Methodenartikel

High Yield Zuivering van

25.2K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/51590

⸱

17 juli 2014

 ,  , 
1Division of Infection and Immunity, Walter and Eliza Hall Institute of Medical Research, 2Department of Medical Biology, University of Melbourne

In dit artikel

Samenvatting

Het meten van antilichaam-functie is de sleutel tot het begrijpen van immuniteit tegen Plasmodium falciparum malaria. Deze methode beschrijft de zuivering van levensvatbare merozoïeten en meting van opsonisatie-afhankelijke fagocytose door flowcytometrie.

Samenvatting

Plasmodium falciparum merozoite antigenen zijn in ontwikkeling als potentiële malariavaccins. Een aspect van immuniteit tegen malaria de verwijdering van vrije merozoïeten uit het bloed door fagocytische cellen. Echter bepaling van de functionele werkzaamheid van merozoïet specifieke opsoniserende antilichamen uitdaging vanwege de korte halfwaardetijd van merozoïeten en de variabiliteit van primaire fagocyten. Hierin in detail beschreven is een werkwijze voor het levensvatbare merozoites met de E64 proteaseremmer en een test van merozoïet opsonine-afhankelijke fagocytose met de pro-monocytische cellijn THP-1. E64 voorkomt schizont breuk terwijl de ontwikkeling van merozoïeten die vrijkomen door filtratie van de behandelde schizonten. Ethidiumbromide gemerkte merozoites worden geopsoniseerd met humaan plasma en toegevoegd aan THP-1-cellen. Fagocytose wordt beoordeeld door een gestandaardiseerd high throughput protocol. Levensvatbare merozoïeten zijn een waardevolle bron voor de beoordeling numerlende aspecten van P. falciparum biologie, met inbegrip van de beoordeling van het immuunsysteem. Antilichaam niveaus gemeten van deze assay worden geassocieerd met klinische immuniteit tegen malaria in natuurlijke blootgestelde individuen. De test kan ook van nut zijn voor de beoordeling van antistoffen op.

Inleiding

Het belang van antilichamen voor immuniteit tegen Plasmodium falciparum malaria werd 40 jaar geleden, toen immunoglobuline van hyperimmuun volwassenen werd passief overgedragen aan kinderen met ernstige malaria resulteert in verminderd ziekte 1 getoond. Derhalve is aanzienlijke inspanning getracht doelstellingen van beschermende immuniteit malaria identificeren, meestal door meten antistoftiters tegen peptiden of bacterieel tot expressie gebrachte eiwitten door ELISA. ELISA gebaseerd serologie heeft ook bewezen zeer variabel tussen studies, en niet antilichaam functionaliteit 2 pakken. Veel malaria antigenen induceren een cytofiele IgG1 en IgG3 antilichaam profiel, met name merozoieten oppervlakte-antigenen 3. Deze subklasse vooroordeel suggereert dat antilichaam-Fc-receptor (FcR) interacties met fagocyten zijn belangrijk voor de effectorfuncties van opsoniserende antilichamen antimerozoite 4. Verschillende merozoite antigeen vaccins in ontwikkeling zijn ontworpenontlokken fagocytensysteem effector functies 5, 6 en hoewel significant bewijs voor het belang van antilichaam-FcR interacties in modellen van knaagdieren malaria bestaat 7-9, en een paar recente studies ondersteunen het belang van functionele antilichamen en fagocytensysteem effector functies immuniteit voor malaria bij de mens 10, 11, dit gebied nog onvoldoende bestudeerd. Onderzoek naar merozoite specifieke opsoniserende antilichamen is beperkt door twee factoren; de moeilijkheid om goede kwaliteit merozoïeten; en variabele fagocytose reacties van primaire cellen.

Tot voor kort werden hoge snelheid centrifugeren of Percoll dichtheidsgradiënten gebruikt om merozoïeten isoleren van kweeksupernatanten van scheuren schizont culturen. Deze merozoïeten waren zelden haalbaar, en vaak verder gemanipuleerd door dichtheidscentrifugatie en meerdere wassen stappen 12, of cryopreservatie 11 voor gebruik in testen. Deze processes potentieel los vele perifeer geassocieerde eiwitten uit de merozoieten oppervlak Proteïnen, die antigene doelen van malaria-immuniteit 13 zijn. Onlangs is gebruikt de cysteine ​​proteaseremmer trans-Epoxysuccinyl-L-leucylamido (4-guanidino) butaan (E64) aan gezonde merozoites genereren. E64 voorkomt schizont breuk genereren membraan ingesloten merozoites 14, die kan worden verstoord door filtratie levensvatbare merozoites 15, 16 bevrijden. Deze techniek heeft geleid tot de ruimtelijke resolutie van talrijke eiwitten in erytrocyten invasie 15, 17-19 en heeft het stadium specifieke werking van verschillende antimalariamiddelen 16, 20 verduidelijkt. De generatie van levensvatbare merozoites blijft technisch uitdagend. Om te helpen bij de verspreiding van deze techniek en toepassing op functionele testen van de immuniteit, een gedetailleerd protocol voor levensvatbare merozoite zuivering en het gebruik ervan in eengestandaardiseerde functionele test van antilichaam: cellulaire samenwerking in opsonisatie en fagocytose wordt hier beschreven.

Deze techniek laat een significante verbetering ten opzichte van eerdere in vitro testen van merozoite opsonisatie, zoals neutrofielen ademhalingsuitbarsting, Antibody Dependent Cellular Remming (ADCI), en alternatieve merozoite fagocytose assays. Deze testen zijn slecht reproduceerbaar door variatie in parasiet ingangen en de activiteit van primaire fagocytische cellen 11, 21. Verontreinigende hemozoin kan ook een diepgaand effect fagocytensysteem functie 22. Een onlangs gemeld robuuste en reproduceerbare merozoite fagocytose assay 23 maakt gebruik van de promonocytische cellijn THP-1 24. Dit is een ideale celtype voor hoge doorvoer flowcytometrie testen zoals het niet-hechtend en specifiek voert Fc-receptor bemiddelde fagocytose 25, 26. Een extra complexiteit, terwijl investeerderstigating fagocytose is dat de mate van fagocytose is afhankelijk van het aantal merozoites opzichte van THP-1-cellen en plasmaconcentratie. Om reproduceerbaarheid tussen experimenten te waarborgen, moet merozoites worden opgesomd en een gedefinieerde concentratie gebruikt. Door hun kleine formaat, stroomcytometrische kwantificering is vereist.

