van vetzuren door het beschrijven van het gebruik bij de analyse van de vetzuursamenstelling van leverweefsel genomen van ruwe en zwangere ratten laag en vetrijke diëten met verschillende oliebronnen. De experimentele diëten die hier waren een vetarm sojaolie gebaseerd dieet, een vetrijke soja-olie gebaseerde dieet (130,9 g totaal vet / kg totaal vet) of een vetrijke lijnzaad olie gebaseerde dieet (130,9 g totaal vet / kg dieet), voorzag in 20 dagen. De volledige voedingsstoffen en vetzuursamenstelling van deze diëten zijn eerder ¹⁴ beschreven. De sojaolie diëten rijk aan linolzuur (18:02 n-6) en bevatten enkele α-linoleenzuur (18:03 n-3) als de lijnolie dieet rijk aan α-linoleenzuur. Deze vetrijke diëten vertegenwoordigen verschillende rantsoenen linolzuur tot α-linoleenzuur (rantsoenen 8:01 en 1:01, respectievelijk). Werkwijze voor het isoleren van individuele lipideklassen en analyse door GC well vastgesteld en gevalideerd, en is eerder ^10, maar zonder de gedetailleerde technische beschrijving gevonden hierin gepubliceerd.

Protocol

1. Animal Procedures

1. Alle dierlijke werkzaamheden moeten in overeenstemming met het Home Office Dieren (Wetenschappelijke Procedures) Act (1986) worden uitgevoerd.
2. Mate Wistarratten 10 weken oud door monogame fokken jaar, en bevestig zwangerschap door de verschijning van een vaginale plug. Noteer dit als dag 1 van de dracht, en beginnen experimentele dieet. Voor maagdelijke vrouwtjes, huisvesten elke rat individueel, en beginnen experimentele dieet.
3. Na het voeden van de experimentele diëten gedurende 20 dagen euthanize ratten CO ₂ stikken gevolgd door cervicale dislocatie.
4. Gebruik dissectie tang en schaar om de buikholte bloot uitsnijden en de lever door het snijden van de banden, waarbij de lever sluiten op het membraan, voorste wand van de buik, maag en duodenum. Was de lever in PBS en bevriezen in vloeibare stikstof voor opslag bij -80 ° C.

2. Voorbereiding van een Total vetextract ⁹

1. Molecul toevoegenar zeven (in te vullen 1/10 van oplosmiddel container) om alle oplosmiddelen om 'droge' oplosmiddelen maken. Voer alle oplosmiddel werk in een zuurkast.
2. Snijd ongeveer 100 mg bevroren lever en weeg. Plaats het weefsel in een buis in een ijsemmer en voeg 0,8 ml ijskoud 0,9% NaCl. Homogeniseren het weefsel.
3. Voeg interne standaarden opgelost in 1 ml / mg droge chloroform: methanol (02:01, v / v) die gebutyleerd hydroxytolueen (BHT, 50 mg / l) als anti-oxidant. Voor 100 mg rattenlevers voeg 100 ug CE-norm (Cholesteryl heptadecanoate 17:00) Let op:. Chloroform en BHT zijn gevaarlijk.
4. Voeg 5,0 ml droge chloroform: methanol (02:01, v / v) bevattende BHT (50 mg / L).
5. Voeg 1,0 ml 1 M NaCl, meng goed door vortexen tot het mengsel ziet er uniform. Monsters kunnen worden afgesloten en bewaard bij -20 ° C in dit stadium tot een week.
6. Centrifugeer bij 1000 xg gedurende 10 min, vanaf remmen kamertemperatuur.
7. Verzamelen lagerfase met glazen Pasteur pipet nieuwe schroefdop glazen buis en droog onder stikstof bij 40 ° C. Monsters kunnen worden afgesloten en bewaard bij -20 ° C in dit stadium tot een week.

