Generatie en zuivering van Human INO80 chromatine remodeling Complexen en subes

Samenvatting

Dit protocol beschrijft een werkwijze voor het genereren en het zuiveren van wild type en mutante versies van de menselijke INO80 chromatin remodelling complex. Epitoop-gemerkte versies van INO80 subeenheden zijn stabiel tot expressie gebracht in HEK293-cellen en volledige complexen en complexen ontbreekt specifieke sets van subeenheden gezuiverd door immuno-affiniteitschromatografie.

Samenvatting

INO80 chromatine remodeling complexen reguleren nucleosomen en DNA bereikbaarheid door het katalyseren van ATP-afhankelijke nucleosoom remodeling. Menselijke INO80 complexen uit 14 eiwitsubeenheden waaronder INO80 een SNF2-achtige ATPase, dat dient als de katalytische subeenheid en de matrix voor montage van de complexen. Functies van de andere subeenheden en de mechanismen waarmee zij een bijdrage leveren aan chromatine remodeling activiteit de INO80 complex blijft slecht begrepen, voor een deel te wijten aan de uitdaging van het genereren van INO80 bouwgroepen in menselijke cellen of heterologe expressie systemen. Deze JOVE protocol beschrijft een procedure die zuivering van menselijke INO80 chromatine hermodellering subcomplexen die ontbreken een subeenheid of een subset van subeenheden mogelijk maakt. N-eindstandig FLAG epitoop-gemerkte cDNA INO80 worden stabiel ingebracht in humane embryonale nier (HEK) 293-cellijnen met Flp-bemiddelde recombinatie. Indien een subset van subeenheden van de INO80 complex is be verwijderd, een expressie plaats INO80 mutante eiwitten die het platform te monteren onderdelen van deze subeenheden missen. In het geval een individu subunit is uitgeput te raken, een transfects siRNA gericht op deze subeenheid in een HEK 293 cellijn stabiel tot expressie FLAG tag INO80 ATPase. Kernextracten worden bereid, en FLAG immunoprecipitaties wordt uitgevoerd om proteïne fracties die INO80 derivaten verrijken. De samenstellingen van gezuiverde INO80 subcomplexen kan vervolgens worden geanalyseerd met methoden zoals immunoblotting, zilverkleuring en massaspectrometrie. De INO80 en INO80 subes gegenereerd volgens dit protocol kan verder worden geanalyseerd middels diverse biochemische assays die worden beschreven in de bijgevoegde JOVE protocol. De hier beschreven werkwijzen kunnen worden aangepast voor onderzoek van de structurele en functionele eigenschappen van elke zoogdierlijke meerdere subeenheden chromatine remodeling en modificerende complexen.

Inleiding

Evolutionair geconserveerd SNF2 familie chromatine remodeling complexen zijn belangrijke regulatoren van chromatine organisatie en toegankelijkheid van DNA ^1. Deze remodeling complexen altijd een centrale SNF2-achtige ATPase subeenheid, die in sommige gevallen, assembleert diverse toe eiwitten en vormt meerdere subeenheden macro-moleculaire assemblages. De moleculaire details van de ATP-afhankelijke chromatine remodeling te bestuderen, is het belangrijk om de bijdrage van bepaalde subsets van subeenheden en / of domein structuren begrijpen activiteiten van de complexen. Dergelijke analyses vereisen de mogelijkheid om zeer gezuiverde mutant complexen die bepaald eiwit subeenheden of domein structuren missen genereren.

Vorige structuur-functie studies van ATP-afhankelijke chromatine hermodellering complexen sterk gericht op de gist modelsysteem vanwege de superieure maakbaarheid van de gist genoom (zie bijvoorbeeld refs ^1-4). Gezien het behoud van desubunit samenstelling en functionaliteit tussen orthologe remodeling complexen, hebben studies van de structuur en functie van gist remodeling complexen belangrijke inzichten in hun tegenhangers in hogere eukaryoten. Toch merkbare soortspecifieke verschillen tussen remodeling complexen bestaan, als gevolg van winst of verlies van soortspecifieke subeenheden, winst of verlies van de soort-specifieke domeinen van geconserveerde subeenheden en sequentievariabiliteit binnen geconserveerde domeinen van geconserveerde subeenheden. Dergelijke verschillen kunnen in principe gedreven door de behoefte aan hogere eukaryote cellen aan te passen aan nieuwe moleculaire en cellulaire omgevingen. Zo begrijpen hoe subeenheden van hogere eukaryote remodeling complexen bijdragen aan het nucleosoom remodeling proces is waardevol, want het werpt niet alleen licht op de basismechanismen van de ATP-afhankelijke chromatine remodeling proces, maar ook kan waardevolle inzichten verschaffen in de mechanismen die chromatine structuur en genexpressie in highaar eukaryoten worden gereguleerd.