De hier beschreven procedure verwijdert hemozoin en genereert levensvatbare merozoïeten, en beschrijft een toepassing van deze merozoïeten voor flowcytometrische telling van merozoïeten gevolgd door opsonisatie en fagocytose. Hoewel technisch veeleisende, kan de beschreven technieken handig zijn bij het ophelderen van de bijdrage van merozoite oppervlak specifiek antilichaam reacties op natuurlijk verworven en vaccin-geïnduceerde immuniteit.

Protocol

Opmerking: Alle handelingen, behalve centrifugeren en flowcytometrie, worden in een laminaire stroming kap uitgevoerd om steriliteit te handhaven. Zorg voor een goede voorzorgsmaatregelen worden genomen met betrekking tot de behandeling van menselijke monsters. De test is zeer gevoelig voor kleine hoeveelheden plasma. De verdunningen voorzien zijn optimaal voor het oplossen van reacties variërend 5-78% met een plasma van semi-immune kinderen uit Papoea-Nieuw-Guinea (PNG). De optimale verdunning kan variëren plasma sets getest, en daarom wordt aanbevolen dat plasma worden getitreerd om experimentele omstandigheden voor elke toepassing bepaald. Zorg ervoor dat de opname van 2 negatieve controles THP-1 cellen met merozoïeten in afwezigheid van plasma; en THP-1 cellen met merozoïeten opsonized met een pool van plasma van malaria naïeve individuen. Dit zal de controle zorgen voor merozoite naleving van THP-1-cellen en strenge flow cytometrie venstertijd van fagocytose evenementen mogelijk te maken.

Het gebruik van PNG plasmamonstersgoedgekeurd door de Medical Research Advisory Committee, Papoea-Nieuw-Guinea ministerie van Volksgezondheid, het Walter en Eliza Hall Institute Human Research Ethics Committee (projectnummer 04/04). Schriftelijke toestemming is verkregen van de ouders / verzorgers van alle deelnemers.

1. THP-1 Cultuur

  1. Handhaaf de menselijke monocytische cellijn THP-1 in RPMI-1640 medium aangevuld met 10% foetaal kalfsserum (FCS) en 55 uM 2-mercapthoethanol (THP-1 medium) en bij 37 ° C in een 5% CO2 bevochtigde incubator.
  2. Handhaaf cellen bij een dichtheid lager dan 5 x 10 5 cellen / ml. OPMERKING: Overgroei zal leiden tot differentiatie in hechtende cellen en down-regulatie van Fc-receptoren. Zodra cellen zijn ongeveer al gepasseerd 10 keer, ontdooien een nieuwe flacon naar cel fenotype behouden.

2. Antilichaammonster Voorbereiding en verdunning

  1. Warmte geïnactiveerd plasma worden getest en malaria-naïeve controle plasma door incubatie bij 56 °; C gedurende 30 min
  2. In serie verdunde plasmamonsters tot 1/2, 000 in THP-1 medium.
  3. WINKEL verdund plasma bij -20 ° C.

3. Cultuur van hoogst Synchronized P. falciparum

OPMERKING: De GFP-expressie parasiet lijn D10-PfPHG 27 werd gebruikt vanwege zijn 48 uur levenscyclus die synchronisatie van parasieten en gecontroleerde timing van E64 toevoeging helpt. Bovendien, omdat deze lijn uitdrukt GFP in het cytosol, deze lijn maakt de ontdekking van parasitemie en gratis merozoïeten door flowcytometrische detectie van GFP. De GFP-fluorescentie-intensiteit niet voldoende om visualisatie verlenen in THP-1-cellen, en daarom zijn merozoites tegengekleurd met ethidiumbromide (EtBr). Andere parasiet stammen kunnen worden gebruikt, mits strakke synchronie haalbaar. Synchroniseer parasieten met behulp van een combinatie van sorbitol behandeling rijpe vormen 28 en heparine lyseren invasie 15 remmen .

  1. Handhaven P. falciparum parasieten in O + menselijke erythrocyten (RBC) en 3% hematocriet in RPMI-1640-medium (pH 7,4) gesupplementeerd met 25 mg / ml HEPES, 50 ug / ml hypoxanthine, 10% gemengd menselijk serum, 2 mg / ml natriumbicarbonaat, en 20 ug / ml gentamycine (Parasite gemiddeld). Voeg 5 mg / ml blasticidine S-hydrochloride aan het kweekmedium om te selecteren op GFP + parasieten.
  2. Incubeer culturen in luchtdichte dozen of als alternatief dubbele verzegelde kweekflessen bij 37 ° C in een atmosfeer van 1% O 2, 4% CO2 en 95% N2.
  3. Bereid dun uitstrijkje dia's, op te lossen in 100% methanol gedurende 10 seconden, en de vlek met 10% Giemsa oplossing in 6,7 mM (pH 7,1) fosfaatbuffer (Giemsa-oplossing) voor 10 min naar parasitemia controleren. Na het kleuren, afspoelen glijbaan in het water en de lucht drogen. Beoordelen parasitemia met een 100X olie-immersie lens.
  4. Handhaaf parasiet culturen op een parasitemia minder dan 5% geïnfecteerde RBC door het splitsen van culturen en het toevoegen van niet-geïnfecteerdeRBC zoals vereist.
  5. Om te synchroniseren met heparine, voeg 20 IU / ml van medische kwaliteit heparine aan culturen stadium rinkelen.
  6. Wanneer de meeste parasieten zijn op schizontstadium stadium pellet cellen bij 300 g gedurende 5 minuten, verwijder-heparine bevattend medium en resuspendeer in parasiet medium tot schizont scheuren en merozoite invasie mogelijk.
  7. Na 4 uur, voeg 20 IU / ml heparine terug naar culturen, het blokkeren van elke verdere merozoite invasie. OPMERKING: Verschillende cycli van sorbitol en heparine behandeling noodzakelijk zijn voordat parasieten voldoende worden gesynchroniseerd. Om geschikte aantallen merozoïeten genereren, voor te bereiden 150 ml parasiet cultuur bij 3-5% parasitemie.

