Deze video toont twee modellen van intima plaque ontwikkeling in muizen slagaders en benadrukt de verschillen in myointimal hyperplasie en atherosclerose.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Inducerende Myointimal Hyperplasie Versus atherosclerose in Muizen: Een inleiding van twee geldige Models
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Diverse in vivo laboratorium knaagdiermodellen voor de inductie van slagader stenose zijn ingesteld om ziekten die arteriële plaque vorming en vernauwing bevatten zoals waargenomen bijvoorbeeld ischemische hartziekte nabootsen. Twee zeer reproduceerbaar muismodellen - zowel resulterend in stenose, maar elke onderliggende waarde een andere weg van ontwikkeling - worden hier geïntroduceerd. De modellen zijn de twee meest voorkomende oorzaken van stenose; namelijk een muismodel voor elke myointimal hyperplasie, en atherosclerose worden getoond. Om myointimal hyperplasie, wordt een ballonkatheter letsel van de abdominale aorta uitgevoerd. Voor de ontwikkeling van atherosclerotische plaque, het ApoE - / - is muismodel combinatie met westerse vet dieet gebruikt. Verschillende model aangepast opties voor het meten en evalueren van de resultaten worden genoemd en beschreven in dit manuscript. De introductie en de vergelijking van deze twee modellen biedt information voor wetenschappers om de juiste slagader stenose model overeenkomstig de wetenschappelijke vraag kiezen.
Inleiding
In geïndustrialiseerde landen blijft ischemische hartziekten een belangrijke oorzaak van sterfte 1. De oorzaken voor coronaire stenose zijn legio en omvatten myointimal hyperplasie evenals atherosclerose, met revascularisatie resterende de meest voorkomende behandeling strategie 2. Onderzoek modellen duidelijk onderscheid tussen de mechanistische paden van intimale hyperplasie en atherosclerose zijn essentieel voor de pathobiological en pathofysiologische processen arteriële plaque ontwikkeling te onderzoeken. In deze video twee verschillende muismodellen gebruikt om ofwel de ontwikkeling van myointimal hyperplasie of atherosclerose te bestuderen worden geïntroduceerd.
Myointimal hyperplasie wordt verondersteld te vormen via de "responstijd naar schade" paradigma oorspronkelijk beschreven voor atherosclerose 3. De mechanische verstoring van de endotheliale laag leidt tot een intensieve verbouwing versterkt door paracriene effecten. Er zijn verschillende different diermodellen vaak gebruikt om myointimal hyperplasie studeren. Sommige groepen gebruiken dan metaal in de omhooggaande aorta van ratten 4. De aorta erosie model uitgevoerd met een ballonkatheter wordt ook vaak gebruikt in laboratoriumratten 5,6. De intima hyperplasie model uitgevoerd in het laboratorium muizen 7 implementeert ligatie van de halsslagader en induceert myointimal laesies 8. In ons laboratorium, de abdominale aorta erosie model - evenals een gehumaniseerd stent restenose model 9 worden algemeen gebruikt - de ontwikkeling van myointimal hyperplasie bestuderen. Deze video benadrukt dat het kiezen van de juiste experimentele diermodel is cruciaal voor mechanistische of pathofysiologische studies van arteriële stenose.
Myointimal hyperplasie modellen moeten worden onderscheiden van atherosclerose modellen. Voor deze laatste, apolipoproteïne E deficiënte (ApoE - / -) muizen worden in combinatie met westerse dieet vaak gebruikt om atheroscl inducerenerotische laesies 10,11,12,13. Voorbeelden voor de inductie van beide soorten myointimal ziekte bij muizen hier, samen met verschillende model aangepast opties vat stenose 14 te analyseren.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle dierlijke werkzaamheden moeten worden uitgevoerd volgens relevante richtlijnen verzorging van dieren. Verkrijgen institutionele goedkeuring voor dierlijke werk vóór begin protocol.
1. Myointimal Hyperplasia Model (A)
Voor de intima hyperplasie model, kopen C57BL/6J (Voorraad nummer 000664, C57BL/6J) muizen op de leeftijd van 8 weken met een gewicht van ongeveer 25 g. Huis muizen voor deze experimenten onder gebruikelijke voorwaarden; voeden standaard muis muizen chow en bieden water ad libitum.