Tot nu toe zijn er slechts beperkte structurele en functionele studies van multi-subunit van zoogdieren chromatine remodeling complexen, mede als gevolg van de moeilijkheden bij het verkrijgen van biochemisch gedefinieerd chromatine remodeling complexen en subes. We hebben gedeeltelijk omzeild deze moeilijkheden met de hieronder beschreven procedures, waarbij immunoaffiniteitszuivering wordt gebruikt om intact INO80 of INO80 subcomplexen van humane cellen die stabiel tot expressie N-eindstandig FLAG epitoop-gemerkte wild type of mutante versies van INO80 ^5-7 bereiden (figuur 1) . Om intact INO80 complexen van menselijke cellen te verkrijgen, is Flp-bemiddelde recombinatie wordt gebruikt om transgene HEK293 cellijnen die stabiel FLAG epitoop-gemerkte cDNA's die coderen voor subeenheden van het INO80 complex ^8-10 genereren. Omdat overexpressie van INO80 subeenheden enigszins giftig zijn, is het noodzakelijk te isoleren en klonale cellijnen onder selectieve co handhavennditions stabiele transgene expressie waarborgen tijdens de vele passages nodig zijn voor uitbreiding van grootschalige celkweken. Voor kleinere INO80 subcomplexen dat slechts een subset van subeenheden bevatten verkrijgen, hebben we succes twee methoden (figuur 2A, B). In de eerste genereren we HEK293 Flp-In cellijnen die stabiel mutant versies van INO80 die domeinen voor de interactie met specifieke subeenheden ⁵ ontbreken. Alternatief wordt siRNA-gemedieerde knockdown gebruikt om de gewenste subeenheid van cellen die een geschikt FLAG gelabeld INO80 subeenheid (ongepubliceerde gegevens) afbreken. Tot slot, om het menselijk INO80 complexen te zuiveren, is FLAG agarose gebaseerd chromatografie ¹¹ gebruikt om een-INO80 bevattende fractie een verrijking van nucleaire extracten, waardoor de effectieve vermindering van de aanwezigheid van verontreinigende cytosole eiwitten in de laatste fractie die gezuiverd INO80 of INO80 subes.

Protocol

1 Generatie en Cultuur van HEK293 Stabiel cellijnen die Full Length of Mutant Versies van FLAG epitoopgemerkte INO80 of andere INO80 Complex Subeenheden

