Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Vasculaire Gene Transfer van Metallic stentoppervlakken met adenovirale vectoren Tethered via Hydrolyseerbare Cross-linkers

9.4K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/51653

⸱

12 augustus 2014

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pediatrics, Division of Cardiology, The Children's Hospital of Philadelphia, University of Pennsylvania

In dit artikel

Samenvatting

Deze studies rapporteren over de omkeerbare hechting van adenovirale genvectoren aan kapot metalen oppervlakken van stents en model mesh schijven. Duurzame afgifte van transductie-competente virale deeltjes, afhankelijk van de hydrolyse van cross-linkers die worden gebruikt voor vector immobilisatie, resulteert in een duurzame locatie-specifieke transgen expressie in vasculaire cellen en in stent-achtige slagaders.

Samenvatting

In-stent restenose weer een belangrijke complicatie van stent revascularisatie procedures schaal gebruikt voor herstel van de bloedstroom door kritisch vernauwde delen van coronaire en perifere arteriën. Endovasculaire stents staat afstembare vrijlating van genen met anti-restenotische activiteit kan een alternatieve strategie te presenteren aan momenteel gebruikte drug-eluting stents. Om klinische vertaling bereiken, moet gen eluerende stents vertonen voorspelbare kinetiek van stent geïmmobiliseerde genvector afgifte en plaatsspecifieke transductie van vasculatuur, een al te grote ontstekingsreactie doorgaans geassocieerd met het polymeer coatings die fysieke invangen van de vector. Dit artikel beschrijft een gedetailleerde methodologie voor coatless aanbinden van adenovirale vectoren genen om stents op basis van een omkeerbare binding van de adenovirale deeltjes polyallylamine bisfosfonaat (PABT) -modified roestvrijstalen oppervlak via hydroliseerbare cross-linkers (HC). Een familie vanbifunctionele (amine en thiol-reactief) HC met een gemiddelde t 1/2 van de in-keten ester hydrolyse variërend tussen 5 en 50 dagen werden gebruikt om de vector te verbinden met de stent. De vector immobilisatie procedure wordt typisch uitgevoerd binnen 9 uur en omvat verschillende stappen: 1) incubatie van de metalen monsters in een waterige oplossing van PABT (4 uur); 2) ontscherming van thiolgroepen in PABT geïnstalleerd tris (2-carboxyethyl) fosfine (20 min); 3) uitbreiding van thiol reactieve capaciteit van het metaaloppervlak door reactie met polyethyleenimine de monsters gederivatiseerd met pyridyldithio (PDT) groepen (2 uur); 4) omzetting van PDT groepen om thiolen met dithiothréitol (10 min); 5) modificatie van adenovirussen met HC (1 uur); 6) zuivering van gemodificeerde adenovirale deeltjes per grootte-uitsluiting chromatografie (15 min) en 7) immobilisatie van thiol-reactieve adenovirale deeltjes op het gethioleerde staaloppervlak (1 hr). Deze techniek heeft een brede potentiële toepasbaarheid verder stents,door het faciliteren van oppervlakte-engineering van bioprothetische apparatuur naar de biocompatibiliteit te verbeteren door middel van het substraat-gemedieerde gen-levering aan de cellen interfacing de geïmplanteerde vreemd materiaal.

Inleiding

De effectiviteit van gentherapie als een therapeutische modaliteit wordt gehinderd door de slechte targeting vermogen van gentherapie vectoren 1,2. Het ontbreken van een goede targeting resultaten in sub-therapeutische niveaus van transgene expressie op de doellocatie en leidt tot een brede verspreiding van vectoren voor niet-doelwit organen 3, met inbegrip van degenen die verantwoordelijk zijn voor het monteren van de immuunrespons tegen zowel de vector en gecodeerde therapeutisch product 4, 5. Een mogelijk middel om de promiscuïteit van transductie te compenseren en te bevorderen targeting is genvectoren voeren op de gewenste locatie in een vorm die hun vrije verspreiding uitsluit via bloed en lymfe. Typisch deze inspanningen steunen op een lokaal injecteerbare afgiftesystemen bestaande uit ofwel virale of niet-virale vectoren gemengd met fibrine, collageen of hyaluronzuur hydrogel matrices 6-10 die in staat tijdelijk ondersteunen genvectoren op de injectieplaats door het fysisch invangen them in een polymeer netwerk.

Een ander algemeen geaccepteerd model voor gelokaliseerde gentherapie gebruikt immobilisatie van genvectoren op het oppervlak van geïmplanteerde prothesen 11,12. Permanente medische implantaten (endovasculaire, bronchiale, urologische en gastro-intestinale stents, pacemakers, kunstgewrichten, chirurgische en gynaecologische mazen, enz.) Worden jaarlijks gebruikt in de tientallen miljoenen patiënten 13. Terwijl over het algemeen effectief, deze apparaten zijn gevoelig voor complicaties die onvoldoende onder controle is door de huidige medische praktijk 14-17. Implanteerbare prothesen presenteren een unieke kans om te dienen als proxy platforms voor gelokaliseerde gentherapie behandeling. Vanuit de farmacokinetische oogpunt, oppervlakte derivaatvorming van medische implantaten met een relatief lage input doses genvectoren resultaten in het bereiken van zowel hoge lokale concentraties van genvectoren op het implantaat / weefsel-interface en het vertragen van de kinetiek van their eliminatie van deze locatie. Als gevolg van langdurig verblijf en een verhoogde opname van de beoogde celpopulatie vector immobilisatie minimaliseert verspreiding van het gen vector. Dus de onbedoelde inoculatie van niet-doelwit weefsels wordt verminderd.