- Muis voorbereiding: Introduceer de muis om een verdoving staat met isofluraan (2%) gebruik van een inductie kamer.
- Verwijder de buik haar met een tondeuse, leg de muis op zijn rug en ter dekking van zijn neus en mond met het gezichtsmasker om de narcose te verzekeren.
- Met Provo-Jodium, ontsmet de buikstreek universeel, gevolgd door 80% ethanol, in twee cycli.
- Zorgen voor de afwezigheidvan reflexen door te knijpen de achterste ledematen om de voldoende diepte van de anesthesie te monitoren.
- Scheid de huid en spieren langs de linea alba in twee stappen om de buikorganen bloot.
- Leg de darmen in een zoutoplossing gehydrateerd handschoen. Wikkel de handschoen rond de darmen om ze vochtig te houden.
- Aandachtig duidelijk het vetweefsel bevloering de abdominale aorta weg. Expose de infrarenale aorta tot zijn vertakking, het verzorgen elke tak schepen niet te verwonden.
- Plaats eerst een microchirurgische klem op de proximale, infrarenale aorta het afsluiten van de bloedstroom. Nu, breng dan een tweede distale klem naast de aortabifurcatie.
- Wanneer de bloedstroom wordt onderbroken, een kleine incisie in de aorta dicht bij het proximale klem.
- Plaats de ballon-katheter, die is bevochtigd met 0,9% zoutoplossing en vooruit naar het distale klem van de aorta.
- Voor endotheelschade, beroven de aorta door het opblazen van de balloon voorzichtig en langzaam trekken van de katheter in de richting van het proximale klem.
- Herhaal de denudatie manoeuvre tweemaal.
- Verwijder de katheter en sluit de aorta incisie met 10-0 Prolene lopen hechtingen.
- Open de distale klem voorzichtig. In geval van een bloeding op de aortotomy plaats, sluit de klem weer, zoek het bloeden en zet extra onderbroken steken, als dat nodig is.
- Als er geen bloeden kan worden waargenomen, opent u langzaam de proximale klem.
- Een aorta-puls moet distaal zichtbaar vanaf de incisie. Nu de darmen kan worden geregeld terug in situ.
- Spoel de buikholte gebruik voorverwarmde steriele zoutoplossing.
- Sluit de buikwand te beginnen met de spierlaag behulp 6-0 Prolene lopen hechtingen.
- Vervolgens wordt de huid aan te passen bij het gebruik van 5-0 prolene uitvoeren van lopende hechtingen.
- Gedurende de tijd dat de muis nog verdoofd toepassing 4-5 mg / kg Carprofen via een subcutane injectie.
- Voeg Metamizol aan het drinkwater (50 mg Metamizol per 100 ml) voor pijnbestrijding en verder gedurende 3 dagen na de operatie. Monitor dier gedurende herstel.
Opmerking: De observatieperiode voor dit model is 28 dagen.
2. Atherosclerose Model (B)
Voor de atherosclerose model, kopen apolipoproteïne E deficiënte (ApoE - / -) muizen (Voorraad nummer 002052, B6.129P2-Apoetm1Unc / J) op een leeftijd van 4 weken, en vervolgens gevoed voor 4-6 maanden. Huis muizen voor deze experimenten onder gebruikelijke voorwaarden; voeden muizen hoge lipide westerse dieet bij aankomst (Harlan Laboratories TD.88137) en zorgen voor water ad libitum voor een duur van 4 tot 6 maanden.
- Muis voorbereiding:
- Voeden de ApoE - / - muizen met westerse dieet te beginnen bij 4 weken oud. Dieetmanipulatie moeten rechtstreeks beginnen bij aankomst.
- Handhaaf westerse dieet gedurende de duur van het experiment.