4. Isolatie van Late Stage P. falciparum Trofozoïeten

  1. Zesendertig uur na terugkeer heparine culturen, pellet gekweekte cellen bij 300 g gedurende 5 minuten en resuspendeer pellet in parasiet medium bij 25% hematocriet.
  2. Bevestig een grote magnetische kolom (matrix volume van 6,3ml) aan een magneet en equilibreer de kolom met parasiet medium, zorg ervoor dat alle luchtbellen zijn verwijderd.
  3. Voeg de geresuspendeerd P. falciparum cultuur aan de kolom, en pas debiet tot een druppel per sec.
  4. Zodra cultuur is gepasseerd door de kolom Was de kolom met parasiet medium totdat de doorstroming helder is.
  5. Elueer parasieten van de kolom in 30 ml 37 ° C parasiet medium.
  6. Bereid een dun uitstrijkje van parasieten, vast te stellen in 100% methanol gedurende 10 seconden, en kleuren met Giemsa oplossing gedurende 3 minuten. Onderzoek de schuif onder de microscoop, en ervoor zorgen dat parasieten bijna vullen de rode bloedcellen, en lijken te zijn in de vroege stadia schizont. Als de parasieten de juiste rijping stadium nog niet hebben bereikt, weer gezuiverd parasieten om een 37 ° C incubator in een atmosfeer van 1% O 2, 4% CO2 en 95% N2 tot voldoende ontwikkeld. NB: De zuiverheid van meer dan 90% geïnfecteerde rode bloedcellen moet R waarborgenBCs niet verontreinigen merozoite preparaten.
  7. Behandel geïsoleerd schizonten met 10 uM E64 (Epoxysuccinyl-L-leucylamido (4-guanidino) butaan (E64) voor 6 - 10 uur. OPMERKING: Langere incubatietijden met E64 zijn mogelijk, maar de geproduceerde merozoites niet langer invasief.

5. Isolatie van P. falciparum merozoïeten

  1. Na incubatie met E64, smeren parasieten, repareren cellen in 100% methanol en vlek met Giemsa oplossing voor de vorming van membraan-omsloten merozoites beoordelen. OPMERKING: Een goede opbrengst van merozoïeten zal worden verkregen, indien groter dan 50% van de parasieten membraan omsloten merozoites hebben gevormd.
  2. Pellet E64 behandelde schizonten bij 1900 xg gedurende 8 minuten. Wassen met 50 ml RT RPMI-1640-medium (pH 7,4) gesupplementeerd met 25 mg / ml HEPES, 50 ug / ml hypoxanthine, 2 mg / ml natriumbicarbonaat, en 20 ug / ml gentamycine (wasmedium) resterende humaan serum verwijderen .
  3. Resuspendeer de pellet in 2 ml wasmedium. OPMERKING: Het gebruik van FCS-bevattende THP-1 media zal produceren schuimvorming tijdens filtratie.
  4. Filter de 2 ml geresuspendeerde E64-schizonten via een 1,2 mm μm/32 spuit filter. Verzamel het filtraat in een 10 ml buis. OPMERKING: Het filtraat bevat merozoïeten en hemozoin kristallen, met-un gescheurde schizonten en puin in het filter opgevangen.
  5. Bevestig een klein magnetisch kolom aan een magneet, en evenwicht met 500 ul THP-1 medium.
  6. Passeren van het filtraat op de magnetische kolom. Verzamel de doorstroming. OPMERKING: hemozoine zal binden aan de kolom, terwijl merozoites doorloopt.
  7. Leid de doorstroming op de kolom twee maal hemozoin verwijderen, het verzamelen van de stroom door elke keer.
  8. Spoel de kolom met 2 ml RT THP-1 medium om achtergebleven merozoites verzamelen.
  9. Voeg EtBr bij 10 ug / ml (eindconcentratie) en vlek gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Bescherming tegen licht tot fotobleken voorkomen. Opmerking: Zorg ervoor dat alle EtBr verontreinigde vloeistof en plastic afval wordt verwijderd op een wijze die geschikt is voor cytotoxische chemicaliën. Merozoites niet langer invasief na deze incubatie.
  10. Spin down merozoïeten bij 4000 xg gedurende 10 minuten.
  11. Gooi supernatant in een geschikte afvalcontainer.
  12. Resuspendeer merozoite pellet in 4 ml THP-1 medium, en spin down bij 4.000 xg gedurende 10 minuten.
  13. Voeg THP-1 medium tot een volume van 15 ml, en bescherming tegen licht.

6. Kwantificeren merozoite Concentratie door flowcytometrie

  1. Breng het tellen van kralen tot kamertemperatuur.
  2. Bereid PBS met 0,5% BSA voor het verdunnen merozoïeten.
  3. Count merozoïeten op 3 verdunningen; 1 100; 1 in 50 en 1 op 25. Voorbereiden 3 FACS buizen met 940, 930 en 910 pi PBS 0,5% BSA, respectievelijk. Voeg 10, 20 en 40 pi gezuiverd merozoites per buis, respectievelijk.
  4. Vortex het tellen van kralen voor 30 sec, en voeg 50 ul van kralen per FACS buis met verdund merozoïeten.
  5. Voer de drie diluted merozoite monsters op een flowcytometer met een 488 nm laser. Stel een strenge gate voor merozoïeten gebaseerd op EtBr en GFP-fluorescentie dual fluorescentie, en poort het tellen van kralen met behulp van fluorescentie in een apart kanaal. Verwerven gebeurtenissen tot 2000 kralen worden verzameld. Opmerking: Deze instructies hebben betrekking op GFP + merozoïeten die zijn contra-gekleurd met EtBr tellen. Zo niet gebruik te maken van GFP-expressie parasieten vervolgens merozoite poorten gebaseerd op zijwaartse verstrooiing en EtBr fluorescentie.
  6. Bepaal de verhouding van merozoïeten: kralen door deling van het aantal merozoïet evenementen door de 2000 telling kraal gebeurtenissen, berekent een waarde voor elke verdunning. Gebruik het tellen kraal batch specificaties het aantal korrels bepalen de 50 pl kralen toegevoegd per buisje.
  7. Vermenigvuldig het aantal kralen in 50 ul met de verdunningsfactor en de merozoïet: parel verhouding voor dat verdunningsfactor. Dit aantal komt overeen met de concentratie van merozoïten per ml. Voer these stappen voor elke verdunning.
  8. Het gemiddelde van de merozoite gemeten concentraties in de drie verdunningen. OPMERKING: Standaard afwijkingen dan 10% concentraties bepaald voor 1 100, 1 in 50, 1 in 25 verdunningen geven technische onvolkomenheden voorbereiding tellen monsters.
  9. Resuspendeer merozoites 8 x 10 6 merozoites / ml in THP-1 medium tot een uiteindelijke verhouding van vier merozoites per THP-1 cellen waarborgen. OPMERKING: Andere merozoite aan THP-1 ratio's kunnen worden gebruikt, en de concentraties moeten dienovereenkomstig worden aangepast.