Oppervlak aanbinden van genvectoren op implanteerbare biomaterialen (ook genoemd als-substraat gemedieerde gen-levering of vaste fase gentherapie) is in celcultuur en dierproeven uitgevoerd met behulp van zowel specifieke (antigeen-antilichaam 18-20, avidine-biotine 21,22) en aspecifieke 23-26 (kosten, van der Waals) interactie. De covalente binding van vectoren om het oppervlak van de geïmplanteerde inrichting is eerder beschouwd als niet-functioneel door de te sterke bindingen met het oppervlak beletsel vector internalisatie door doelcellen. Onlangs werd aangetoond dat deze beperking kan worden overwonnen door het gebruik van spontaan hydrolyseerbare vernettingsmiddel gebruikt als het tethers tussen het gemodificeerde metalen oppervlak van de stent en de capside-eiwitten van de adenovirale vector 27,28. Bovendien kan de vector afgiftesnelheid en tijdsduur van transgene expressie in vitro en in vivo worden gemoduleerd met gebruik van hydrolyseerbare verknopingsmiddelen vertonen verschillende kinetiek van hydrolyse 28.

Dit document verschaft een gedetailleerd protocol voor het omkeerbare covalente binding van adenovirale vectoren aan geactiveerde metalen oppervlak voor een nuttige experimentele opstelling voor het bestuderen daaropvolgende transductie in vitro in gekweekte gladde spiercellen en endotheliale cellen en in vivo in de rat model carotis angioplastiek of stent .

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1 Voorbereiding van Cy3-gelabelde adenovirus voor de Release Experimenten

  1. Opschorten 2 x 10 12 deeltjes van Ad leeg (ongeveer 2 x 10 11 infectieuze eenheden) in 650 ul van carbonaat / bicarbonaat buffer (CBB; pH 9,3).
  2. Los de inhoud van 1 injectieflacon (0,2 mg) van amine-reactieve fluorescerende kleurstof (Cy3 (NHS) 2) in 1 ml CBB tot een eindconcentratie van 0,2 mg / ml.
  3. Voeg 100 ul van de kleurstofoplossing aan virussuspensie, vortex gedurende 5 seconden en incubeer gedurende 1 uur bij 28 ° C onder schudden (100-200 rpm).
  4. Equilibreer een 20 ml Sepharose 6B-kolom met PBS. Voeg 750 ul Cy3-gemerkte Ad suspensie druppelsgewijs aan het midden van de gel bed.
  5. Na virussuspensie doordringt de hars, voeg 5 ml PBS. Gooi het eluaat.
  6. Voeg 0,5 ml PBS en vang het eluaat op in een gelabelde glazen container. Herhaal deze stap 10x verzamelen totaal tien fracties van 0,5 ml.
  7. Assay the ingezamelde fracties spectrofotometrisch (260 en 280 nm) voor virale DNA-gehalte.
  8. Verzamel de fracties die meer dan 10% van de totale (som van F1 tot F10) optische dichtheid (OD) bij 260 nm. Opmerking: Typisch de fracties F3, F4, F5 en F6 worden samengevoegd en gemengd.
  9. Re-assay de gemengde gepoolde fracties spectrofotometrisch (260 en 280 nm) en assay van fluorometrie (ex 550/570 nm em) voor virale DNA-gehalte en Cy3 gemerkte capside-eiwit. Opmerking: A Cy3 (NHS) 2 kalibratiekromme voor de 10 -9 -10 -13 mol / L wordt bereid en fluorimetrisch bepaald op dezelfde plaat als de samengevoegde fracties.
  10. Bereken de gelabelde virusopbrengst en etikettering dichtheid. Veronderstel dat 1,19 x 10 12 virusdeeltjes / ml komt overeen met 1 OD eenheid voor een 1 cm weglengte 29. Gebruik de formule: Opbrengst = [(OD 260nm /1.19)*10 12 * V / ingang Ad hoeveelheid] * 100, waar, OD 260 nm is de optische density van de gepoolde formule bij 260 nm en V het volume van de samengevoegde formulering (ml) Ad recovery opbrengst (%) berekend. Met de formule: Labeling Dichtheid = C * 6,02 * 10 23 / ​​(OD 260nm /1.19)*10 12, waarbij C Cy3 concentratie van de gepoolde formulering (mol / ml) en OD 260 nm de optische dichtheid van de gepoolde formule bij 260 nm gemiddelde Cy3 etikettering dichtheid berekenen. OPMERKING: Een typische terugwinning van gelabelde virus is> 70% van de invoer dosis. De etikettering dichtheid 600-800 fluorfoor moleculen per enkel virusdeeltje.
  11. Aliquot Cy3-gemerkte Ad leeg in kleinere porties (gewoonlijk 5 x 10 11 deeltjes) geschikt voor de individuele afgifte-experimenten. OPMERKING: Actueel protocol specificeert het gebruik van Cy3-gelabelde Ad uitsluitend in de release-experiment. Alle transductie studies worden uitgevoerd met niet-gelabelde vectoren.