3. Scheiding van Lipid klassen door Solid Phase Extraction (SPE) ¹⁰

1. Sluit de SPE tank met een vacuümpomp en plaats aminopropyl silica SPE cartridge in de tank.
2. Plaats nieuwe schroefdop glazen buis gelabeld TAG en CE in de tank rack onder de kolom om eerste fractie te verzamelen.
3. Los de totale lipide-extract in 1,0 ml droge chloroform en vortex.
4. Solliciteer monster op de kolom met een glas Pasteur pipet en laat het door druppelen in de schroefdop buis onder zwaartekracht. Wanneer er geen verdere druppels vallen, verwijder de resterende vloeistof door vacuüm.
5. Elueer het TAG en CE fractie onder vacuüm was de kolom met 2 x 1,0 ml wassen droog chloroform.
6. Als alle vloeistof wordt verwijderd, droog de TAG en CE fracn onder stikstof bij 40 ° C. Monsters kunnen worden afgesloten en bewaard bij -20 ° C in dit stadium tot een week.
7. Plaats nieuwe schroefdop glazen buis gelabeld PC in de lade tank onder de kolom.
8. Elueer de PC fractie onder vacuüm onder toevoeging van 2 x 1,0 ml droge chloroform: methanol (60:40, v / v) totdat alle vloeistof uit de kolom verwijderd.
9. Verwijder droge PC fractie onder stikstof bij 40 ° C. Monsters kunnen worden afgesloten en bewaard bij -20 ° C in dit stadium tot een week.
10. Plaats een nieuwe schroefdop glasbuis benaming PE in de tank lade en elueer PE fractie onder toevoeging van 1,0 ml droge methanol onder vacuüm.
11. Verwijder droge PE fractie onder stikstof bij 40 ° C. Monsters kunnen worden afgesloten en bewaard bij -20 ° C in dit stadium tot een week.
12. Plaats nieuwe schroefdop glasbuis gelabeld NEFA in de tank lade en elueer NEFA fractie onder vacuüm door toevoeging van 2 x 1,0 ml wassingen droge chloroform: methanol: ijsazijn. (100:2:2, v / v / v) Let op: IJsazijn is gevaarlijk.
13. Verwijder de verzamelde NEFA fractie en droog onder stikstof bij 40 ° C. Monsters kunnen worden afgesloten en bewaard bij -20 ° C in dit stadium tot een week.
14. Plaats een nieuwe aminopropylsilicagel SPE-patroon op de SPE tank en plaats een schroefdop glazen buis in de tank bak onder de cartridge om afval op te halen.
15. Was de kolom met 3 wasbeurten van droge hexaan onder vacuüm en vervolgens een laatste 1,0 ml wasbeurt onder zwaartekracht. Sta niet toe dat de cartridge droog worden (draai de kolom cartridge kanalen naar een gesloten positie wanneer hexaan niveau ligt dicht bij de cartridge matrix). Let op: Hexaan is gevaarlijk.
16. Vervang afval buis met nieuwe schroefdop glazen buis label CE.
17. Los de droge TAG en CE fractie (bereid in stap 3,6) in 1,0 ml droog hexaan en vortex. Breng dit aan de kolom met behulp van een glas Pasteur pipet en laat het door een plasje water onder gravity.
18. Wanneer er geen verdere druppels vallen, verwijder de resterende vloeistof onder vacuüm.
19. Onder vacuüm was de kolom met 2 x 1,0 ml wassen droog hexaan CE en droge opgevangen fractie geëlueerd onder stikstof bij 40 ° C. Monsters kunnen worden afgesloten en bewaard bij -20 ° C in dit stadium tot een week.
20. Plaats nieuwe schroefdop glazen buis label TAG in de lade tank en elueren TAG met de toevoeging van 2 x 1,0 ml wasbeurten droge hexaan: methanol: ethylacetaat (100:5:5) onder vacuüm.
21. Droog opgevangen fractie onder stikstof bij 40 ° C. Monsters kunnen worden afgesloten en bewaard bij -20 ° C in dit stadium tot een week. Let op: Ethylacetaat is gevaarlijk.