7. Fagocytose Assay

  1. Voeg 200 ul van warmte inactief FCS per putje van 96 en U-bodemplaten, en laat bij KT O / N platen blokkeren. Na incubatie, verwijder FCS en was putten tweemaal met 200 pi steriel PBS. Verwijder PBS en bewaar platen bij 4 ° C totdat ze nodig waren.
  2. Bereken het aantal THP-1-cellen moeten plasmamonsters en controles getest, waardoor drievoudige putjes per monster in 1 x 10 5 THP-1-cellen per putje.
  3. Bepaal THP-1 cultuur concentratie door het laden van 10 ul van cultuur op een haemocytometer dia. Tel het aantal cellen aanwezig in 4 sets van 16 hoekvelden van de hemocytometer onder een microscoop, dan de gemiddelde tellingen. Vermenigvuldig het gemiddelde aantal van 10.000 tot het aantal cellen per ml te berekenen.
  4. Spin de vereiste aantal THP-1 cellen bij 500 g gedurende 5 minuten en resuspendeer in 6,7 x 10 5 cellen / ml in THP-1 medium.
  5. Voeg 150 ul van THP-1 cellen in THP-1 medium per putje van een FCS-geblokkeerde 96 en U-bodemplaat, waardoor 10 5 cellen / putje. Bereid 3 putten per monster dat zal worden getest. Terug plaat incubator totdat klaar om merozoïeten voegen.
  6. Voeg 150 ul van merozoïet preparaat bij 8 x 10 6 / ml per putje een afzonderlijke FCS-geblokkeerd met 96 U-bodemplaat. Bereid een goed per monster getest
  7. Voeg 10 ul van bereide verdunde plasma monsters per goed, aan thij het bord dat de merozoïeten bevat, en meng goed tot een homogene oplossing te garanderen.
  8. Verwijder de THP-1 plaat uit de incubator, en voeg 50 ul van de merozoite / plasma-oplossing per putje met THP-1-cellen, met putjes in drievoud per plasma monster.
  9. Meng goed en incubeer bij 37 ° C in 5% CO2 bevochtigde incubator gedurende 40 minuten. Dek af met folie ter bescherming tegen licht.
  10. Na 40 min gecentrifugeerd monsters 5 min bij 500 xg bij 4 ° C voorgekoeld centrifuge fagocytose arresteren.
  11. Verwijder de supernatant en was de cellen tweemaal in ijskoude PBS + 0,5% BSA +2 mM EDTA (FACS-buffer). OPMERKING: EDTA vergemakkelijkt het behoud van een enkele celsuspensie voor flowcytometrie analyse.
  12. Fix cellen in 90 ul van 2% paraformaldehyde (PFA) in PBS + 0,5% BSA +2 mM EDTA (FACS fixatief). Laat het ijs tot overname, beschermd tegen licht.

8. Flowcytometrie

  1. Verwerven monsters met behulp van een doorstroomcytometer uitgerust with een 488 nm laser en high throughput plaataflezer bevestiging. OPMERKING: Dit zal toelaten om 400 plasma te testen monsters van de ene merozoite voorbereiding. Cellen kunnen ook worden overgebracht naar buisjes voor handmatig monster laden.
  2. Gate levensvatbare THP-1 cellen door voorwaartse en zijwaartse verstrooiing.
  3. Stel de EtBr positieve poort op basis van de 'THP-1 cellen met merozoïeten en geen plasma' control.
  4. Verwerven van een minimum van 10.000 gebeurtenissen per monster.

9. Data Analysis

  1. Analyseer gegevens met behulp van flowcytometrie-analyse software en stel strenge poorten voor EtBr positieve gebeurtenissen.
  2. Bereken het percentage fagocytose voor elk monster: het% EtBr + cellen voor het monster minus% positieve cellen met niet-immuun plasma.
  3. Gemiddelde resultaten in drievoud. OPMERKING: standaard afwijkingen voor een drievoud dan 10% geven experimentele onnauwkeurigheden. Achtergrondinformatie EtBr positieve gebeurtenissen kan worden waargenomen als gevolg van merozoite hechting aan het oppervlak van THP-1-cellen, maar moet consistent zijn voor alle monsters die merozoites. Het instellen van de poort op basis van de 'THP-1 cellen met merozoïeten en geen plasma' controle, en vervolgens af te trekken de achtergrond van de 'THP-1 cellen met niet-immune plasma' controle zal resulteren in% fagocytose dat de fluorescentie weerspiegelt vanwege geïnternaliseerd / gefagocyteerd alleen merozoïeten.

Resultaten

De rijping fase van parasieten voorafgaand aan E64 behandeling is van cruciaal belang voor het genereren van membraan-omsloten merozoites. Figuur 1ai toont de juiste maturatie van schizonten voor het toevoegen van E64. De parasieten moet groot zijn en vrijwel vullen het rode bloedcel. Een gevlekt uiterlijk van Giemsa geeft merogonie is begonnen, en E64 moet worden toegevoegd aan membraan-omsloten merozoïeten (figuur 1Aii) opleveren. Als E64 eerder wordt toegevoegd aan fase parasieten trophozoite worden membraan omsloten merozoïeten niet gegenereerd, zelfs na 12 uur van de E64. In plaats parasieten nemen op abnormale morfologie zoals de uitbreiding van het spijsverteringsstelsel vacuole (Figuur 1BI en 1Bii), en merozoïeten niet gevormd. Als E64 later wordt toegevoegd aan schizonten worden membraan ingesloten merozoïeten niet ontstaan ​​zijn als schizont breuk is ongeremd (Figuur 1CI en 1Cii). Een hoog parasiet synchroniteit vereist, anderewijs een reeks drie resultaten beschreven worden gezien na behandeling E64.