2 Activering van Metal Samples

  1. Was de roestvrij steel gaas schijven of roestvrijstalen stents achtereenvolgens in isopropanol (5 x 2 min) en chloroform (5 x 2 min) bij 55 ° C onder schudden (100 rpm). Verwijder het oplosmiddel.
  2. Verwarm de monsters gedurende 30 minuten bij 200 ° C.
  3. Los polyallylamine bisfosfonaat met geïnstalleerde latente thiolgroepen (PABT 27,28,30) in water (1-2% w / v) bij 72 ° C onder schudden (100 rpm). Breng de pH op 4,5-5 met KHCO3.
  4. Incubeer metal monsters in de PABT oplossing gedurende 2-4 uur bij 72 ° C onder schudden (100-200 rpm). OPMERKING: De procedure kan worden gepauzeerd op dit punt. De monsters zijn stabiel gedurende 3 dagen bij 4 ° C.
  5. Spoel de monsters driemaal met dubbel gedestilleerd water (DDW).
  6. Maak de monsters tris (2-carboxyethyl) fosfine (TCEP, 15 mg / ml in 0,1 M azijnzuur buffer) gedurende 15 min bij 28 ° C onder schudden (100-200 rpm).
  7. Spoel 5x in ontgast DDW.
  8. Expose de monsters naar 2% polyethyleenimine met geïnstalleerde pyridyldithio groepen (PEI PDT 27,28,30) in ontgast DDW in een argonatmosfeer gedurende 2 uur bij 28 ° C onder schudden (100-200 rpm). OPMERKING: De procedure kan worden gepauzeerd op dit punt. De monsters 2 weken stabiel bij 4 ° C.
  9. Spoel de monsters drie keer met DDW.
  10. Maak de monsters 10 mg / ml dithiothreitol / DDW tot pyridyldithio groepen zetten in thiolen.
  11. Spoel 5x opnieuw in ontgast DDW.

3 Adenovirus Activering en Metal Surface immobilisatie

  1. Opschorten 5 x 10 11 deeltjes van zowel Ad eGFP of Ad Luc (ongeveer 5 x 10 10 infectieuze eenheden) in 487,5-495 ul van carbonaat / bicarbonaat buffer (CBB; pH 9,3). Opmerking: Voor de release studies, gebruik 5 x 10 11 van Cy3 gelabeld Ad lege deeltjes (volume op 487,5-495 ul met CBB).
  2. Los HC met verschillende hydrolysesnelheden 28 [(sneller (t 1/2 = 5 d), tussengelegen (t 1 /2 = 12 d) en langzaam (t 1/2 = 50 d) HC, dwz RHC IHC of SHC Figuur 1] of niet-hydrolyseerbare vernetter (NHC), sulfo-LC-SPDP CBB in 20 mM.
  3. Voeg onmiddellijk 5-12,5 pl verknoper oplossing voor de virussuspensie voor een totaal volume van 500 pl (200-500 uM eindconcentratie van vernetter), vortex en incubeer gedurende 1 uur bij 28 ° C onder schudden (100- 200 rpm).
  4. Equilibreer een 20 ml Sepharose 6B-kolom met ontgaste 5 mM EDTA / PBS (EPBS). Voeg druppelsgewijs 500 ul van cross-linker gemodificeerd Ad suspensie naar het midden van het harsbed.
  5. Voeg 5 ml ontgast EPBS. Gooi het eluaat.
  6. Voeg 0,5 ml ontgast EPBS en vang het eluaat op in een gelabelde glazen container. Herhaal deze stap voor 10 keer het verzamelen van een totaal van tien 0,5-ml fracties.
  7. Bepaal OD van de ingezamelde fracties met behulp van spectrofotometrie bij 260 en 280 nm en omzetten OD te virustiters (1.19 x 10 12 / ml correovereen met 1 OD) 29.
  8. Verzamel de fracties die> 10% van het geëlueerde virus (Opmerking: Meestal de fracties F3-F6). Herhaal de titer spectrofotometrische assay voor de samengevoegde suspensie.
  9. Transfer virale schorsing aan de flacon met de geactiveerde metalen monsters (per 2.11). Incubeer in een argonatmosfeer gedurende 1 uur bij 28 ° C onder schudden (100-200 rpm). Opmerking: De aldus verkregen stap Ad-tethered metaalmonsters worden verder gebruikt in de daaropvolgende afgifte en transductie experimenten in het protocol gedeelten 5-7 beschreven.