1. Clone cDNA dat de volledige lengte of mutant humaan INO80 ATPase of een andere INO80 subeenheid in de zoogdierlijke expressievector pcDNA5 / FRT met een in-frame, N terminale FLAG epitoop tag.
2. Bevestig de sequentie van het ingevoegde cDNA met DNA sequencing voordat.
3. Om de transfectie uit te voeren, groeien Flp-In HEK293 cellen in 10 cm weefselkweekschalen in een medium met DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium), 5% glutamine en 10% FBS (foetaal runderserum).
4. Wanneer cellen bereiken ~ 70% confluentie aan elke weefselcultuurschaal een mengsel van 40 pl FuGENE6 transfectie reagens, 0,5 ug van de geschikte pcDNA5 / FRT expressieplasmide, en 9,5 ug pOG44, waarvan Flp recombinase codeert, in een totaal volume 800 pl.
5. 48 uur later, trypsinize en split cellen bij een verhouding van 1:30 in 10 cm schalen en ze groeien in DMEM met 5% glutamine, 10% FBS, en 100 ug / ml hygromycine B voor 3 - 4 weken. Verander het kweekmedium wanneer het begint te geel (meestal om de 3-5 dagen).
6. Om positieve klonen die het hoogste-FLAG gelabeld eiwit expressie te identificeren, selecteert individuele hygromycine B-resistente kolonies en overbrengen naar een enkel putje van een 24-well plaat.
   1. Wanneer de cellen 80% confluentie bereikt, oogst cellen uit elk putje in ~ 1 ml PBS en pellet door centrifugeren bij 1000 xg gedurende 5 minuten.
   2. Na verwijdering van het supernatant, resuspendeer de celpellet in 60 pl SDS-PAGE monsterbuffer.
   3. Betreft helft van de geresuspendeerde cel pellet aan SDS PAGE en Western blotting om expressie van de FLAG controle hebben lokaas eiwitten; sparen de andere helft voor toekomstige analyses.
7. Als no-FLAG tag menselijk INO80 eiwitten worden aangetroffen in cellysaten, vouwt u de eerste klonen cel populatiesning verder door uitplating cellen uit enkele putjes van een 24-wells plaat in 15 cm weefselkweekschalen.
   1. Om cellen te oogsten vanaf 15 cm schalen, resuspendeer buurt samenvloeiende cellen in ijskoude PBS en overbrengen in een 50 ml conische buis.
   2. Breng een eindvolume van 50 ml door toevoeging van extra PBS.
   3. Pellet cellen bij 1000 g gedurende 5 minuten en verwijder zoveel mogelijk van het supernatant.
   4. Resuspendeer de cel pellet in 1 ml van Lys450 buffer (20 mM HEPES-NaOH pH 7,9, 450 mM NaCl, 0,5% Triton X-100, 10 mM KCl, 4 mM _MgCl2, 0,2 mM EDTA, 10% glycerol, 1 mM DTT, 200 uM PMSF, en 1: 1.000 proteaseremmercocktail).
      OPMERKING: hier en elders, altijd DTT, PMSF, en proteaseremmercocktail toevoegen aan buffers onmiddellijk voor het begin van een experiment.
   5. Immuno-precipitaat FLAG-gemerkte eiwitten van het resulterende totaal cellysaat met 20 pl anti-FLAG agarose gel, en het FLAG eluaten met Western blotting geanalyseerd. [Voor meer details van immunityoprecipitation procedure, zie stap 5]
8. Bereid bevroren voorraden gewenste klonale cellijnen ¹² en bewaar ze in vloeibare stikstof tot gebruik.

2 Groeiende HEK293- cellijnen in Roller Flessen

Bij bereiding op grote schaal van INO80 complexen, cellen in kweek 10 - 20 rolflessen; Een typische opbrengst uit elke rolfles is ~ 1 ml gepakte cellen.

1. Aan elke rolfles, voeg 200 ml DMEM, 5% glutamine en 10% kalfserum, zonder hygromycine B.
2. Breng alle cellen van een bijna samenvloeiende 15 cm schaal in elke rolfles
3. Plaats rolflessen in een 37 ° C incubator rolfles en roteren bij 0,2 rpm.
4. Zodra cellen te bereiken ~ 70% samenvloeiing, giet af en het medium te verwijderen.
5. Voeg ~ 50 ml ijskoude PBS aan elke fles. Houdt flessen horizontaal, draai voorzichtig aan de cel monolaag los.
6. Breng de cellen geresuspendeerd tot 250 ml plastic conische flessen en plaats op ijs.
7. Spoel rolkolven met extra PBS, de overdracht van het sequentieel van fles tot fles. Als spoeling oplossing is niet meer duidelijk is (meestal na gebruik af te spoelen ongeveer 5 flessen), voeg het toe aan de celsuspensie.
8. Pellet cellen door centrifugatie bij 400 xg gedurende 10 minuten.
9. Voorzichtig resuspendeer de cellen in PBS, te combineren tot een enkele 250 ml conische fles, en bewaar op ijs tot verdere verwerking.