Verwijdering van hemozoin is een cruciale stap voor het zuiveren merozoïeten. Als merozoïeten niet worden gezuiverd van hemozoin vormen dan merozoite-hemozoin clusters die niet kan worden verdreven door pipetteren. Deze aggregaten draaien op de cytometer als enkele gebeurtenissen, zij het ​​met verschillende forward-scatter en side-scatter kenmerken dan alleenstaande merozoïeten, wat resulteert in onnauwkeurige merozoite tellen door flowcytometrie (Figuur 2A). Aangezien THP-1 cellen ook fagocyteren hemozoin, kunnen deze merozoïet-hemozoin clusters worden gefagocyteerd (Figuur 2B). Deze aggregaten zijn zeer EtBr fluorescerend als ze meerdere merozoïeten bevatten. Fagocytose van aggregaten resulteert in een THP-1 EtBr fluorescentie profiel gelijk aan die waargenomen voor de fagocytose van meerdere afzonderlijke merozoïeten. Dus als hemozoin niet wordt verwijderd, de EtBr fluorescentie van THP-1 cellen een o zijnverestimate van het opsoniserende potentieel van het plasma wordt getest. Hemozoin is ook gemeld aan fagocyt functie aanzienlijk veranderen. GFP positieve merozoïeten zijn teller gekleurd met EtBr tot visualisatie van merozoïeten gefagocyteerd door THP-1 cellen te verhogen. Met behulp van de in dit protocol beschreven voorwaarden, worden alle GFP positieve merozoïeten tegengekleurd met EtBr die een helderder fluorescentie-intensiteit (figuur 3A) heeft. Fagocytose beoordeling door EtBr fluorescentie maakt superieure resolutie van merozoite fagocytose dan GFP-fluorescentie (Figuur 3B).

Het aantal merozoites toegevoegd aan de test zal de hoeveelheid fagocytose waargenomen moduleren. Daarom nauwkeurige telling door flowcytometrie kritisch. Toenemende verhoudingen van merozoïeten: THP-1 resulteert in een verhoogde hechting van merozoïeten aan THP-1-cellen in de afwezigheid van plasma (Figuur 4A). Toenemende merozoite: THP-1 ratio ook resulteert in verhoogde phagocytosis reacties wanneer merozoïeten worden opsonized (Figuur 4B). Een 04:01 merozoite: THP-1-ratio wordt aanbevolen voor robuuste fagocytaire reacties. Met behulp van deze verhouding, en de verdunning van plasma aangegeven, deze test is in staat om laag, middelhoog en hoog niveau van opsoniserende antilichamen op te lossen. Tussen 0 en 78 procent fagocytose reacties zijn waargenomen met behulp van PNG plasma monsters en de andere beschreven omstandigheden. Dergelijke reacties zijn onlangs aangetoond te associëren met natuurlijk verworven klinische immuniteit tegen malaria 10. Figuur 5 toont voorbeelden van de 4 kwartielen van fagocytose reacties van PNG individuen.

figure-results-1
Figuur 1. Timing van de E64 toevoeging is van cruciaal belang voor het genereren van membraan-omsloten merozoïeten. (A) Passende maturatio. n fase van parasieten i) voorafgaand aan de E64 behandeling, en ii)-membraan ingesloten merozoïeten geproduceerd na 6 uur van E64 behandeling (B) membraan omsloten merozoïeten worden niet gegenereerd als E64 is toegevoegd aan onvolwassen parasieten; i) laat stadium trofozoiten, en ii) na 12 uur van de E64 (C) schizont breuk wordt niet geremd als E64 is toegevoegd aan de late gesegmenteerd schizonten.; i) laat stadium schizonten, en ii) na 6 uur van de E64. Schaal balk geeft 10 micrometer.

figure-results-2
Figuur 2. Hemozoine verwijdering is van cruciaal belang voor een eencellige merozoite schorsing genereren. Merozoite-hemozoin aggregaten na filtratie van membraan ingesloten merozoïeten, tenzij hemozoin magnetisch is gescheiden van merozoites. (A) Forward-scatter en side-puntgrafieken van merozoïeten met hemozoin verwijderden hemozoin behouden. (B) hemozoine-merozoite aggregaten worden gefagocyteerd door THP-1-cellen. Diff-Quick gekleurd cyto-spin-slides van THP-1-cellen geïncubeerd met PNG plasma opsonized merozoite bereidingen met of zonder hemozoin. Schaal balk geeft 10 micrometer.

figure-results-3
Figuur 3. Ethidiumbromidekleuring zorgt voor een superieure resolutie van merozoite fagocytose. D10-GFP gezuiverd merozoïeten worden tegengekleurd met EtBr om fluorescentie-intensiteit te verbeteren. (A) Flowcytometrie histrogram gezuiverd merozoïeten met gating op GFP positieve merozoïeten, en een dot blot die EtBr fluorescentie binnen deze gated GFP positieve populatie. (B) voorwaartse verstrooiing versus GFP en voorwaartse verstrooiing versus EtBr van THP-1 cellen na fagocytose van GFP en EtBr dual fluorescerende merozoïeten. Gates werden d Rawn basis van de THP-1 cellen met merozoïten en zonder plasmacontrolemateriaal.

figure-results-4
Figuur 4 Het merozoieten. THP-1 verhouding beïnvloedt de mate van fagocytose waargenomen. (A) Vijf merozoite: THP-1 ratio afgebeeld; 50:1, 20:01, 10:01, 04:01, 01:01. Cellen enige controle geeft achtergrondfluorescentie door THP-1-cellen. THP-1 EtBr fluorescentie voor elke verhouding is geïndiceerd voor merozoïeten opsonized met een pool van PNG plasma of met nonimmune Australische plasma (B) gemiddelde fluorescentie-intensiteit van THP-1-cellen voor verschillende merozoite:. THP-1 ratio, en opsonisatie met een zwembad van PNG plasma of nonimmune Australische plasma (gemiddelde + SEM). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

ove_content "fo: keep-together.within-page =" altijd "> figure-results-5
Figuur 5. Een groot bereik van opsoniserende antilichamen worden gemeten. Merozoïeten werden geopsoniseerd met plasma van individuen PNG en geïncubeerd met THP-1-cellen. Vier representatieve fagocytose reacties worden weergegeven. Gates werden getrokken op basis van de THP-1 cellen met merozoïeten en geen plasma controle en cijfers geven de fagocytose% na aftrek van de THP-1 cellen met niet-immune plasma controle. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Discussie