4 Kwantificering van oppervlakte-geassocieerde Ad Vector door PCR

  1. Bereid mazen geformuleerd met-oppervlak geïmmobiliseerd Ad eGFP aangebonden via NHC, SHC, IHC en RHC (n = 3 voor elk type), zoals beschreven in paragraaf 2 en 3.
  2. Gebruik een QIAamp DNA Micro kit om viraal DNA te isoleren. Plaats de mazen afzonderlijk in 1,5-ml plastic buizen die 200 ul mengsel van 180 gl ATL bUffer en 20 ul proteinase K (zowel uit de kit). Toevoegen bekende hoeveelheid van Ad eGFP deeltjes (zoals normen voor de kalibratie curve) in de afzonderlijke buizen met hetzelfde mengsel. Incubeer bij 56 ° C gedurende de nacht zonder schudden.
  3. Voeg 200 ul buffer AL (uit de kit), en door vortexen gemengd, voeg 200 ul 100% ethanol en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten.
  4. Breng het mengsel uit alle buizen op individuele MinElite kolom (uit de kit) en centrifugeren bij 8000 rpm gedurende 1 minuut. Spoel de mesh die buizen met 180 ul van verse ALT buffer, toe te voegen aan respectieve kolommen en draaien op 8000 rpm gedurende 1 minuut. Gooi de eluaten.
  5. Voeg 500 ul van buffer AW1 (uit de set) in de kolommen en centrifugeren bij 8000 rpm gedurende 1 minuut. Gooi de eluaten.
  6. Voeg 500 ul van buffer AW2 (uit de set) in de kolommen en centrifugeren bij 8000 rpm gedurende 1 minuut.
  7. Gooi de eluaten.
  8. Spin bij 14.000 rpm gedurende nog eens 3 minuten until de kolommen helemaal droog zijn. Gooi de eluaten.
  9. Voeg 50 ul van MilliQ-grade water in de kolommen. Spin bij 14.000 rpm gedurende 5 minuten. Verzamel 50 ui eluaat van iedere kolom in afzonderlijke verzamelbuis (uit de kit).
  10. Bereid PCR Master Mix oplossing combineert vermenigvuldigen van de volgende (12.5 pi of Power SYBR Green PCR Master Mix, 0,63 pl 10 pM eGFP sense primer [5'-ACG ACG TAA GCC ACA AGT TC -3 '], 0,63 ui 10 uM eGFP anti-sense primer [5'-AAG TCG TGC TGC TTC ATG TG-3 '], 6,3 gl MilliQ-grade water). Vermenigvuldig deze volumes door het aantal geplande reacties zoals "geen DNA" controles.
  11. Laad 5 ul van Ad eGFP DNA (uit stap 4.8) en 20 pi PCR Master Mix in triplo putjes van een MicroAmp Optical 96-well Reactieplaat. Dicht de plaat met MicroAmp Optical Adhesive Film. Draai de plaat bij 1000 rpm gedurende 1 min om luchtbellen te elimineren.
  12. Plaats de plaat in de houder van een 7500 Real-Time PCR-motor. In het hoofdmenu van de 7500 System SDS Software (v1.4 of hoger) te kiezen "Maak een nieuwe experiment". Klik op "next". In de "Nieuwe experiment Wizard" scherm kiezen Sybr Green uit een scroll-down menu en klik op "add". Klik op "next" om een ​​lay-out van het bord te krijgen. Markeer alle putjes te analyseren, selecteren Sybr Green. Markeer achtereenvolgens geen DNA controle putten, Ad eGFP DNA normen en onbekenden, en markeer ze met behulp van respectieve aanduidingen van de scroll-down menu.
  13. Schakel over naar het tabblad instrument. Selecteer "add dissociatie fase", het goed volume te wijzigen van standaard 50 pl 25 pl. Klik op start.
  14. Analyseer PCR resultaten met behulp van na controle van de QC-samenvatting voor uitschieters en andere onregelmatigheden.

5 afgiftekinetiek van Hydrolyseerbare Cross--linker tethered Vector Deeltjes van de Model Steel Mesh

  1. Was het gaas monsters gederivatiseerd met Cy3-gemerkte Ad via RHC, IHC, SHC en NHC (volgens 3.9) in 1% BSA / PBS (1 hr x 3) onder schudden (100-200 rpm).
  2. Met steriele fijne tang, plaatst de mazen in afzonderlijke putjes van een 96-wells plaat voorgevuld met 200 ui elutiebuffer (0,1% BSA / 0,1% Tween-20 / PBS).
  3. Neem fluorescerende beelden van een centraal deel van een maas. Noteer de instellingen van de microscoop en de CCD-camera wordt gebruikt voor het verwerven.
  4. Test is het plaatje fluorimetrisch (550 ex / 570 em) in goed scan modus met maximale reductie. Gebruik de putjes met niet-gederivatiseerde mazen als een achtergrondcontrole.
  5. Incubeer de plaat bij 37 ° C onder schudden (50 rpm).
  6. Op vooraf bepaalde tijdstippen (1-30 dagen bereik) zuigen de elutiebuffer zonder de mazen en voeg 200 ul vers elutiebuffer. Herhaal stappen 4.3-4.5 na vervanging van de buffer.

6 transductie van Gekweekte Cells door Mesh-geïmmobiliseerd Ad vectoren

  1. Was de Ad eGFP - of Ad Luc -derivatized mazen driemaal met steriel PBS gedurende 5 min met schudden (100 rpm).
  2. Met fijne steriele pincet verwijderen mesh schijven een voor een individueel plaats ze in de putjes van een 96-wells plaat met het celtype van interesse in de log groeifase.
  3. Incubeer de cellen gedurende 24 uur bij 37 ° C in 5% CO2.
  4. Gebruik de betrokken niet-terminale eindpunten test (fluorescentie microscopie, fluorometrie voor eGFP of bioluminescentie beeldvorming voor luciferase) om de omvang en de ruimtelijke verdeling van de genexpressie in de putten.
  5. Optioneel substituut medium voor PBS om de gevoeligheid van de fluorometrie assay (485/535 nm) als laag eGFP uitdrukking wordt verwacht toenemen. Opmerking: Als een fluorometer is uitgerust met een goed-scan mogelijkheden, lees de plaat in een goed-scan-modus om de ruimtelijke verdeling van eGFP expressie cellen in de putten te beoordelen. Exchange PBS voor het medium na het voltooien fluorometrie.
  6. Afbeelding van de getransduceerde cellen in de putten met Ad eGFP -eluting mazen (zowel onderliggende en afgelegen het gaas) met het FITC-filter set. Representatieve beelden op 40-200X vergroting. Noteer de exacte instelling van de fluorescentiemicroscoop en CCD camera voor het verwerven van beelden.
  7. Voeg 5 gl luciferine voorraad in PBS (10 mg / ml) direct aan putjes met Ad Luc -eluting mazen tot een uiteindelijke concentratie van 500 ug / ml en incuberen bij 37 ° C en 5% CO2 gedurende 10 min voor bioluminescentie beeldvorming . Zuig media en vervang-luciferin vrije media na beeldvorming.
  8. Herhaal eindpunt assays op vooraf bepaalde tijdstippen (maximaal 2 weken) om de kinetiek van reportergenexpressie volgende substraat-gemedieerde genoverdracht bestuderen.

