Dit protocol beschrijft een werkwijze voor het genereren en het zuiveren van wild type en mutante versies van de menselijke INO80 chromatin remodelling complex. Epitoop-gemerkte versies van INO80 subeenheden zijn stabiel tot expressie gebracht in HEK293-cellen en volledige complexen en complexen ontbreekt specifieke sets van subeenheden gezuiverd door immuno-affiniteitschromatografie.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Generatie en zuivering van Human INO80 chromatine remodeling Complexen en subes
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
INO80 chromatine remodeling complexen reguleren nucleosomen en DNA bereikbaarheid door het katalyseren van ATP-afhankelijke nucleosoom remodeling. Menselijke INO80 complexen uit 14 eiwitsubeenheden waaronder INO80 een SNF2-achtige ATPase, dat dient als de katalytische subeenheid en de matrix voor montage van de complexen. Functies van de andere subeenheden en de mechanismen waarmee zij een bijdrage leveren aan chromatine remodeling activiteit de INO80 complex blijft slecht begrepen, voor een deel te wijten aan de uitdaging van het genereren van INO80 bouwgroepen in menselijke cellen of heterologe expressie systemen. Deze JOVE protocol beschrijft een procedure die zuivering van menselijke INO80 chromatine hermodellering subcomplexen die ontbreken een subeenheid of een subset van subeenheden mogelijk maakt. N-eindstandig FLAG epitoop-gemerkte cDNA INO80 worden stabiel ingebracht in humane embryonale nier (HEK) 293-cellijnen met Flp-bemiddelde recombinatie. Indien een subset van subeenheden van de INO80 complex is be verwijderd, een expressie plaats INO80 mutante eiwitten die het platform te monteren onderdelen van deze subeenheden missen. In het geval een individu subunit is uitgeput te raken, een transfects siRNA gericht op deze subeenheid in een HEK 293 cellijn stabiel tot expressie FLAG tag INO80 ATPase. Kernextracten worden bereid, en FLAG immunoprecipitaties wordt uitgevoerd om proteïne fracties die INO80 derivaten verrijken. De samenstellingen van gezuiverde INO80 subcomplexen kan vervolgens worden geanalyseerd met methoden zoals immunoblotting, zilverkleuring en massaspectrometrie. De INO80 en INO80 subes gegenereerd volgens dit protocol kan verder worden geanalyseerd middels diverse biochemische assays die worden beschreven in de bijgevoegde JOVE protocol. De hier beschreven werkwijzen kunnen worden aangepast voor onderzoek van de structurele en functionele eigenschappen van elke zoogdierlijke meerdere subeenheden chromatine remodeling en modificerende complexen.
Inleiding
Evolutionair geconserveerd SNF2 familie chromatine remodeling complexen zijn belangrijke regulatoren van chromatine organisatie en toegankelijkheid van DNA 1. Deze remodeling complexen altijd een centrale SNF2-achtige ATPase subeenheid, die in sommige gevallen, assembleert diverse toe eiwitten en vormt meerdere subeenheden macro-moleculaire assemblages. De moleculaire details van de ATP-afhankelijke chromatine remodeling te bestuderen, is het belangrijk om de bijdrage van bepaalde subsets van subeenheden en / of domein structuren begrijpen activiteiten van de complexen. Dergelijke analyses vereisen de mogelijkheid om zeer gezuiverde mutant complexen die be....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1 Generatie en Cultuur van HEK293 Stabiel cellijnen die Full Length of Mutant Versies van FLAG epitoopgemerkte INO80 of andere INO80 Complex Subeenheden
- Clone cDNA dat de volledige lengte of mutant humaan INO80 ATPase of een andere INO80 subeenheid in de zoogdierlijke expressievector pcDNA5 / FRT met een in-frame, N terminale FLAG epitoop tag.
- Bevestig de sequentie van het ingevoegde cDNA met DNA sequencing voordat.
- Om de transfectie uit te voeren, groeien Flp-In HEK293 cellen in 10 cm weefselkweekschalen in een medium met DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium), 5% glutamine en 10% FBS (foetaal runderserum).
- Wanneer celle....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Figuur 1 toont een stroomdiagram overzicht van de procedures die voor productie, zuiveren en karakteriseren menselijke INO80 ATP-afhankelijke chromatine hermodellering complexen.