4. Voorbereiding van FAME van CE ¹⁰

1. Voeg 0,5 ml droge tolueen aan de gescheiden CE-fractie (in stap 3.19 verzameld) en vortex. Let op: Tolueen is gevaarlijk.
2. Bereid methyleringsreagens (droge methanol met 2% (v/ V) H ₂ SO _4), waarvan 1,0 ml nodig per monster. Doseer volume droge methanol in glas of geschikte kunststof container met deksel en voeg de benodigde hoeveelheid H ₂ SO ₄ druppelsgewijs en meng door omkeren. Let op: Zwavelzuur is gevaarlijk.
3. Voeg 1,0 ml van het methyleringsmiddel het opgelost in droge tolueen monsters cap de buizen veilig en meng voorzichtig.
4. Verwarm de monsters gedurende 2 uur bij 50 ° C.
5. Na 2 uur verwijderen buizen van het vuur. Zodra koele voegen 1,0 ml neutraliserende oplossing (0,25 M _KHCO3 0.5mK ₂ CO ₃₎ Let op:. Kaliumbicarbonaat en kaliumcarbonaat zijn gevaarlijk.
6. Voeg 1,0 ml droge hexaan en vortex.
7. Centrifugeer bij 250 xg gedurende 2 minuten, vanaf remmen kamertemperatuur.
8. Verzamel bovenste fase, waarin de FAME bevat, en over in een nieuwe niet schroefdop wegwerp glazen buis.
9. Droog de verzamelde FAME onderstikstof bij 40 ° C. Monsters kunnen worden afgesloten en bewaard bij -20 ° C in dit stadium tot een week.

5. Verwijdering van gratis Cholesterol Verontreiniging door CE FAME ¹⁴

(Gratis cholesterol kan het monster besmetten; zie figuur 1 bijvoorbeeld gaschromatograaf sporen met en zonder vrije cholesterol te verwijderen).

1. Plaats een afval buis in SPE tank en plaats een silicagel SPE-patroon op de tank.
2. Waskolom met 3 x 1 ml wasbeurten droog hexaan onder vacuüm en 1 x 1 ml onder zwaartekracht.
3. Verwijder afval wast en voeg nieuwe afval buis in de tank.
4. Ontbinden CE FAME in 1 ml droge hexaan, vortex.
5. Breng de kolom onder toepassing van een glazen Pasteur pipet en doorlaten druppelt onder zwaartekracht.
6. Waskolom met 3 x 1 ml wasbeurten van hexaan onder vacuüm.
7. Verwijder afval wast en plaatst nieuwe niet schroefdop buis in de tank label CE FAME.
8. Elueren deCE FAME met 2 x 1 ml droge hexaan: diethylether (95:5 v / v) wasbeurten.
9. Droog onder stikstof bij 40 ° C. Monsters kunnen worden afgesloten en bewaard bij -20 ° C in dit stadium tot een week. Let op: Diethyl ether is gevaarlijk.

6. Overdracht van FAME in GC Auto Sampler Vial

1. Voeg 75 ul droog hexaan om te proeven, vortex, en over te dragen aan een GC auto monsterflesje.
2. Voeg een verdere 75 pl droog hexaan om te proeven, vortex en transfer naar dezelfde GC auto monster flesje. Monsters kunnen worden afgesloten en bewaard bij -20 ° C in dit stadium tot een maand.