Om merozoite fagocytose te meten, wordt vaardigheid in twee technieken die nodig zijn: zuivering van merozoïeten en THP-1 fagocytose assay. De meest kritische stappen voor het combineren van deze twee technieken zijn: 1) Highly gesynchroniseerd parasieten; 2) toevoegen van E64 op het juiste moment membraan omsloten merozoites verkregen; 3) Het verwijderen hemozoin om aggregaten te voorkomen; 4) Nauwkeurige merozoite tellen door flow cytometrie; 5) de verdunning van plasma gebruikt; en 6) behoud van een lage celdichtheid en passage aantal THP-1-cellen. Zorgvuldige afweging van deze belangrijke aspecten zal zorgen robuuste fagocytose reacties worden waargenomen.

Hoewel beschreven is de bereiding van merozoïeten ter beoordeling fagocytose, kan de techniek worden gebruikt voor uiteenlopende toepassingen. Ongeacht de stroom methodologie, optimale merozoite voorbereidingen afhangen van de juiste timing E64 aanvulling om merozoïeten genereren. De E64 hier beschreven methode is aangetoond dat yield invasieve merozoïeten voor gebruik in hoge resolutie microscopie van invasie evenementen en drug gevoeligheid testen 15-20. Terwijl merozoite levensvatbaarheid niet essentieel is voor fagocytose, wordt de integriteit van de merozoite toplaag nodig. Daarom is de E64 hier beschreven methode maakt hoge kwaliteit merozoites moeten worden geproduceerd voor de beoordeling antilichaamreacties tegen de oppervlaktelaag. Zoals in figuur 1, als E64 te vroeg of te laat toegevoegd membraan ingesloten merozoites niet gevormd. Daarom zijn zeer synchrone parasiet culturen nodig. Hier, het gebruik van sorbitol en heparine behandelingen strak synchroniseren D10-GFP parasiet culturen een venster van 2 uur wordt beschreven. Heparine kan bevorderen gametocytogenesis andere laboratorium isolaten, en dus moet zorgvuldig worden gebruikt. Alternatieve synchronisatiemethode zoals alanine kunnen ook worden gebruikt, mits goed gesynchroniseerd parasieten geproduceerd 29. Als E64 wordt toegevoegd aan asynchrone parasieten, een lagere proportion van membraan-omsloten merozoïeten zal worden geproduceerd en de resterende parasieten geïnfecteerde RBC zal ofwel scheuren normaal of afwijkingen ontwikkelen morfologie. De aanwezigheid van parasieten die niet hebben ontwikkeld tot membraan-omsloten merozoites leidt tot verstopping van het filter en aanzienlijke vermindering van de merozoïet opbrengst verkregen.

Tijdens filtratie van membraan-omsloten merozoïeten, hemozoin is bevrijd van de spijsvertering vacuolen en aanwezig als vrije kristallen in oplossing is. Hemozoine zeer proinflammatoire en gerapporteerd aan monocyt en macrofaag fagocytose antwoorden 30, 31 moduleren. Naast moduleren fagocytose, zoals getoond in figuur 2, hemozoin kunnen aggregaten met merozoites in oplossing. Zoals THP-1-cellen deze aggregaten kunnen fagocyteren, kan dit een belangrijke confounder voor de oplossing van antilichaam-gemedieerde fagocytose zijn. Daarom is verwijderen van hemozoin noodzakelijk in deze assay avoid extra complexiteit van hemozoin op fagocytensysteem biologie. Bovendien kan het niet hemozoin verwijderen ook schadelijk zijn bij gebruik van deze techniek om vrije merozoïeten voor andere toepassingen genereren, vooral wanneer merozoite kwantificering vereist.

Zoals in figuur 4, het aantal merozoites toegevoegd aan de test kan de mate van fagocytose beïnvloeden door THP-1-cellen. Hoewel flowcytometrie maakt voor de telling van merozoite concentratie, voorzichtig pipetteren en repliceren tellingen van merozoïeten noodzakelijk om de nauwkeurigheid te verbeteren. Dit is vooral van belang indien verschillende parasiet lijnen worden getest side-by-side. Eerder is aangetoond dat plasma uit semi-immune kinderen van PNG aanzienlijk kan worden verdund reacties dalen 23. Hier beschreven is de optimale verdunning van plasma (1/120, 000 uiteindelijke verdunning van plasma) voor een cohort van 5-12 jaar oude PNG kinderen dat het grote aanbod van phagocyt geproduceerd. osis reacties in figuur 5 beschreven Dit moet voor een stratificatie van de reacties in vier groepen (0-19%, 20-39%, 40-59% en 60-79% fagocytose) en regressie modellering bleek dat opsoniserende reacties werden geassocieerd met bescherming tegen klinische ziekte en high-density parasitemie 10 Voor verschillende cohort-studies noodzakelijk kan plasma verdunning passen aan de fagocytose waarborgen door THP-1 cellen wordt niet of onder het detectieniveau verzadigd.

Flowcytometrie maakt een snelle en meetbare fagocytose met verbeterde nauwkeurigheid over microscopie. Dit protocol is een hoge doorvoer, schaaltje gebaseerde en geautomatiseerde verkrijging van 96 well platen met natuurlijk verworven humorale immuniteit bestuderen. De werkwijze vereist kleuring van merozoïeten met ethidiumbromide echter alternatieve DNA vlekken zoals SYBRGreen, DAPI en propidiumjodide, membraan vlekken of eiwit vlekken kunnen worden gebruikt. Deze test zou vatbaar zijn Primary monocyten of neutrofielen, en kan worden aangepast indien fagocytensysteem of FcR biologie van belang was. Primaire cellen of THP-1 cellen gedifferentieerd in vitro met PMA kunnen worden gebruikt om fagocytose studeren malaria en andere pathogenen 12, 32-34. Echter gebruik van primaire cellen uitdagend omdat deze cellen hechtend en ook worden weergegeven niet-antilichaam-gemedieerde fagocytose 35. Bovendien variabiliteit in reinheid, levensvatbaarheid en functionaliteit zijn enkele belangrijke beperkingen aan het gebruik van primaire fagocyten. De Fc-receptoren betrokken bij merozoite fagocytose blijven gekarakteriseerde en derhalve met blokkerende antilichamen tegen specifieke Fc receptoren zou de bijdrage van elke Fc Receptor fagocytose merozoïet helderen. Zoals THP-1 fagocytose is FcR afhankelijk, dit maakt eenvoudige interpretatie van de fagocytose waargenomen. Deze test leent zich ook voor het aanpakken van de antigeenspecificiteit van opsoniserende antilichamen die kan worden bereikt door utilizing knock-out parasieten voor merozoieten oppervlakte-antigenen, of met behulp van affiniteit gezuiverde humane antilichamen tegen oppervlakte-eiwitten merozoite. Bovendien diepgaande studies van cytokine responsen na merozoite fagocytose ontbreken, en kan worden bereikt met deze test.

