Biochemische assays voor het analyseren van activiteiten van de ATP-afhankelijke chromatine remodeling Enzymen

Samenvatting

Hier beschrijven we biochemische analyses die kunnen worden gebruikt om ATP-afhankelijke chromatine-hermodelleringsenzymen te karakteriseren op hun vermogen om 1) ATP-afhankelijk nucleosoomglijden te katalyseren, 2) te interageren met nucleosoomsubstraten en 3) ATP te hydrolyseren op een nucleosoom- of DNA-afhankelijke manier.

Samenvatting

Leden van de SNF2-familie van ATPasen functioneren vaak als onderdelen van multi-subunit chromatine-opnieuw vormende complexen die nucleosoomdynamiek en DNA-toegankelijkheid reguleren door ATP-afhankelijke nucleosoomopnieuwvorming te katalyseren. Biochemisch onderzoek naar de bijdragen van individuele subeenheden van dergelijke complexen aan de meervoudige ATP-afhankelijke chromatine-opnieuw vormingsreactie vereist het gebruik van assays die de productie van reactieproducten monitoren en de vorming van reactie-intermediaten meten. Dit JOVE-protocol beschrijft assays die het mogelijk maken om de biochemische activiteiten van chromatine-opnieuw vormende complexen of subcomplexen met verschillende combinaties van subeenheden te meten. Chromatine-opnieuw vorming wordt gemeten met behulp van een ATP-afhankelijke nucleosoomverschuivingsassay, die de beweging van een nucleosoom op een DNA-molecuul volgt met behulp van een op EMSA gebaseerde methode. De nucleosoombindende activiteit wordt gemeten door de vorming van hermodelleringscomplex-gebonden mononucleosomen te volgen met behulp van een vergelijkbare EMSA-gebaseerde methode, en DNA- of nucleosoomafhankelijke ATPase-activiteit wordt getest met behulp van dunne-laagchromatografie (TLC) om de snelheid van conversie van ATP naar ADP en fosfaat te meten in aanwezigheid van DNA of nucleosomen. Met behulp van deze assays kan men de functies van subeenheden van een chromatine-opnieuw vormend complex onderzoeken door de activiteiten van het complete complex te vergelijken met die welke een of meer subeenheden missen. Het menselijke INO80 chromatine-opnieuw vormende complex wordt als voorbeeld gebruikt; de hier beschreven methoden kunnen echter worden aangepast voor het onderzoek naar andere chromatine-opnieuw vormende complexen.

Inleiding

SNF2 familie chromatine remodeling complexen zijn voorzien van een centrale SNF2-achtige ATPase subunit ^1,2. Sommige SNF2-achtige ATPases functie enkelvoudige subeenheid enzymen, terwijl anderen werken als katalytische subeenheid grotere multi-subunit complexen. Ophelderen van de moleculaire mechanismen die voor elk van de subeenheden van chromatine remodeling complexen bijdragen aan hun activiteiten vereist het vermogen om biochemische testen die de verbouwing proces ontleden voeren.

ATP-afhankelijke nucleosoom remodeling door de menselijke INO80 complex en andere chromatine hermodellering enzymen kunnen worden voorgesteld als een meerstaps proces dat begint met binding van het enzym remodeling nucleosomen, gevolgd door activering van de DNA en / of nucleosoom-afhankelijke ATPase, translocatie van de verbouwing enzym op nucleosomale DNA, en de eventuele herpositionering van nucleosomen ^1,2. Inzicht in de moleculaire details van de ATP-afhankelijke chromatine remodeling proces requires dissectie van de verbouwing reactie in zijn individuele stappen en definitie van de bijdragen van de individuele colli van het chromatine remodeling complex om elke stap van de reactie. Dergelijke analyses vereisen het vermogen om nucleosoom remodeling en andere activiteiten geanalyseerd middels gedefinieerde moleculaire substraten in vitro.

In een eerdere JOVE protocol, beschreven we procedures gebruikt om INO80 chromatine remodeling complexen en subes met gedefinieerde subunit composities ³ te genereren. Hier presenteren we drie biochemische assays die kwantitatieve analyse van de nucleosoom binden, DNA en nucleosoom-geactiveerde ATPase en nucleosoom remodeling activiteiten die bij dergelijke complexen mogelijk.

Protocol

1 ATP-afhankelijke Nucleosome Remodeling Testen

Meten ATP-afhankelijke nucleosoom remodeling activiteiten, immuungezuiverd INO80 of INO80 subcomplexen geïncubeerd met ATP en mononucleosomal substraat, waarbij een enkele nucleosoom geplaatst aan een uiteinde van een 216-bp ^32P-gemerkte DNA-fragment bevat. De reactieproducten worden vervolgens onderworpen aan elektroforese in natieve poly-acrylamide gels.