3-siRNA gemedieerde Knockdown van INO80 Subeenheden in cellen die ander-FLAG tag INO80 Subunit

Om INO80 subes ontbreekt een enkele subunit verkrijgen, gebruiken FLAG-immuunzuivering naar INO80 complexen van siRNA behandelde cellen of cellen stabiel tot expressie shRNA zuiveren. De "reverse" siRNA (kleine interfererende RNA) transfectieprotocol hier beschreven is geoptimaliseerd voor HEK293 cellen groeien in 15 cm schalen. Het protocol is voor een enkele 15 cm schotel van cellen en shoULD worden opgeschaald derhalve afhankelijk van het aantal cellen nodig. Om biochemisch nuttige hoeveelheden INO80 complexe uit-siRNA behandelde cellen te bereiden, dient men op te schalen naar culturen gegroeid in 40 15 cm schalen; 4 ml gepakte celpellet - dit neemt ongeveer 2 opleveren.

1. Groeien HEK293 cellen die stabiel tot expressie het gewenste subeenheid van de INO80 complex bijna confluentie in 15 cm schalen.
2. Voeg een hoeveelheid van siRNA resuspensie buffer (20 mM KCl, 6 mM HEPES pH 7,5 en 0,2 mM _MgCl2) volstaan ​​om een 50 uM stockoplossing van siRNA een buis met gelyofiliseerd siRNA bereiden. Pipet de oplossing op en neer een paar keer en broeden op een nutator gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur om ervoor te zorgen de siRNA volledig is opgelost.
3. Bereid een transfectie cocktail met siRNA's en transfectiereagens. Meng 10 ul van de 50 uM siRNA stockoplossing met 32 ​​pi Lipofectamine RNAiMAX toevoegen aan 4 ml Opti-MEM Verminderde Serum Medium met zeer voorzichtig mengen; allaag alle reagentia in evenwicht te RT voor gebruik.
4. Incubeer het mengsel bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten.
5. Bereid Flp-in HEK293 cellen die stabiel tot expressie het gewenste INO80 subeenheid voor transfectie.
   1. Tijdens de incubatie van stap 3.4, wassen cellen in de 15 cm schalen eenmaal met PBS RT.
   2. Na het verwijderen PBS behandelen cellen met 1 ml trypsine enkel tot ze beginnen te tillen van de plaat.
   3. Voeg onmiddellijk 10 ml compleet medium (DMEM + 5% glutamine + 10% FBS) cellen getrypsiniseerd en meng voorzichtig. Verzamel cellen door centrifugeren bij 1000 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
   4. Resuspendeer de celpellet in ~ 4 ml compleet medium en tel de cel resuspensie behulp van een hemocytometer.
   5. Verdun cellen met compleet medium tot een concentratie van ~ 5,4 x 10 ⁶ / ml.
6. Aan elk 15 cm schotel, voeg 15 ml compleet kweekmedium, gevolgd door 4 ml transfectie cocktail. Roer voorzichtig tot het medium en transfectie cocktail waarborgen thoroughly gemengd. Tenslotte, voeg een ml celsuspensie en weer schud zachtjes om cellen gelijkmatig te dispergeren.
7. Na 60 uur van de cultuur in een 37 ° C, 5% _CO2 incubator, verwijder voorzichtig medium, resuspendeer cellen in ijskoude PBS, en meteen overgaan tot de nucleaire extracten te bereiden.

4 Voorbereiding van kernextracten

Deze procedure is een modificatie van het protocol van Dignam ¹³ en kunnen worden vergroot of verkleind afhankelijk van de grootte van het starten celpellets. Typisch, 1 ml gepakte celpellet opbrengst 1 ml uiteindelijke nucleair extract. Alle buffers moeten ijskoud en alle stappen worden uitgevoerd in een koude kamer of op ijs indien een geschikte koude kamer is niet beschikbaar.