Zoals weergegeven in figuren 2 en 3, deze procedures kan de generatie van zowel wildtype INO80 en INO80 subes dat verschillende eiwitten missen, waardoor het mogelijk verdere biochemische analyse van de bijdrage van deze ontbrekende subeenheden enzymatische activite.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Structurele en functionele studies van multi-subunit van zoogdieren chromatine remodeling complexen van hogere eukaryoten werden gehinderd door de moeilijkheid van de voorbereiding van biochemisch nuttige hoeveelheden van dergelijke complexen met mutant subeenheden of ontbreken bepaalde subeenheden helemaal. Er zijn een aantal technische hindernissen Enerzijds, is genetische manipulatie in zoogdiercellen technisch ingewikkeld en tijdrovend geweest. Unlike gistcellen, waarvan het genoom kan gemakkelijk worden bewerkt en .......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.
Dankbetuigingen
Het werk in het laboratorium van de auteurs 'wordt ondersteund door een subsidie van de National Institute of General Medical Sciences (GM41628) en door een subsidie aan de Stowers Instituut voor Medisch Onderzoek van het Helen Nelson Fonds Medisch Onderzoek aan de Greater Kansas City Community Foundation.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Cellgro | 10-013-CV | |
| Glutamax-I (stablized glutamine) | Life Technologies | 35050-079 | |
| Fetal Bovine Serum | SAFC | 12176C | |
| FuGENE6 transfection reagent | Promega | E2312 | |
| Hygromycin B, steriel in PBS | AG Scientific | H-1012-PBS | |
| pcDNA5/FRT vector | Life Technologies | V6010-20 | |
| Flp-In HEK293 cells | Life Technologies | R780-07 | |
| pOG44 Flp-Recombinase Expressie Vector | Life Technologies | V600520 | |
| EZview Red ANTI-FLAG M2 Affinity Gel | Sigma | F2426 | |
| kalfserum | SAFC | 12138C | |
| TARGETplus SMARTsiRNA pool | Dharmacon / Thermo Scientific | various | |
| 5x siRNA resuspensiebuffer | Dharmacon / Thermo Scientific | #B-002000-UB-100 | |
| Lipofectamine RNAiMAX | Life Technologies | 13778 | |
| Opti-MEM Reduced Serum Medium | Life Technologies | 51985-091 | |
| PBS | Cellgro | 45000 | VWR |
| TrypLE (trypsine) | Life Technologies | 12604 | |
| 1x FLAG Peptide | Sigma | F3290 | |
| Micro Bio-Spin Chromatografiekolom | Bio-Rad | 737-5021 | |
| Amicon Ultra Centrifugal Filter Device (50k MWCO) | Amicon | UFC805024 | Fisher Scientific |
| Zeba Desalting Columns | Thermo Scientific | 89882 | |
| Anti-FLAG M2 antilichaam, muis | Sigma | F3165 | |
| Anti-FLAG M2 antilichaam, konijn | Sigma | F7425 | |
| Protease Inhibitor Cocktail | Sigma | P8340 | |
| benzonase | Novagen | 70664 | |
| Apparatuur | |||
| JS-4.2 rotor in een J6 centrifuge | Beckman-Coulter | 339080 | |
| JA-17 rotor | Beckman-Coulter | 369691 | |
| 10 ml polycarbonaat buizen | Beckman-Coulter | 355630 | |
| 70 ml polycarbonaat flessen | Beckman-Coulter | 355655 | |
| Type 45 Ti rotor | Beckman-Coulter | 339160 | |
| Type 70.1 Ti rotor | Beckman-Coulter | 342184 | |
| BD Clay Adams Nutator Mixer | BD Diagnostics | 15172-203 | VWR |
| Glas-Col Tube/Vial Rotator | Glas-Col | 099A RD4512 | |
| PCR thermische cycler PTC 200 | MJ Research | PTC 200 | |
| roller bottle incubator | Bellco biotechnology | 353348 | |
| Immobilon-FL Transfer Membraan 7 x 8.4 | Millipore | IPFL07810 | |
| gesmeerde 1,5 ml microcentrifugebuizen | Costar | 3207 |
Referenties
- Clapier, C. R., Cairns, B. R. The biology of chromatin remodeling complexes, Annual Review of Biochemistry. 78, 273-304 (2009).
- Szerlong, H., Hinada, K., Viswanathan, R., Erdjument-Bromage, H., Tempst, P., Cairns, B. R. The HSA domain binds nuclear actin-r....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