7 Validatie van Conserven transductiecapaciteit bij Vertraagde Tijd Punten

  1. Bereid de Ad eGFP derivatized mazen gebruikt RHC, IHC, SHC en NHC voor vector tethering (zo per 2,1-2,11 en 3,1-3,9) en individueel plaats de mazen in de putjes van een 96-wells plaat met 60-80% confluent runder aorta endotheelcellen (BAEC ).
  2. Analyseer transductie van gekweekte BAEC met mesh geïmmobiliseerd Ad eGFP op 1 en 2 dagen na de mesh plaatsing met behulp van fluorescentie microscopie en fluorometrie (als per 6,4-6,5).
  3. 48 uur na aanvang van transductie was de maas met putten met PBS twee keer.
  4. Voeg 200 ul van 0,25% trypsine / EDTA aan elk putje en incubeer gedurende 15 minuten bij 37 ° C onder schudden (100 rpm). Was 3x met PBS.
  5. Met fluorescentiemicroscopie en fluorometrie om volledige verwijdering van alle eGFP positieve cellen geassocieerd met de mazen bepalen.
  6. Zaad dat vers gepasseerd BAEC in de putjes met gedeeltelijk vrijgegeven mazen op een 60-80% eerste seeding dichtheid (2-2,7 x 10 4 cellen / well).
  7. Incubeer de plaat bij 37 ° C en 5% CO 2 voor vooraf bepaalde tijd (1-10 dagen) voorafgaand aan de beoordeling van de "nieuwe" transductie door fluorescentie microscopie en fluorometrie.

8 Ad-eluting stent in het Rat Carotid Model van Stent Angioplasty

  1. Alle dierlijke procedures beschreven in dit protocol te voldoen aan landelijke richtlijnen over het gebruik proefdieren en werden goedgekeurd door de IACUC van het Children's Hospital van Philadelphia. Zich te houden aan de aseptische chirurgische omstandigheden alle instrumenten worden autoclaaf gesteriliseerd. Om continu de steriliteit van een kraal sterilisator wordt gebruikt tussen het gebruik van de instrumenten in maximaal vijf opeenvolgende dieren te verzekeren.
  2. Bereid Ad Luc -eluting stents volgens 2,1-2,11 en 3,1-3,9. Bewaar de virus-gederivatiseerde stents in steriele PBS bij 4 ° C gedurende maximaal 24 uur voor gebruik.
  3. Verdoven mannelijke Sprague-Dawley ratten (400-450 g) met een IP injectie van ketamine (100 mg / kg) en xylazine (5 mg / kg). Determine de diepte van de anesthesie door poot knijpen respons en spiertonus. Solliciteer oogheelkundige dierenarts zalf om droogheid van het hoornvlies en sclera voorkomen. Opmerking: De inhalatie-anesthesie met 4% en 2% isofluraan (1 L / min) voor het induceren en onderhouden van anesthesie, respectievelijk, is mogelijk, maar belemmert de vrije toegang tot de nek van het dier en dus wordt niet aanbevolen voor een onervaren gebruiker.
  4. Herwaarderen diepte van de anesthesie door teen knijpen. Scheren en aseptisch prep nek en borst regio. Dien antibiotica (cefazoline, 20 mg / kg, IM), pijnstillende (meloxicam, 0,5 mg / kg, SC) en zoutoplossing (10 ml / kg, SC). Katheteriseren de staart ader met een 24 G katheter en beheren heparine (200 IE / kg, IV). Opmerking: Een dosis van 10 mg / kg (IM) enrofloxacine (Baytril) kan worden gebruikt in plaats van cefazoline. Vermijd gebruik van antibiotica ontbreken significante activiteit tegen Gram-positieve bacteriën. 10-15 mg / kg carprofen (Rimadyl) kan worden gebruikt in plaats van meloxicam als een preventieve pijnstiller. Narcotische analgetica (e.g., morfine, buprenorfine) dient te worden vermeden vanwege hun ademhaling deprimerend eigenschappen.
  5. Voer een middellijn incisie door de huid en de nek fascia. Gebruik stompe dissectie technieken links carotis externa isoleren. Tie-off van de externe halsslagader op de meest distale aanspreekbaar website. Breng een glijdende tijdelijke ligatuur om de oorsprong van de interne halsslagader.
  6. Maak een 2-mm arteriotomie incisie in de linker externe halsslagader.
  7. Plaats een 2-French Fogarty katheter in de halsslagader door de incisie in de externe halsslagader. Blaas de punt van de katheter met zoutoplossing en passen 3x van de aortaboog de carotisbifurcatie om het endotheel ontbloten.
  8. Schuif een stuk slang (1,04 mm OD, 0,99 mm ID) via Fogarty katheter in de halsslagader. Trek de Fogarty katheter.
  9. Mount en krimp een advertentie Luc -derivatized stent over de ballon van een 1,5mm diameter angioplastiekkatheter. Steek de stent door de Teflon slangen en vooraf het in het middelste gedeelte van de gemeenschappelijke halsslagader. Wrijf de stent tegen de buis of de vaatwand.
  10. Implementeren van de stent bij 12 atm gedurende 30 seconden en de angioplastiekatheter trekken.
  11. Tie-off van de externe halsslagader proximale naar de arteriotomie website en laat de tijdelijke ligatuur op de interne halsslagader.
  12. Repareer de operatieve wond in lagen met stromend 4.0 Vicryl hechtingen en nieten van de huid.
  13. Herstellen van het dier op een opwarming pad tot ambulante en terug te keren naar zijn geïsoleerde kooi. Hoewel geen tekenen van pijn of ongemak kenmerkend vertoond door de postoperatieve dieren na de eerste 12 uur na de procedure, verhelpen uitbreiding van meloxicam behandeling (0,5 mg / kg, SC dag) gedurende 72 uur.