1. Isolatie van kernen:
   1. Zacht overdracht cellen om een ​​geschikte grootte (15 of 50 ml) studeerde conische buis en centrifugeren bij 1000 xg gedurende 10 min bij 4 ° C.
   2. Verwijder de supernatant en het volume van het gepakte cel pel metenlaten. 1 ml gepakte cellen overeenkomt met ~ 3 x 10 ⁸ HEK293 cellen.
   3. Voeg 5 verpakt celvolumes buffer A (10 mM HEPES, pH 7,9, 1,5 mM _MgCl2, 10 mM KCl en vers toegevoegde 1 mM DTT, 200 uM PMSF, en 1: 1.000 proteaseremmercocktail). Resuspendeer de cel pellet door voorzichtig pipetteren.
   4. Incubeer op ijs gedurende precies 10 minuten.
   5. Pellet de cellen bij 1000 g gedurende 10 min bij 4 ° C en verwijder het supernatant.
   6. De afmeting van de cel pellet moet tijdens incubatie in buffer A. verhoogd tot 2-voudig
   7. Resuspendeer de cellen in twee hematocriet volumina van buffer A, en breng de celsuspensie tot een geschikte afmeting Dounce weefselhomogenisator. Als u met minder dan 2 ml packed cells, gebruik dan een 7 ml homogenisator; voor 2 - 4 ml packed cells, gebruik maken van een 15 ml homogenisator; en voor 10 of meer ml packed cells, gebruik maken van een 40 ml homogenisator.
   8. Homogeniseren van de celsuspensie met de losse glazen stamper van de Dounce homogenisator until 90% van de cellen positief te kleuren met 1% trypan blauw.
   9. De suspensie in een 45 ml high-speed centrifuge buis en draaien bij 25.000 xg gedurende 20 min bij 4 ° C in een JA-17 rotor of dergelijke (zie tabel of Materials / Apparatuur).
   10. Van de nucleaire pellet, de bovenstaande vloeistof, die cytosolische eiwitten of eiwitten die tijdens de fractionering lekken van de kern bevat.
2. Extraheren kernen met zout:
   1. Voeg Buffer C (20 mM HEPES, pH 7,9, 25% glycerol, 1,5 mM _MgCl2, 0,2 mM EDTA, en vers toegevoegde 1 mM DTT, 200 uM PMSF, en 1: 1000 Protease Inhibitor Cocktail) aan de nucleaire pellet; Gebruik 2,5 ml buffer C per 3 ml conferentie hematocriet (~ 1 x 10 ⁹ cellen).
   2. Met behulp van een glasstaaf of een pipet, los nucleaire pellet van de wand van de buis en breng het gehele mengsel een Dounce homogenisator van geschikte grootte.
   3. Resuspendeer de kernen door homogeniseren the mengsel met twee slagen van een losse stamper.
   4. Breng de geresuspendeerd nucleaire fractie in een gekoeld beker. Kies een bekerglas zodat de suspensie de beker vult ten minste 0,5 cm diep.
   5. Nucleaire eiwitten van chromatine of andere onoplosbare structuren extraheren, geleidelijk verhogen van de zoutconcentratie van de suspensie tot 0,42 M NaCl door druppelsgewijze toevoeging van 5 M NaCl onder zacht roeren van de suspensie met een pipet of glazen staafje op ijs; Zodra alle 5 M NaCl werd toegevoegd, dient de oplossing zeer viskeus of gelachtig worden. Bereken het volume van 5 M NaCl nodig oplossing tot een eindconcentratie van 0,42 M NaCl met de volgende formule te brengen:
      
   6. Breng zorgvuldig de viskeuze suspensie over in 10 ml polycarbonaat buizen voor een Type 70.1 Ti rotor (of gelijkwaardig) of 70 ml polycarbonaat flessen voor een Type 45 Ti or soortgelijke rotor (zie tabel van materialen / apparatuur). Goed af met parafilm bij gebruik van 10 ml buizen of met dop montage bij gebruik van 70 ml flesjes.
   7. Langzaam rock de afgesloten buizen bij 4 ° C gedurende 30 min met een nutator.
   8. Spin de monsters in een type 45 Ti of 70.1 Ti rotor gedurende 30 min bij 120.000 xg bij 4 ° C.
   9. Breng de bovenstaande om een ​​plastic buis of fles. Dit bovenstaande is de nucleaire extract, en de pellet bevat chromatine en andere nucleaire afval.
   10. Verdeel de kernextract in handig formaat porties, invriezen in vloeibare stikstof, en op te slaan bij -80 ° C.