1. De ^32-P gemerkt, '601' DNA fragment genereren amplificeren van ^pGEM-3Z-4 601 a 216 bp DNA fragment dat een einde 601 gelegen nucleosoom positionering volgorde met de oligonucleotiden 5'-ACAGGATGTATATATCTGACACGTGCCTGG en 5'-als AATACTCAAGCTTGGATGCCTGCAG forward en reverse primers.
   1. Stel een 100 ui PCR-reactie zoals beschreven in Tabel 1.
   2. Voer de PCR-reacties in een thermische cycler met het volgende programma: 1 min bij 96 ° C, followed door 45 sec bij 94 ° C, 30 seconden bij 57 ° C, 60 seconden bij 72 ° C gedurende 30 cycli; eindigend met 7 min bij 72 ° C.
   3. Nadat de PCR reactie is voltooid, verwijdert de niet opgenomen nucleotiden door het passeren van de reactieproducten tweemaal door nuclease-vrij spinkolommen.
   4. Run 5 ui van het gezuiverde PCR product in een 1,2% agarose gel om te bevestigen dat het PCR reactie gegenereerde het gewenste ~ 216 bp DNA fragment.
   5. Verdun 5 ui van het gezuiverde PCR product 20-voudig, en meet de DNA-concentratie met een UV spectrofotometer. De gemiddelde opbrengst is ~ 40 ng / ul.
   6. Meet de radioactiviteit van 1 pl van het gezuiverde PCR product in een scintillatieteller. Schat de labelingsefficiëntie door het berekenen van de cpm / ng. Een succesvolle labeling reactie wordt verwacht ~ 15.000 cpm / ng 601 DNA fragment verkregen.
2. Transfer Hela cel nucleosomen op het label 601 DNA met behulp van een seriële verdunning methode ^5.
   1. Meng 2 pmol^32p gemerkte DNA-fragment met 601 6 ug Hela nucleosomen (bereid zoals beschreven ⁵⁾ in 50 ul van een buffer die 1,0 M NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA, 0,1 mM PMSF, en 1 mM DTT en incubeer bij 30 ° C gedurende 30 minuten.
   2. Opeenvolgend verdun het mengsel tot 0,8 M, 0,6 M en 0,4 M NaCl door verdunning met 12,5 ul, 20,8 pl en 41,6 pl van respectievelijk 10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 1 mM EDTA, 0,1 mM PMSF, en 1 mM DTT, met een 30 min incubatie bij 30 ° C na elke verdunning.
   3. Verdun het mengsel tot 0,2 M en 0,1 M NaCl door toevoeging van 125 ul en 250 ul van dezelfde buffer die 0,1% Nonidet P-40, 20% glycerol en 200 ug / ml BSA, met een 30 minuten incubatie bij 30 ° C tussen de laatste twee verdunningen. Bewaar de mononucleosome substraat bij 4 ° C gedurende maximaal 3 maanden.
3. Voer ATP-afhankelijke nucleosoom glijden reacties in een totaal volume van 10 pl. De reaction bestanddelen worden vermeld in tabel 2. Aangezien de optimale NaCl concentratie INO80 nucleosoom remodeling activiteit ~ 50 mM NaCl (ongepubliceerde resultaten), passen de totale concentratie van NaCl in elke reactie tot 50 mM, met inachtneming van de hoeveelheid NaCl in bereidingen van nucleosomen en enzym.
   1. Voordat u begint met het opzetten van de assays, gegoten inheemse poly-acrylamide gels (18 x 16 cm). Om een gel dat 5% acrylamide bereiden (acrylamide: bisacrylamide 37,5: 1), 0,5 x TBE (45 mM Tris boraat, 1 mM EDTA), 0,01% ammoniumpersulfaat (APS) en 0,001% N, N, N', N'-tetramethylethyleendiamine (TEMED) en meng het in tabel 3 vermelde bestanddelen. Laat de gel polymeriseren ten minste 2 uur bij kamertemperatuur.
   2. Ondertussen, voor elke reactie uit te voeren combineren in een vooraf gekoelde silicium 1,5 ml microcentrifugebuis ~ 20 nM INO80 of INO80 subcomplex (bereid zoals beschreven ³⁾ met een hoeveelheid EB100 buffer ( Tabel 4) voldoende om een volume van 4,75 pl geven. Onmiddellijk opnieuw bevriezen eventuele resterende-INO80 bevattende fracties in poedervorm droogijs of vloeibare stikstof.
   3. Stel een meester cocktail met de rest van de ingrediënten, opschaling een factor X (waarbij X = aantal reacties +3). De hoeveelheid van elk die nodig is voor een 10 gl reactiemengsel ingrediënt wordt in tabel 5; het recept worden opgeschaald volgens het aantal reacties te voeren. Meng goed door de buis te tikken of door op en neer pipetteren met een Pipetman en draai de buis gedurende een paar seconden in een microcentrifuge benchtop.
   4. Doseer 5.25 gl van de master cocktail aan elk van de reageerbuizen tijdens stap 1.3.2. Meng goed door en neer te pipetteren. Start de reactie door overdracht reactiebuizen een 30 ° C verwarmingsblok of waterbad en incubeer gedurende 2 uur.
   5. Ondertussen bereiden 'verwijderen mix' cocktail met concurrent DNAen nucleosomen, opschaling met een factor X (X = aantal reacties + 4). De hoeveelheid van elk die nodig is om 1,5 gl verwijderen mix voor een enkele reactie bereiden ingrediënt in Tabel 6; het recept worden opgeschaald afhankelijk van het aantal tests worden uitgevoerd.
   6. Beëindig reacties door 1,5 pi van het mengsel te verwijderen. Meng goed, spin down en incubeer bij 30 ° C nog eens 30 minuten.
   7. Ondertussen voorlooptijd het natieve polyacrylamidegel in een verticale elektroforese-eenheid bij 100 V gedurende 30 minuten bij 4 ° C, met 0,5 x TBE als loopbuffer met een magnetische roerstaaf in de onderste kamer constant buffer omloop gegarandeerd.
   8. Om het monster te laden, voeg 2,5 pl ladingskleurstof met 3x TBE, 30% glycerol, 0,25% broomfenolblauw en 0,25% xyleencyanol FF. Meng goed, kort draaien de monsters, en laden op de gel met behulp van tips voor het laden.
   9. Voer de elektroforese bij 200 V gedurende 4,5 uur bij 4 ° C met buffer circulatie.
   10. Om het detecteren, breng de gel Stapels twee vellen filtreerpapier. Wikkel het filter papier met de gel op de top met behulp van duidelijke plastic omslag, en vervolgens bloot aan een opslag fosfor scherm bij 4 ° C voor de gewenste tijd.
   11. Scan het scherm met een isotoop afbeeldingsscanner systeem en het analyseren met geschikte software.