9 bioluminescentiebeeldvorming van arteriële Gene Expression

  1. Op vooraf bepaalde tijdstippen (1 dag - 3weken bereik) na-gen-eluting stent in de gemeenschappelijke halsslagader, verdoven de rat met isofluraan inhalatie-anesthesie (2-4% isofluraan in zuurstof).
  2. Verwijder de chirurgische nietjes, aseptisch de site voor te bereiden en de heropening van de operatieve wonden. Met stompe dissectie, opnieuw toegang krijgen tot het linker halsslagader en scheiden van de nervus vagus en aangrenzende bindweefsel.
  3. Bereid een mengsel van 50 mg / ml in PBS luciferine en 25% Pluronic F-127 in PBS (1: 4 v / v) en slaan op ijs. Opmerking: Deze formulering bevat als een viskeuze oplossing bij 4 ° C en onmiddellijk verandert in gel bij contact met weefsel bij 37 ° C.
  4. Breng 200 pi van een gekoelde luciferine / Pluronic mengsel direct naar blootgestelde segment van de halsslagader en verifiëren gel stevigheid.
  5. Plaats het dier in rugligging in de beeldvorming kamer van de IVIS-Spectrum apparatuur en isofluraan anesthesie met een gezichtsmasker te behouden.
  6. In de acquisitiop het bedieningspaneel venster (het Leven Beeld, versie 4.2 of hoger) kiezen voor de positie "B" (6,6 cm camera om afstand bezwaar) en binning factor "medium" uit het dropdown menu's getiteld "gezichtsveld" en "binning" respectievelijk. Typ "2,5 cm" in het vak onderwerp hoogte. Kies "min" als een eenheid van tijd in de "exposure time" in en kiest u een numerieke waarde van "2".
  7. Drie minuten na het aanbrengen van de Luciferine / Pluronicgel, beginnen met het verwerven door te klikken op de "Acquire" knop op het scherm. OPMERKING: Beeldvorming kan variëren van 1 tot 6 min, afhankelijk van de verwachte signaalsterkte.
  8. Na het verwerven van het beeld, was de gel af met een zoutoplossing en dep de periarterial ruimte met steriel gaas en katoen applicators.
  9. Sluit de wond met Vicryl hechtingen en nieten van de huid.
  10. Herstellen van het dier en terug te keren naar zijn kooi. Herhaal de beeldvorming bij later time punten naar het tijdsverloop van de arteriële expressie veroorzaakt door de-stent geïmmobiliseerd Ad vectoren bestuderen.
  11. Als alternatief voeren beeldvorming na een systemische toediening van luciferin. Verdoven en prep het dier als per 9.1-9.2. Katheteriseren de staart ader met een 24 G katheter en veilige katheter met chirurgische tape.
  12. Bereid een oplossing van luciferine in PBS (50 mg / ml) en injecteer 1 ml van de oplossing door de katheter dan 10 seconden interval. Een min na injectie beginnen met het verwerven als per 9,7-9,8. Opmerking: Een snellere injectie snelheid (<10 sec) kunnen epileptische activiteit en ademhalingsstilstand veroorzaken. Het dier moet worden geëuthanaseerd als toevallen of ademstilstand optreden tijdens de beeldvorming.
  13. Volg stap 9.10.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Vector Laat Experimenten

Aanbinden van adenovirale vectoren om het oppervlak van implantaten, waaronder interventie inrichtingen zoals endovasculaire stents, benadert de vector aan de ziekteplaats gedeeltelijk wegnemen van het gebrek aan vectoren fysieke targeting. Echter, kunnen therapeutische effecten via de transductie van doelweefsel bereiken, moet de vector worden vrijgemaakt van het oppervlak (figuur 2). Gebruik van hydrolyseerbare cross-linkers werd v...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De gepresenteerde protocol beschrijft een operationele methode voor het substraat gemedieerde gentherapie bereikt door omkeerbare bevestiging van adenovirale vectoren van roestvaststalen oppervlakken coatless. Terwijl ontwikkeld voor specifieke doel-stent gentherapie van vasculaire restenose, deze techniek heeft veel bredere toepassingen op het gebied van biomaterialen, biomedische implantaten en gentherapie.

Hoewel gepresenteerd studies hebben uitsluitend gebruikt roestvrij staal als ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De ontwikkeling van het protocol en de studies die in dit artikel worden gepresenteerd, werden gedeeltelijk ondersteund door American Heart Association Scientist Development-subsidies (I.F. 0735110N en M.C. 10SDG4020003), U.S. National Heart, Lung, and Blood Institute-subsidie HL 72108 (R.J.L.) en U.S. National Heart, Lung, and Blood Institute T32 007915 (S.P.F.). Angioplastiekkatheters werden vriendelijk gedoneerd door NuMED (Hopkinton, NY). De auteurs willen de secretariële assistentie van mevrouw Susan Kerns graag erkennen.