5 immunoaffiniteitszuivering van de Human INO80 of INO80 subes

1. Op bevroren kernextract ontdooien, plaats buisjes met het extract van de stationaire of rol buizen tussen de handen totdat het bevroren materiaal wordt een slurry. Plaats dan de buizen op ijs of in de koude kamer tot het extract is volledig thawed.
2. Breng de ontdooide nucleair extract tot 10 ml polycarbonaat ultracentrifuge buizen en rotatie bij 100.000 xg gedurende 20 min bij 4 ° C in een Type 70.1 Ti rotor of gelijk aan een neerslag dat tijdens de vorst-dooi cyclus kunnen gevormd hebben.
3. Breng de supernatant een 15 ml conische buis. Voeg verse DTT, PMSF, en proteaseremmercocktail tot de uiteindelijke concentratie van 1 mM DTT, 200 uM PMSF, en 1: 1.000 proteaseremmercocktail.
4. Om anti-FLAG agarose bereiden voor immunozuivering overdragen 200 ul van 50% suspensie van anti-FLAG agarose kralen om een ​​1,5 ml microcentrifugebuis met een P200 of dergelijke met een pipet tip waarvan de punt afgesneden met een schone scalpel of scheermesje.
5. Pellet de korrels door centrifugeren in een microcentrifuge benchtop bij 8000 xg gedurende 30 sec. Verwijder de supernatant en was de kralen door resuspenderen van de korrels in 1 ml buffer Lys450 en pellet de korrels bij 8000 xg gedurende 30 sec. Was de beads nog twee keer.
6. Resuspendeer de gewassen anti-FLAG agarose in 100 pl van nucleair extract met een P200 of dergelijke regelbaar volume pipet met een punt waarvan de punt afgesneden met een schone scalpel of scheermesje en met dezelfde tip, overdracht de geresuspendeerde kralen om de 15 ml conische buis met het extract. Herhaal dit een paar keer totdat alle kralen zijn overgedragen aan de buis van 15 ml.
7. Incubeer het extract / kraal mengsel gedurende 4 uur bij 4 ° C onder langzame rotatie op laboratoriumschaal rotator. OPTIONEEL: Inclusief Benzonase bij een concentratie van 25 eenheden / ml te verwijderen verontreinigend DNA.
8. Verzamel de FLAG agarose door centrifugatie bij 1000 g gedurende 5 min bij 4 ° C.
9. Resuspendeer in 10 ml Lys450 te wassen, incubeer 5 min bij 4 ° C onder zacht schommelen op een nutator. Pellet de kralen aan 1000 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C.
10. Resuspendeer in 100 - 150 ul Lys450 en overdracht kralen aan een 1,5 ml microcentrifugebuis. Continue aan de 15 ml conische buis met spoelen 100 - 150 gl Lys450 totdat alle korrels zijn overgedragen aan de microcentrifugebuis.
11. Spin down de kralen bij 8000 xg gedurende 30 seconden bij 4 ° C in een microcentrifuge. Was drie keer met 1 ml Lys450 en eenmaal met 1 ml EB100 buffer (10 mM HEPES pH 7,9, 10% glycerol, 100 mM NaCl, 1,5 mM _MgCl2, 0,05% Triton X-100, en vers toegevoegde 1 mM DTT, 200 uM PMSF , en 1: 1.000 proteaseremmercocktail).
12. Om gebonden eiwitten elueren, voeg 200 ul EB100 buffer die 0,25 mg / ml 1x FLAG-peptide. Incubeer 30 min bij elke 4 ° C op een nutator.
13. Pellet de beads bij 8000 xg gedurende 30 seconden bij 4 ° C in een microcentrifuge. Breng de bovenstaande, die de geëlueerd INO80 complex bevat, om een ​​frisse microcentrifugebuisje.
14. Herhaal de elutie nog vier keer, en bundelen alle bovenstaande vloeistoffen in een enkele buis.
15. Om het resterende FLAG-agaroseparels van de geëlueerde eiwit fractie te verwijderen,langs het eluaat door een leeg spinkolom.
16. Concentreer de geëlueerde eiwitfractie ~ 10-voudig met een dun centrifugale filterinrichting (50.000 molecuulgewicht cutoff).
17. Om de FLAG-peptide te verwijderen, passeren de geconcentreerde eiwit fractie achtereenvolgens door twee ontzouten kolommen.
18. Verdeel het gezuiverde ontzoute eiwitfractie in 20 ul aliquots ingevroren in vloeibare stikstof en bewaard bij -80 ° C.
19. Analyseer de subunit samenstelling van INO80 of INO80 subes op-zilver gekleurde gels of door western blotting, en schatten de concentraties door semi-kwantitatieve western blotting het gebruik van preparaten van recombinant INO80 subeenheden van bekende concentratie als standaarden.