2 Mononucleosome bindingstests

De bindingsaffiniteit van een bepaalde INO80 complex voor mononucleosomes assay Voer een elektroforetische mobiliteit Shift Assay (EMSA) met de mononucleosomal substraat gegenereerd in stap 1.2.

1. Opzetten van de reactie mixen voor bindingsbepalingen zoals beschreven voor nucleosoom remodeling assays maar laat de ATP en het verwijderen mix van de reacties; incubeer bij 30 ° C gedurende 30 minuten.
2. Voeg 2,5 ul van laadkleurstof aan elk reactiemengsel, en gelden voor een native polyacrylamide gel met 3,5% acrylamide (acrylamide: bis 37,5: 1), 1% glycerol, 0.5x TBE, 0.01% APS en 0,001% TEMED.
3. Met 0.5x TBE als loopbuffer, voert de gel bij 200 V gedurende 2,5 uur bij 4 ° C met buffer circulatie en blootstellen aan een opslag fosforscherm.

3 DNA en Nucleosome-afhankelijke ATPase Assays

Voer ATPase assays 5 pl reactiemengsels bevatten 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 60 mM NaCl, 6,6 mM _MgCl2, 0,8 mM EDTA, 0,015% Nonidet P-40, 2,5% glycerol, 0,1 mg / ml BSA, 1 mM DTT, 0,1 mM PMSF, 2 mM ATP, 2 pCi [α- ³² P] ATP (3000 Ci / mmol). Per INO80 complex of hoeveelheid INO80 complex te testen opgezet drie parallelle reacties, een met EB100 buffer om DNA of nucleosoom-onafhankelijke ATPase, een meet bevattende gesloten circulair plasmide-DNA (5.000 bp, ~ 30 nM) te meten DNA afhankelijke ATPase en een met Hela oligonucleosomen (~ 185 nM) voor nucleosoom-afhankelijke ATPase meten. Stel alle reacties op het ijs.