Dankbetuigingen

De auteurs hebben geen concurrerende financiële belangen te onthullen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
316 roestvrijstalen gaasschijvenElecton Microscopy SciencesE200-SS
Generieke 304-kwaliteit roestvrijstalen stentsLaserageop bestelling
AdeGFPUniversity of Pennsylvania Vector CoreAD-5-PV0504
AdLucUniversity of Pennsylvania Vector CoreAD-5-PV1028
AdEMPTYUniversity of Pennsylvania Vector CoreA858
Cy3(NHS)2GE HealthcarePA23000
Sepharose 6BSigma-Aldrich6B100-500ML
UV 96-wells platenCostar3635
Fluorometrie 96-wells platenCostar3915
Celcultuur 96-wells platenFalcon353072
Tris(2-carboxyethyl)fosfine hydrochloride (TCEP)Pierce Thermo Scientific20490
Dithiothreitol (DTT)Pierce Thermo Scientific20290
sulfo-LC-SPDPPierce Thermo Scientific21650
SpectrofotometerMolecular Devices SpectraMax 190
SpectrofluorometerMolecular DevicesSpectraMax Gemini EM
Orbitale shaker incubatorVWR1575R
Horizontaal luchtstroom ovenShel Lab1350 FM
Centra-CL2 centrifuge International Equipment Company426
Digitale vortex mixerFisher Thermo Scientific02-215-370
Eclipse TE300 fluorescentiemicroscoopNikon TE300
DC 500 CCD cameraLeicaDC-500
7500 Real-Time PCR systeemApplied Biosystemsniet beschikbaar
IVIS Spectrum bioluminescentie stationPerkins-Elmerniet beschikbaar
EDTA dikaliumzoutSigma-AldrichED2P
Bovin serum albumine fractie V (BSA)Fisher Thermo ScientificBP1600-100
Tween-20Sigma-AldrichP1379
Dumont pincettenFine Science Tools11255-20
A10 cellijn ATCCCRL-1476
Bovine aorta endotheliale cellenLonzaBW-6002
Luciferine, kaliumzoutGold BiotechnologyLUCK-1Ge
Pluronic F-127Sigma-AldrichP2443-250G
PBS zonder calcium en magnesiumGibco14190-136
Fetaal bovien serumGemini Bio-Products100-106
Penicilline/Streptomycine oplossingGibco11540-122
DMEM, hoge glucoseCorning cellgro10-013-CV
0,25% Trypsin/EDTAGibco25200-056
QIAamp DNA micro kitQiagen56304
Power Sybr Green PCR Master MixApplied Biosystems4367659
MicroAmp Optical 96-wells reactieplaatApplied BiosystemsN8010560
MicroAmp Optical Adhesive FilmApplied Biosystems4360954
Cefazolin Apotexniet beschikbaar
Loxicom (Meloxicam)Norbrookniet beschikbaar
Heparine natriumAPP Pharmaceuticalsniet beschikbaar
Ketavet (Ketamine)VEDCOniet beschikbaar
Anased (Xylazine) Lloidniet beschikbaar
Forane (Isoflurane) Baxterniet beschikbaar
Gebogen Moria iris pincettenFine Science tools11370-31
Gebogen extra-fijn Graefe pincettenFine Science Tools11152-10
Dumont #5 pincettenFine Science Tools11252-20
Vannas veertangFine Science Tools15018-10
Fijne schaar - ToughCutFine Science Tools14058-09
Chirurgische schaarFine Science Tools14101-14
Vicryl hechtdraad (5-0)EthiconJ385
Hechtdraad (4/0 zijde) Fine Science Tools18020-40
Michel hechtclipsFine Science Tools12040-02
Wond dilator (Lancaster oog specula)KLS Martin34-149-07
Hete bead sterilisatorFine Science Tools18000-45
Michel hechtclip applicatorFine Science Tools112028-12
Insyte Autoguard 24 G IV katheterBeckton-Dickinson381412
2F Fogarty katheterEdwards Lifesciences120602F
Teflon slangVention041100BST
PTA katheterNuMedop bestelling
Gaas padsKendall Healthcare9024
Katoenen applicatorsSolon ManufacturingWOD1003
SalinaBaxter281321
10 ml spuit (Luer-Lok)Beckton-Dickinson309604
1 ml spuit (Luer-Lok)Beckton-Dickinson309628
Schaar met #40 mesOster 78005-314
Transpore chirurgisch tape3MMM 15271
Puralube dierenkliniek zalfPharmadermniet beschikbaar