3. Analyse
- Myointimal hyperplasie model (A)
Het gebied van belang in dit model is het "beschadigde oppervlak". Opties voor analyse omvatten luminale vernietiging, I / M-verhouding (intima / media verhouding), maximale myointima dikte myointimal gebied Trichrome kleuring voor fibrose, en H & E kleuring van mononucleaire cellen (zoals weergegeven in figuren 1A-1C). Volgens de wetenschappelijke vraag talrijke andere kleuringen zoals Picrosirius rood voor collageen, immunohistochemie en confocale werkwijzen kunnen worden toegepast. - Atherosclerose model (B)
De gebieden van belang in dit model zijn de aortaklep, de aortaboog en de dalende aorta. Opties voor analyse: Soedanrood kleuring voor lipiden en trichroomkleuring van de aortaklep, de aortaboog en de dalende aorta (zie figuur 1D).
Dit model levert ook een verscheidenheid aan andere vlekken opties zoalsbijvoorbeeld Oil Red O voor neutrale lipiden, Picrosirius rood, immunohistochemie, en confocale methoden.- Soedan rode vlekken: Voer de Soedan rode vlekken op vers geoogste aortaweefsel.
- Verwijder de voeding 6h voor de oogst.
- Introduceer de muis om een verdoving staat met isofluraan (2%) met behulp van een inductie kamer. Verzekeren de afwezigheid van reflexen door te knijpen de achterste ledematen om de voldoende diepte van de anesthesie te monitoren.
- Open de kist; afgesneden van de apex van het hart en perfuseren via de linker ventrikel, eerst met zoutoplossing (3 ml), gevolgd door 4% PFA (3 ml) via de aortawortel de aorta vast.
- Bevrijd de aorta van de wortel naar de splitsing. Probeer om vetweefsel te verwijderen zoveel mogelijk.
- Snijd het hart en de aorta wortel, en bewaar ze in 4% PFA voor histologie.
- Voor histologie de aortawortel dient zorgvuldig in paraffine blok geplaatst in een rechtopstaande positie op het uitsnijden van de aor toestaantic wortel genereren dia's die alle 3 valvulaire folders weer te geven.
- Snijd het ene uiteinde van de aorta boom en zet hem op de siliconenlaag met fijne pennen. Open de aorta lengterichting en bevestig de aorta weefsel.
- Spoel het weefsel met 50% ethanol. Dompel het weefsel met Sudan III kleuring oplossing voor ongeveer 15 minuten.
- Licht spoelen met 50% ethanol om het overtollige Soedan III te verwijderen. (Let op: 50% ethanol kan de kleurstof weg te wassen.) Spoel met dH 2 O, en foto's te nemen voor verdere analyse.
- Soedan rode vlekken: Voer de Soedan rode vlekken op vers geoogste aortaweefsel.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Figuur 1 toont de verschillende analyse-opties en de geïnduceerde ziekte staat voor beide modellen. Voor de intima hyperplasie model, is de analyse van representatieve dwarsdoorsneden in trichroomkleuring getoond. Uit deze dwarsdoorsneden, kunnen de resultaten zoals I / M-verhoudingen, maximaal plaquedikte maximale dikte van de intima in de lumen luminale vernietiging in procenten, en plaque ruimte worden gemeten en berekend.
Om de resultaten van de atherosclerose model eval...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Hoewel beide ziekten daarmee soortgelijke symptomen bij de patiënt, de onderliggende mechanismen van plaque ontwikkeling en derhalve de behandeling benaderingen erg verschillend 2. In verschillende vormen van arteriële stenose klinische bevindingen bij de patiënten en de looptijd van plaqueontwikkeling afhankelijk van het onderliggende mechanisme.