Deze twee technieken vormen aanzienlijke vooruitgang bij het onderzoek van functionele antimerozoite antilichamen. De zuivering van hoge kwaliteit merozoites voordelig om gebruik gecryopreserveerd merozoites, of fluorescerende microbolletjes bekleed met merozoite antigenen. Hoewel deze test is gebruikt als een instrument voor het evalueren natuurlijk verworven immuniteit kan blijken een belangrijk hulpmiddel om de verwerving van immuniteit in reactie op vaccinatie. Hoewel het is onlangs aangetoond dat de fagocytose of opsonised merozoites is geassocieerd met bescherming tegen klinische malaria, is het niet mogelijk om direct conclusies uit in vitro THP-1 fagocytose in vivo phagocytosis van merozoïeten fagocytose in deze test vindt plaats onder statische omstandigheden en bij afwezigheid van concurrerende rode bloedcellen. De mogelijke aanpassingen van deze test kan dus een veelzijdig hulpmiddel voor een beter begrip van malaria en merozoite fagocytose.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

De auteurs willen de kinderen en volwassen plasmadonoren, en het personeel van de Papoea-Nieuw-Guinea Institute of Medical Research erkennen. De auteurs willen graag Amandine B Carmagnac, Catherine Q Nie, Danny W Wilson, Ivo Mueller en Diana S Hansen bedanken voor hun bijdrage aan de ontwikkeling van deze techniek, en dank het Australische Rode Kruis voor bloed en serum packs. Dit werk werd mogelijk gemaakt door de Victoriaanse Overheid van de Staat Operationele Infrastructuur Ondersteuning en Australische regering NHMRC IRIISS. Dit werk werd ondersteund door de National Health en Medical Research Council verleent # 1031212 en # 637406, en de National Institutes of Health subsidie ​​# AI089686.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
THP-1 cell lineAmerican Type Culture CollectionTIB-202
RPMI-1640Gibco31800-089
Fetal Calf Serum (FCS)Invitrogen10099-141
2-mercapthoethanol Sigma-AldrichM6250-100MLGebruik in dampkap
Pen/Strep Solution (100x)SigmaP0781
HEPESSAFC90909CCelcultuurkwaliteit
HypoxanthineCalbiochem4010
Human Serum Donatie van Australian Red CrossCommercieel verkrijgbaar (bijv. Invitrogen)
Sodium bicarbonate (NaHCO3)Merck1.06329.0500
GentamycinPfizer61022027Injectiekwaliteit
Heparin Sodium BP (5000 IU/ml)PfizerVarkensoorsprong
Blasticidin S-hydrochlorideSigma-Aldrich15205
D-SorbitolSigma-Aldrich50-70-4
E64 Protease InhibitorSigma-AldrichE3132-10MG
KH2PO4Sigma-Aldrich98281-100GGebruik voor fosfaatbuffer
Na2HPO4.2H20Merck10383.4GGebruik voor fosfaatbuffer
Giemsa's azur eosin methyleenblauw oplossingMerck1.09204.05001:10 verdunning in 6,7 mN fosfaatbuffer (vers maken bij elke kleuring)
EDTA dinatriumzoutMerck10093.5V0,1 M, pH 7,2
Acrodisc Spuitfilters 1,2-μm/32-mmPall Life Sciences4656
QuadroMACS Separator (voor kleine kolom)MACS Miltenyi BioTec130-091-051Uitwisselbaar met MidiMACS 
VarioMACS Separator (voor grote kolommen)MACS Miltenyi BioTec130-090-282
MACS MultiStandMACS Miltenyi BioTec130-042-303
LS Kolom (kleine magnetische kolom)MACS Miltenyi BioTec130-042-401
Grote magnetische kolomMACS Miltenyi BioTec130-041-305
Ethidium BromideBio-Rad1510433Cytotoxisch
CountBright Absolute Counting BeadsInvitogenC36950
BD FACSCalibur Flow Cytometer met HTS plate readerBD Biosciences
EDTA dinatriumzoutMerck10093.5V0,1 M, pH 7,2
FlowJo cytometry analysesoftwareTree Star