7. Analyse met behulp van de gaschromatograaf ¹⁴

1. Analyseer FAME op een gaschromatograaf. Voorbeeld opgezet: 30 mx 0,25 micrometer x 0.25 mm BPX-70 fused silica capillaire kolom met de temperatuur protocol:
   Begintemperatuur 115 ° C, bezit 2 min, helling 10 ° C / min tot 200 ° C, houdt 18,5 min, helling 60 ° C / min tot 245 ° C, houd 4 min.
   Column: Helium gas, debiet 1,0, druk 14.6 en snelheid 29.
   Injector: Temperatuur = 300 ° C.
   Detector: Waterstof stroom 40.0, luchtstroom 184.0, make-up gas Helium, stromen 45.0, temperatuur = 300 ° C.
2. Stel splitsingsverhouding zo nodig (bv. 25:1 voor CE FAME-analyse).
3. Bepaal het oppervlak onder elke piek met behulp van de juiste software en identificeren van FAME in vergelijking met normen. Zie Figuur 2 bijvoorbeeld chromatogrammen.
4. Gebruik het oppervlak van de piek gegevens aan de bijdrage van individuele vetzuren als percentage van de totale vetzuren berekenen.
5. Bereken absolute concentraties van vetzuren door het gebied van de interne standaard te delen door de hoeveelheid toegevoegd. Verdeel het gebied van elk vetzuur van dit resultaat absolute concentraties van elk vetzuur in de hoeveelheid gebruikte weefsel vinden.

Resultaten

Het succes van deze werkwijze afhankelijk volgens het protocol nauwkeurig en met schoon oplosmiddelen en reagentia om ruis en verontreinigingen die kunnen optreden op een chromatogram verminderen. Vervuilde monsters zijn uitdagender om te analyseren, het verlagen van de juistheid van de oppervlakte onder de curve berekeningen. Als het protocol succes volgt een chromatogram met duidelijke symmetrische, goed gedefinieerde pieken en met minimale achtergrondruis te worden verkregen zoals weergegeven in figuur 3.

Discussie

Gaschromatografie is een nauwkeurige techniek te gebruiken voor vetzuuranalyse en de hoge reproduceerbaarheid acht deze techniek in klinische analyses. Geschikte GC kolommen worden gebruikt voor identificatie van vetzuren plaats mogelijk, met beschikbare kolommen met variaties in de polariteit van de stationaire fase, kolomlengte en binnendiameter. Het gebruik van een gesmolten silica capillaire kolom in deze analysemethode biedt goede thermische stabiliteit en een hoge reproduceerbaarheid van de retentietijden door zij...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Methanol	Fisher Scientific	M/4056/17	'VOORZICHTIG' Dampen - HPLC kwaliteit
Chloroform	Fisher Scientific	C/4966/17	'VOORZICHTIG' Dampen - HPLC kwaliteit
BHT	Sigma- Aldrich	W218405	'VOORZICHTIG' Stof en dampen - Watervrij
NaCl	Sigma- Aldrich	S9888	Watervrij
Hexaan	Fisher Scientific	H/0406/17	'VOORZICHTIG' Dampen - HPLC kwaliteit
Glacial azijnzuur	Sigma- Aldrich	695084	'VOORZICHTIG' Brandwonden - 99.85%
Zwavelzuur	Sigma- Aldrich	339741	'VOORZICHTIG' Brandwonden - 99.999%
Kaliumcarbonaat	Sigma- Aldrich	209619	99% ACS Reagens kwaliteit
Kaliumbicarbonaat	Sigma- Aldrich	237205	99.7% ACS Reagens kwaliteit
Ethylacetaat	Fisher Scientific	10204340	'VOORZICHTIG' Dampen - 99+% GLC Gespecificeerd
Tolueen	Fisher Scientific	T/2300/15	'VOORZICHTIG' Dampen
Di-ethylether	Sigma- Aldrich	309966	'VOORZICHTIG' Dampen
Stikstof (zuurstof vrij) cilinder	BOC	44-w	'VOORZICHTIG' Gecomprimeerd gas - explosie risico
Aminopropyl silica SPE cartridges	Agilent	12102014	Cartridge - Kraal massa 100 mg
Silica gel SPE cartridges	Agilent	14102010	Cartridge - Kraal massa 100 mg
Molecuulaire zeefjes	Sigma- Aldrich	334324	Pellets, AW-300, 1.6 mm
Pasteur pipetten van glas	Fisher Scientific	FB50251