1. Voor elke reactie samen 10-50 nM van de immuungezuiverd INO80 of INO80 subcomplexen met een hoeveelheid EB100 buffer voldoende om een ​​volume van 2,2 pl geven voorgekoeld gesmeerd 1,5 ml microcentrifuge buisjes. Onmiddellijk opnieuw te bevriezen elke-INO80 bevattende fracties in poedervorm droogijs of vloeibare stikstof.
2. Het opzetten van een master-cocktail. De hoeveelheid van elk die nodig is voor een enkele reactie ingrediënt wordt in tabel 7. Opwaardering het recept door grotere met een factor 3 (X +2) 1, waarin X = het aantal INO80 preparaten te testen.
3. Voor te bereiden 'sub-cocktails' met buffer alleen, DNA, of nucleosomen, afzien 2,5 (X + 2) ul van de master cocktail in drie aparte buizen. Voeg 0,3 (X + 2) pi hetzij EB100, gesloten circulair plasmide-DNA (1,5 ug / ul) of Hela oligonucleosomen (1,5 ug / ul) en meng.
4. Doseer 2,8 pi van de juiste sub-cocktail naar de enzymbevattende reactiebuizen opgericht in step 3.1. Voorzichtig pipet op en neer om te mengen; voorkomen dat er bubbels.
5. Om reacties te beginnen, de overdracht van de reageerbuisjes op een 30 ° C warmte-blok.
6. Na 5, 15, 30 en 60 min incubatie spot 0,5 pi van elk reactiemengsel op een cellulose polyethyleenimine dunnelaagchromatografie (TLC) plaat (20 x 10 cm) in een rechte lijn ten minste 1,5 cm van de onderkant . Onmiddellijk terug reageerbuisjes tot 30 ° C warmteblok dus verschillende tijdstippen kan worden genomen van een enkele buis. Na het spotten, droog de TLC-platen met behulp van een föhn.
7. Breng de TLC platen met een glazen kamer die voldoende 0,375 M kaliumfosfaat (pH 3,5) zodat de bodem van 0,5 cm van de TLC-plaat wordt ondergedompeld in de oplossing.
8. Bedek de kamer en ontwikkelen tot de voorzijde van de vloeibare fase de top van de TLC-platen bereikt. Onmiddellijke droog de platen grondig met behulp van een föhn.
9. Maak de gedroogde TLC platen een fosforscherm opslag bij kamertemperatuur.Scan het scherm met een isotoop afbeeldingsscanner systeem bepalen de hoeveelheid radioactief ATP substraat en ADP product.
10. Om de hoeveelheid ATP gehydrolyseerd Vermenigvuldig het% ATP gehydrolyseerd door de hoeveelheid ATP in het uitgangsmateriaal aanwezige reactiemengsel met de volgende formule: pmol ATP gehydrolyseerd = 10 pmol ATP in conferentie reactiemengsel x [ADP / (ADP + ATP)]

Resultaten

De figuren tonen representatieve resultaten van biochemische assays gebruikt INO80 activiteiten te karakteriseren, zoals nucleosoom schuiven (figuur 1) en binding (figuur 2) assays en DNA of nucleosoom-afhankelijke ATPase tests (figuur 3).

De in figuur 1 experiment vergelijkt het vermogen van intacte INO80 complexen gezuiverd door FLAG-Ies2 of FLAG-INO80E en INO80 subes gezuiverd door hetzij FLAG-Ino80ΔN of Ino80ΔNΔHSA verbo...

Discussie

Om nucleosoom remodeling en ATPase activiteiten we waarnemen in assays afhankelijk van de katalytische activiteit van INO80 complexen, en niet op contaminerende remodeling en / of ATPase enzymen, we routinematig assay nucleosoom remodeling en ATPase activiteit van katalytisch inactieve versies INO80 complexen, gezuiverd parallel met wildtype INO80 volgens dezelfde procedure. Een negatieve controle reactie ontbreekt ATP moet worden uitgevoerd als het testen nucleosoom remodeling activiteit te testen op de aanwezigheid va...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Protease Inhibitor Cocktail	Sigma	P8340
10x PCR reaction buffer	Roche Applied Science	11435094001
Roche Taq DNA Polymerase	Roche Applied Science	11435094001
NucAway Nuclease-free Spin Columns	Ambion	Cat. # AM10070
ultrapure ATP	USB/Affymetrix	77241 25 UM
bovine serum albumin	Sigma	A9418
40% Acrylamide/Bis 37.5:1	Amresco	0254-500ML
Sonicated salmon sperm DNAs	GE Healthcare	27-4565-01
10% ammonium persulfate (APS)	Thermo Scientific	17874
benzonase	Novagen	Cat. No. 70664
dCTP, [α-32P]- 6,000 Ci/mmol	PerkinElmer	BLU013Z250UC
PCR thermal cycler PTC 200	MJ Research	PTC 200
Hoefer vertical electrophoresis unit	Hoefer	SE600X-15-1.5
lubricated 1.5 ml microcentrifuge tubes	Costar	3207
Storage Phosphor Screen	Molecular Dynamics	63-0034-79
3MM filter paper	Whatman	28458-005	VWR
Typhoon PhosphorImager	GE Healthcare	8600
ImageQuant software	GE Healthcare	ver2003.02
TLC Glass Plates, PEI-Cellulose F	Millipore	5725-7
Immobilon-FL Transfer Membrane 7 x 8.4	Millipore	IPFL07810
General purpose survey meter with end-window or pancake GM (Geiger-Mueller) probe	Biodex	Model 14C