Referenties

  1. Cohen, S., McGregor, I. A., Carrington, S. Gamma-globulin and acquired immunity to human malaria. Nature. 192, 733-737 (1961).
  2. Fowkes, F. J. I., Richards, J. S., Simpson, J. A., Beeson, J. G. The relationship between anti-merozoite antibodies and incidence of Plasmodium falciparum malaria: A systematic review and meta-analysis. PLoS Medicine. Medicine, P. L. oS. 7, (2010).
  3. Bouharoun-Tayoun, H., Attanath, P., Sabchareon, A., Chongsuphajaisiddhi, T., Druilhe, P. Antibodies that protect humans against Plasmodium falciparum blood stages do not on their own inhibit parasite growth and invasion in vitro, but act in cooperation with monocytes. The Journal of experimental medicine. 172, 1633-1641 (1990).
  4. Jafarshad, A., et al. A novel antibody-dependent cellular cytotoxicity mechanism involved in defense against malaria requires costimulation of monocytes FcgammaRII and FcgammaRIII. Journal of immunology. 178, Baltimore, MD. 3099-3106 (1950).
  5. Genton, B., et al. A recombinant blood-stage malaria vaccine reduces Plasmodium falciparum density and exerts selective pressure on parasite populations in a phase 1-2b trial in Papua New Guinea. The Journal of Infectious Diseases. 185, 820-827 (2002).
  6. Sirima, S. B., Cousens, S., Druilhe, P. Protection against malaria by MSP3 candidate vaccine. The New England journal of medicine. 365, 1062-1064 (2011).
  7. Llewellyn, D., et al. Assessment of antibody-dependent respiratory burst activity from mouse neutrophils on Plasmodium yoelii malaria challenge outcome. Journal of leukocyte biology. , (2013).
  8. McIntosh, R. S., et al. The importance of human FcgammaRI in mediating protection to malaria. PLoS pathogens. 3, 72(2007).
  9. Pleass, R. J., et al. Novel antimalarial antibodies highlight the importance of the antibody Fc region in mediating protection. Blood. 102, 4424-4430 (2003).
  10. Hill, D. L., et al. Opsonizing Antibodies to P. falciparum Merozoites Associated with Immunity to Clinical Malaria. PLoS One. 8, (2013).
  11. Joos, C., et al. Clinical Protection from Falciparum Malaria Correlates with Neutrophil Respiratory Bursts Induced by Merozoites Opsonized with Human Serum Antibodies. PLoS ONE. 5, (2010).
  12. Kumaratilake, L. M., Ferrante, A. Opsonization and phagocytosis of Plasmodium falciparum merozoites measured by flow cytometry. Clinical and diagnostic laboratory immunology. 7, 9-13 (2000).
  13. Richards, J. S., et al. Identification and Prioritization of Merozoite Antigens as Targets of Protective Human Immunity to Plasmodium falciparum Malaria for Vaccine and Biomarker Development. The Journal of Immunology. , (2013).
  14. Salmon, B. L., Oksman, A., Goldberg, D. E. Malaria parasite exit from the host erythrocyte: a two-step process requiring extraerythrocytic proteolysis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 271-276 (2001).
  15. Boyle, M. J., et al. Isolation of viable Plasmodium falciparum merozoites to define erythrocyte invasion events and advance vaccine and drug development. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107, 14378-14383 (2010).
  16. Wilson, D. W., Langer, C., Goodman, C. D., Mcfadden, G. I., Beeson, J. G. Defining the timing of action of anti-malarial drugs against Plasmodium falciparum. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. , 1-46 (2013).
  17. Angrisano, F., et al. Spatial Localisation of Actin Filaments across Developmental Stages of the Malaria Parasite. PLoS ONE. 7, (2012).
  18. Riglar, D. T., et al. Super-resolution dissection of coordinated events during malaria parasite invasion of the human erythrocyte. Cell Host and Microbe. 9, 9-20 (2011).
  19. Zuccala, E. S., et al. Subcompartmentalisation of Proteins in the Rhoptries Correlates with Ordered Events of Erythrocyte Invasion by the Blood Stage Malaria Parasite. PLoS ONE. 7, (2012).
  20. Marapana, D. S., et al. Malaria Parasite Signal Peptide Peptidase is an ER-Resident Protease Required for Growth but not for Invasion. Traffic. 13, 1457-1465 (2012).
  21. Rzepczyk, C. M., Lopez, J. A., Anderson, K. L., Alpers, M. P. Investigation of the effect of monocytes with Papua New Guinea sera on Plasmodium falciparum in culture. International Journal for Parasitology. 18, 401-406 (1988).
  22. Schofield, L., Mueller, I. Clinical immunity to malaria. Curr Mol Med. 6, 205-221 (2006).
  23. Hill, D. L., et al. Efficient measurement of opsonizing antibodies to Plasmodium falciparum merozoites. PLoS ONE. 7, (2012).
  24. Tsuchiya, S., et al. Establishment and characterization of a human acute monocytic leukemia cell line (THP-1). International journal of cancer Journal international du cancer. 26, 171-176 (1980).
  25. Ackerman, M. E., et al. A robust, high-throughput assay to determine the phagocytic activity of clinical antibody samples. Journal of Immunological Methods. 366, 8-19 (2011).
  26. Ataíde, R., et al. Using an Improved Phagocytosis Assay to Evaluate the Effect of HIV on Specific Antibodies to Pregnancy-Associated Malaria. PLoS ONE. 5, (2010).
  27. Wilson, D. W., Crabb, B. S., Beeson, J. G. Development of fluorescent Plasmodium falciparum for in vitro growth inhibition assays. Malar J. 9, 152(2010).
  28. Lambros, C., Vanderberg, J. P. Synchronization of Plasmodium falciparum erythrocytic stages in culture. J Parasitol. 65, 418-420 (1979).
  29. Braun-Breton, C., Rosenberry, T. L., da Silva, L. P. Induction of the proteolytic activity of a membrane protein in Plasmodium falciparum by phosphatidyl inositol-specific phospholipase. C. Nature. 332, 457-459 (1988).
  30. Jaramillo, M., Godbout, M., Olivier, M. Hemozoin induces macrophage chemokine expression through oxidative stress-dependent and -independent mechanisms. J Immunol. 174, 475-484 (2005).
  31. Schofield, L., Tachado, S. D. Regulation of host cell function by glycosylphosphatidylinositols of the parasitic protozoa. Immunology and cell biology. 74, 555-563 (1996).
  32. Khusmith, S., Druilhe, P., Gentilini, M. Enhanced Plasmodium falciparum merozoite phagocytosis by monocytes from immune individuals. Infection and immunity. 35, 874-879 (1982).
  33. Lunov, O., et al. Differential uptake of functionalized polystyrene nanoparticles by human macrophages and a monocytic cell line. ACS. 5, 1657-1669 (2011).
  34. Tebo, A. E., Kremsner, P. G., Luty, A. J. Fcgamma receptor-mediated phagocytosis of Plasmodium falciparum-infected erythrocytes in vitro. Clinical and experimental immunology. 130, 300-306 (2002).
  35. McGilvray, I. D., Serghides, L., Kapus, A., Rotstein, O. D., Kain, K. C. Nonopsonic monocyte/macrophage phagocytosis of Plasmodium falciparum-parasitized erythrocytes: a role for CD36 in malarial clearance. Blood. 96, 3231-3240 (2000).

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

E64 proteaseremmerzuivering van merozo etenopsoniserende antilichaamassayTHP 1 cellenflowcytometrieethidiumbromidekleuringmagnetische scheidingfagocytosemetingremming van schizontruptuur
High Yield Zuivering van
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.