Referenties

  1. Boeckle, S., Wagner, E. Optimizing targeted gene delivery: chemical modification of viral vectors and synthesis of artificial virus vector systems. AAPS J. 8, E731-E742 (2006).
  2. Waehler, R., Russell, S. J., Curiel, D. T. Engineering targeted viral vectors for gene therapy. Nat Rev Genet. 8, 573-587 (2007).
  3. Campos, S. K., Barry, M. A. Current advances and future challenges in Adenoviral vector biology and targeting. Curr Gene Ther. 7, 189-204 (2007).
  4. Bangari, D. S., Mittal, S. K. Current strategies and future directions for eluding adenoviral vector immunity. Curr Gene Ther. 6, 215-226 (2006).
  5. Barry, M. A., et al. Systemic delivery of therapeutic viruses. Curr Opin Mol Ther. 11, 411-420 (2009).
  6. De Laporte, L., Shea, L. D. Matrices and scaffolds for DNA delivery in tissue engineering. Adv Drug Deliv Rev. 59, 292-307 (2007).
  7. Gustafson, J. A., Price, R. A., Greish, K., Cappello, J., Ghandehari, H. Silk-elastin-like hydrogel improves the safety of adenovirus-mediated gene-directed enzyme-prodrug therapy. Mol Pharm. 7, 1050-1056 (2010).
  8. Kidd, M. E., Shin, S., Shea, L. D. Fibrin hydrogels for lentiviral gene delivery in vitro and in vivo. J Control Release. 157, 80-85 (2012).
  9. Lei, Y., et al. Incorporation of active DNA/cationic polymer polyplexes into hydrogel scaffolds. Biomaterials. 31, 9106-9116 (2010).
  10. Lei, Y., Rahim, M., Ng, Q., Segura, T. Hyaluronic acid and fibrin hydrogels with concentrated DNA/PEI polyplexes for local gene delivery. J Control Release. 153, 255-261 (2011).
  11. Jang, J. H., Schaffer, D. V., Shea, L. D. Engineering biomaterial systems to enhance viral vector gene delivery. Mol Ther. 19, 1407-1415 (2011).
  12. Salvay, D. M., Zelivyanskaya, M., Shea, L. D. Gene delivery by surface immobilization of plasmid to tissue-engineering scaffolds. Gene Ther. 17, 1134-1141 (2010).
  13. Moss, A. J., Hamburger, S., Moore, R. M., Jeng, L. L., Vol Howie, L. J. Advance Data. 191, National Center for Health Statistics Vital and Health Statistics. (1991).
  14. Gristina, A. G., Naylor, P., Myrvik, Q. Infections from biomaterials and implants: a race for the surface). Med Prog Technol. 14, 205-224 (1988).
  15. Santerre, J. P., Woodhouse, K., Laroche, G., Labow, R. S. Understanding the biodegradation of polyurethanes: from classical implants to tissue engineering materials. Biomaterials. 26, 7457-7470 (2005).
  16. Tang, L., Eaton, J. W. Inflammatory responses to biomaterials. Am J Clin Pathol. 103, 466-471 (1995).
  17. Zimmerli, W., Sendi, P. Pathogenesis of implant-associated infection: the role of the host. Semin Immunopathol. 33, 295-306 (2011).
  18. Fishbein, I., et al. Bisphosphonate-mediated gene vector delivery from the metal surfaces of stents. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 159-164 (2006).
  19. Levy, R. J., et al. Localized adenovirus gene delivery using antiviral IgG complexation. Gene Ther. 8, 659-667 (2001).
  20. Ma, G., et al. Anchoring of self-assembled plasmid DNA/anti-DNA antibody/cationic lipid micelles on bisphosphonate-modified stent for cardiovascular gene delivery. Int J Nanomedicine. 8, 1029-1035 (2013).
  21. Hu, W. W., Lang, M. W., Krebsbach, P. H. Development of adenovirus immobilization strategies for in situ gene therapy. J Gene Med. 10, 1102-1112 (2008).
  22. Jang, J. H., et al. Surface immobilization of hexa-histidine-tagged adeno-associated viral vectors for localized gene delivery. Gene Ther. 17, 1384-1389 (2010).
  23. Bengali, Z., Shea, L. D. Gene Delivery by Immobilization to Cell-Adhesive Substrates. MRS Bull. 30, 659-662 (2005).
  24. Holmes, C. A., Tabrizian, M. Substrate-mediated gene delivery from glycol-chitosan/hyaluronic acid polyelectrolyte multilayer films. ACS Appl Mater Interfaces. 5, 524-531 (2013).
  25. Pannier, A. K., Wieland, J. A., Shea, L. D. Surface polyethylene glycol enhances substrate-mediated gene delivery by nonspecifically immobilized complexes. Acta Biomater. 4, 26-39 (2008).
  26. Wang, C. H., Pun, S. H. Substrate-mediated nucleic acid delivery from self-assembled monolayers. Trends Biotechnol. 29, 119-126 (2011).
  27. Fishbein, I., et al. Local delivery of gene vectors from bare-metal stents by use of a biodegradable synthetic complex inhibits in-stent restenosis in rat carotid arteries. Circulation. 117, 2096-2103 (2008).
  28. Fishbein, I., et al. Adenoviral vector tethering to metal surfaces via hydrolyzable cross-linkers for the modulation of vector release and transduction. Biomaterials. 34, 6938-6948 (2013).
  29. Mittereder, N., March, K. L., Trapnell, B. C. Evaluation of the concentration and bioactivity of adenovirus vectors for gene therapy. J. Virol. 70, 7498-7509 (1996).
  30. Forbes, S. P., et al. Modulation of NO and ROS production by AdiNOS transduced vascular cells through supplementation with L-Arg and BH4: Implications for gene therapy of restenosis. Atherosclerosis. 230, 23-32 (2013).
  31. Niinomi, M., Nakai, M., Hieda, J. Development of new metallic alloys for biomedical applications. Acta Biomater. 8, 3888-3903 (2012).
  32. Brito, L. A., Chandrasekhar, S., Little, S. R., Amiji, M. M. Non-viral eNOS gene delivery and transfection with stents for the treatment of restenosis. Biomed Eng Online. 9, 56(2010).
  33. Egashira, K., et al. Local delivery of anti-monocyte chemoattractant protein-1 by gene-eluting stents attenuates in-stent stenosis in rabbits and monkeys. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 27, 2563-2568 (2007).
  34. Ohtani, K., et al. Stent-based local delivery of nuclear factor-kappaB decoy attenuates in-stent restenosis in hypercholesterolemic rabbits. Circulation. 114, 2773-2779 (2006).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Metalen stentsgen eluerende stentsbioluminescentie imagingSprague Dawley rattenarteria carotis communisgrootte uitsluitingschromatografiethiol reactieve deeltjes
Vasculaire Gene Transfer van Metallic stentoppervlakken met adenovirale vectoren Tethered via Hydrolyseerbare Cross-linkers
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.