Resultaten

Figuur 1 toont een stroomdiagram overzicht van de procedures die voor productie, zuiveren en karakteriseren menselijke INO80 ATP-afhankelijke chromatine hermodellering complexen.

Zoals weergegeven in figuren 2 en 3, deze procedures kan de generatie van zowel wildtype INO80 en INO80 subes dat verschillende eiwitten missen, waardoor het mogelijk verdere biochemische analyse van de bijdrage van deze ontbrekende subeenheden enzymatische activite...

Discussie

Structurele en functionele studies van multi-subunit van zoogdieren chromatine remodeling complexen van hogere eukaryoten werden gehinderd door de moeilijkheid van de voorbereiding van biochemisch nuttige hoeveelheden van dergelijke complexen met mutant subeenheden of ontbreken bepaalde subeenheden helemaal. Er zijn een aantal technische hindernissen Enerzijds, is genetische manipulatie in zoogdiercellen technisch ingewikkeld en tijdrovend geweest. Unlike gistcellen, waarvan het genoom kan gemakkelijk worden bewerkt en ...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Cellgro	10-013-CV
Glutamax-I (stablized glutamine)	Life Technologies	35050-079
Fetal Bovine Serum	SAFC	12176C
FuGENE6 transfection reagent	Promega	E2312
Hygromycin B, steriel in PBS	AG Scientific	H-1012-PBS
pcDNA5/FRT vector	Life Technologies	V6010-20
Flp-In HEK293 cells	Life Technologies	R780-07
pOG44 Flp-Recombinase Expressie Vector	Life Technologies	V600520
EZview Red ANTI-FLAG M2 Affinity Gel	Sigma	F2426
kalfserum	SAFC	12138C
TARGETplus SMARTsiRNA pool	Dharmacon / Thermo Scientific	various
5x siRNA resuspensiebuffer	Dharmacon / Thermo Scientific	#B-002000-UB-100
Lipofectamine RNAiMAX	Life Technologies	13778
Opti-MEM Reduced Serum Medium	Life Technologies	51985-091
PBS	Cellgro	45000	VWR
TrypLE (trypsine)	Life Technologies	12604
1x FLAG Peptide	Sigma	F3290
Micro Bio-Spin Chromatografiekolom	Bio-Rad	737-5021
Amicon Ultra Centrifugal Filter Device (50k MWCO)	Amicon	UFC805024	Fisher Scientific
Zeba Desalting Columns	Thermo Scientific	89882
Anti-FLAG M2 antilichaam, muis	Sigma	F3165
Anti-FLAG M2 antilichaam, konijn	Sigma	F7425
Protease Inhibitor Cocktail	Sigma	P8340
benzonase	Novagen	70664
Apparatuur
JS-4.2 rotor in een J6 centrifuge	Beckman-Coulter	339080
JA-17 rotor	Beckman-Coulter	369691
10 ml polycarbonaat buizen	Beckman-Coulter	355630
70 ml polycarbonaat flessen	Beckman-Coulter	355655
Type 45 Ti rotor	Beckman-Coulter	339160
Type 70.1 Ti rotor	Beckman-Coulter	342184
BD Clay Adams Nutator Mixer	BD Diagnostics	15172-203	VWR
Glas-Col Tube/Vial Rotator	Glas-Col	099A RD4512
PCR thermische cycler PTC 200	MJ Research	PTC 200
roller bottle incubator	Bellco biotechnology	353348
Immobilon-FL Transfer Membraan 7 x 8.4	Millipore	IPFL07810
gesmeerde 1,5 ml microcentrifugebuizen	Costar	3207