Afhankelijk van de klinische bevindingen in de patiënt moeten verschillende methoden monsteranalyse worden uitgevoerd 5,15. ...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
De auteurs danken Christiane Pahrmann voor technische ondersteuning. SS ontving gelden van de Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) (SCHR992/3-2 en SCHR992/4-2).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Thyoglycollate Broth 3% | Fluka | 70157 | poeder |
| PFA 4% | Electron Microscopy Sciences | #157135S | 20% |
| Sudan III kleuringsoplossing | Sigma Aldrich | S4131 | poeder |
| muis C57BL/6J | Jackson Laboratories | Stock # 0006664 | |
| muis ApoE -/- | Jackson Laboratories | Stock #002052 | |
| Western Dieet | Harlan Laboratories | TD.88137 | |
| haartrimmer | WAHL | 8786-451A ARCO SE | |
| Forene | Abbott | Isofluraan | |
| microchirurgische klem | Fine Science Tools | 18055-04 | Micro-Serrefine - 4 mm |
| klem applicator | Fine Science Tools | 18056-14 | |
| katheter | |||
| 10-0 proleennaad | Ethicon | 788G | |
| 6-0 proleennaad | Ethicon | 8709H | |
| 5-0 proleennaad | Ethicon | EH7229H | |
| Rimadyl | Pfizer | Carprofen | |
| Metacam 1,5 mg/ml | Boehringer Ingelheim | Metamizol |
Referenties
- Manuel, D. G., Leung, M., Nguyen, K., Tanuseputro, P., Johansen, H. Burden of cardiovascular disease in Canada. Can J Cardiol. 19, 997-1004 (2003).
- ER, O. B., Ma, X., Simard, T., Pourdjabbar, A., Hibbert, B. Pathogenesis of neointima formation following vascular injury. Cardiovasc Hematol Disord Drug Targets. 11, 30-39 (2011).
- Ross, R. The pathogenesis of atherosclerosis: a perspective for the 1990s. Nature. 362, 801-809 (1993).
- Meng, X., Zhang, F., Valji, K., et al. Ultrasound guidance for the creation of a small animal model of aortic injury. J Vasc Interv Radiol. 22, 1193-1197 (2011).
- Deuse, T., Koyanagi, T., Erben, R. G., et al. Sustained inhibition of epsilon protein kinase C inhibits vascular restenosis after balloon injury and stenting. Circulation. 122, 170-178 (2010).
- Schrepfer, S., Deuse, T., Sultan, K. R., et al. Inhibition of restenosis development after mechanical injury: a new field of application for malononitrilamides. Cardiology. 108, 128-137 (2007).
- Tao, M., Mauro, C. R., Yu, P., et al. A simplified murine intimal hyperplasia model founded on a focal carotid stenosis. Am J Pathol. 182, 277-287 (2013).
- Kumar, A., Lindner, V. Remodeling with neointima formation in the mouse carotid artery after cessation of blood flow. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 17, 2238-2244 (1997).
- Hua, X., Deuse, T., Michelakis, E. D., et al. Human internal mammary artery (IMA) transplantation and stenting: a human model to study the development of in-stent restenosis. J Vis Exp. , 3663(2012).
- Daugherty, A., Whitman, S. C. Quantification of atherosclerosis in mice. Methods Mol Biol. , (2003).
- Nakashima, Y., Plump, A. S., Raines, E. W., Breslow, J. L., Ross, R. ApoE-deficient mice develop lesions of all phases of atherosclerosis throughout the arterial tree. Arterioscler Thromb. 14, 133-1340 (1994).
- Zhang, Y., Li, L., You, J., Cao, J., Fu, X. Effect of 7-difluoromethyl-5, 4'-dimethoxygenistein on aorta atherosclerosis in hyperlipidemia ApoE(-/-) mice induced by a cholesterol-rich diet. Drug Des Devel Ther. 7, 233-242 (2013).
- Rudolph, T. K., Rudolph, V., Edreira, M. M., et al. Nitro-fatty acids reduce atherosclerosis in apolipoprotein E-deficient mice. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 30, 938-9345 (2010).
- Rondelet, B., Kerbaul, F., Motte, S., et al. Bosentan for the prevention of overcirculation-induced experimental pulmonary arterial hypertension. Circulation. 107, 1329-1335 (2003).
- Zeibig, S., Li, Z., Wagner, S., et al. Effect of the oxLDL binding protein Fc-CD68 on plaque extension and vulnerability in atherosclerosis. Circ Res. 108, 695-703 (2011).
- Painter, T. A. Myointimal hyperplasia: pathogenesis and implications. 2. Animal injury models and mechanical factors. Artificial organs. 15, 103-118 (1991).
- Nitschke, Y., Weissen-Plenz, G., Terkeltaub, R., Rutsch, F. Npp1 promotes atherosclerosis in ApoE knockout mice. Journal of cellular and molecular. 15, 2273-2283 (2011).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
